吡嗪酰胺對小鼠腸道微生物的影響

姜明照，繆志敏，趙瑩瑩，賴 泳

（大理大學藥學院，云南大理 671000）

吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）是合成的煙酰胺的類似物，吡嗪酰胺對結(jié)核分枝桿菌具有高度選擇性，是結(jié)核病一線治療方案中的關鍵藥物〔1〕。大量臨床試驗證明吡嗪酰胺對結(jié)核分枝桿菌繁殖和生長有顯著抑制作用，可將結(jié)核病治療所需時間縮短3 個月〔2〕。然而，吡嗪酰胺長期大劑量用藥往往會導致許多不良反應的發(fā)生，如肝臟毒性、關節(jié)疼痛、過敏、胃腸道反應等〔3〕。

腸道菌群在人體健康中的作用十分重要，與營養(yǎng)吸收及代謝、免疫系統(tǒng)維護息息相關。唐外姣等〔4〕研究表明，腸道菌群失調(diào)和多樣性下降，引起肝細胞脂質(zhì)蓄積和肝毒性。此外，陳竹等〔5〕研究表明，結(jié)核分枝桿菌感染會引起腸道菌群改變，增加機體對結(jié)核分枝桿菌的易感性，而吡嗪酰胺作為抗結(jié)核藥，可以緩解腸道菌群失調(diào)。這表明腸道菌群和藥物療效、不良反應有關。

近幾年，腸道菌群與結(jié)核病之間的關系受到了較多的關注，雖然吡嗪酰胺治療結(jié)核分枝桿菌感染有較好的效果，但對腸道菌群的影響尚不清楚，目前未見關于吡嗪酰胺調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群作用的研究。本實驗主要研究吡嗪酰胺對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、組成和代謝功能產(chǎn)生的作用，探討吡嗪酰胺對腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用，為抗結(jié)核藥物吡嗪酰胺的合理使用提供參考。

1 材料和儀器

吡嗪酰胺（成都錦華藥業(yè)有限責任公司，批號：H51020877）；糞便基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：DP328）；Quant-iT?PicoGreen? dsDNA Assay Kit（德 國Calbiochem 公司，批號：P7589）。

雄性昆明種小鼠，4～6 周，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2014-0011。

NanoDrop 2000 紫外可見分光光度計（美國Thermofisher 公司）；GeneAmp2720 型PCR擴增儀（美國ABI公司）；FLx800 Microplate reader 定量儀器（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 給藥方案將吡嗪酰胺溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）中，超聲振蕩后備用。動物適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為3 組，每組10 只：①溶劑對照組（Z），該組小鼠均灌喂等量0.5% CMC-Na；②吡嗪酰胺低劑量組（P15），該組小鼠灌喂吡嗪酰胺15 mg∕（kg·d）；③吡嗪酰胺高劑量組（P30），該組小鼠灌喂吡嗪酰胺30 mg∕（kg·d）。3 組小鼠每天灌喂一次，持續(xù)14 d。

2.2 小鼠糞便的采集小鼠糞便的采集采用壓迫法，首先固定小鼠，將其尾部提起，用手指輕輕按壓小鼠下腹部，收集新鮮糞便于對應的無菌EP 管中，每管分裝2～3 顆，避免污染，收集的糞便樣本于-80 ℃保存。

2.3 16S rRNA 高通量測序按照糞便基因組DNA提取試劑盒操作說明，提取各組小鼠糞便樣品中微生物總DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性。以能夠反映菌群組成和多樣性的目標序列為靶點并添加帶有條形碼特異性的正向引物（5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′）和 反 向 引 物（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）作為擴增引物，對細菌16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)進行PCR 擴增，并將擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測和磁珠純化回收。利用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 進行建庫，并利用Miseq平臺對文庫進行高通量測序。

2.4 生物信息學分析使用FLASH 1.2.7軟件進行原始測序數(shù)據(jù)的篩選及質(zhì)量控制，按97%的序列相似度進行歸并和運算分類單位（OTU）劃分，通過分析體現(xiàn)群落豐富度Chao1指數(shù)以及體現(xiàn)群落均勻度的Shannon多樣性指數(shù)，進行樣本群落Alpha多樣性分析；采用QIIME 1.8.0 軟件，獲得每個樣品在門和屬分類水平上的組成和豐度分布表；利用Mothur 1.18.0 軟件，調(diào)用Metastats 統(tǒng)計學算法，比較門和屬水平的各個分類單元在組之間的豐度差異，Beta 多樣性分析將原始的高維數(shù)據(jù)（如菌群OTU 豐度矩陣）通過線性變換組合，投影到維度較低的空間坐標系，通過R 3.6.1 軟件，對屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進行主成分分析（PCA），并且以二維圖像描述樣本間的自然分布特征，從而量化樣本間的差異和相似度。根據(jù)已知的微生物基因組數(shù)據(jù)，對菌群組成的測序數(shù)據(jù)（16S rRNA 基因的測序結(jié)果）進行菌群代謝功能的預測。

2.5 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 OTU 劃分及分類以97%相似度的標準聚類，得到3 370 個OTU，其中吡嗪酰胺低劑量組、吡嗪酰胺高劑量組和溶劑對照組獨有的數(shù)目分別為708、315、1 434，3個組共有的OTU數(shù)目為282個。見圖1。

圖1 P30-P15-Z韋恩圖

3.2 吡嗪酰胺對小鼠腸道微生物群Alpha 多樣性的影響Alpha 多樣性實驗結(jié)果分析見圖2。吡嗪酰胺低劑量組和高劑量組Chao1指數(shù)分別是溶劑對照組的73%（P＜0.05）和51%（P＜0.01）；吡嗪酰胺低劑量組和高劑量組Shannon 多樣性指數(shù)分別是溶劑對照組的94%和81%（P＜0.05）。

圖2 吡嗪酰胺對小鼠腸道微生物群Alpha多樣性的影響

3.3 不同分類水平的微生物類群統(tǒng)計及吡嗪酰胺對腸道菌群組成差異分析對所有OTU 進行物種歸類，3 個組在門水平上均以擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，吡嗪酰胺低劑量組菌群中所占比例依次為47.02%、51.46%；在吡嗪酰胺高劑量組菌群中所占比例依次為56.24%、41.65%；在溶劑對照組菌群中所占比例依次為76.14%、20.83%。屬水平上吡嗪酰胺低劑量組以擬桿菌屬、顫螺旋菌屬為主要菌群，所占比例依次為8.42%、1.41%；吡嗪酰胺高劑量組以乳桿菌屬、Odoribacter、擬桿菌屬為主要菌群，所占比例依次為2.74%、1.20%、1.14%；溶劑對照組以普雷沃菌屬、雙歧桿菌屬為主要菌群，所占比例依次為3.54%、1.81%。見表1～2。

表1 各組優(yōu)勢菌群在門水平上的分布（%）

表2 各組優(yōu)勢菌群在屬水平上的分布（%）

吡嗪酰胺低劑量組和高劑量組擬桿菌門豐度與溶劑對照組相比顯著下降（60%和73%）。吡嗪酰胺低劑量組和高劑量組厚壁菌門豐度與溶劑對照組相比顯著上升（2.55倍和2.05倍）。見圖3。

圖3 吡嗪酰胺在門水平對腸道菌群組成的影響

3.4 兩組間分類組成的差異分析運用Metastats統(tǒng)計學方法對門和屬水平的各個分類單元在兩組之間的序列量差異進行兩兩比較。在門和屬水平各發(fā)現(xiàn)有顯著差異的分類單元個數(shù)為5、22 個。進一步對各分類單元在各樣本（組）內(nèi)的豐度分布進行研究，并分析上述顯著性差異分析結(jié)果。見表3。結(jié)果表明擬桿菌屬和雙歧桿菌屬等豐度分布存在顯著差異。見圖4。

表3 樣本（組）之間的Metastats兩兩比較檢驗結(jié)果統(tǒng)計表

圖4 樣本（組）間差異最顯著的前20個分類單元的豐度分布圖

3.5 吡嗪酰胺對小鼠腸道微生物群Beta 多樣性的影響采用PCA 方法對群落數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進行自然分解并通過對樣本排序，從而觀察樣本之間的差異。見圖5。以PC1 為標準，吡嗪酰胺低劑量組和高劑量組腸道菌群結(jié)構(gòu)無明顯差異，但與溶劑對照組相比，腸道菌群結(jié)構(gòu)有顯著性變化。

圖5 吡嗪酰胺對小鼠腸道微生物群Beta多樣性的影響

3.6 吡嗪酰胺對腸道菌群代謝功能的影響吡嗪酰胺低劑量組和高劑量組氨基酸代謝、能量代謝和多糖代謝顯著降低，分別是溶劑對照組的60%（P＜0.01）和64%（P＜0.01）、67%（P＜0.05）和73%（P＜0.05）、78%（P＜0.05）和84%。見圖6。

4 討論

腸道中微生物的變化與糞便菌群的構(gòu)成密切相關，糞便菌群變化可反映腸道菌群的狀態(tài)〔6〕。本研究中吡嗪酰胺組在門水平上均以擬桿菌門和厚壁菌門為小鼠腸道的優(yōu)勢菌群，這與Bezirtzoglou等〔7〕研究結(jié)果相似。但是吡嗪酰胺組和溶劑對照組優(yōu)勢菌群所占比例不同，進一步深入探究分析了吡嗪酰胺對腸道菌群代謝功能的影響，結(jié)果顯示吡嗪酰胺能顯著降低氨基酸代謝、能量代謝和多糖代謝。本研究通過高通量測序技術對小鼠糞便菌群進行整體分析，探究吡嗪酰胺對小鼠腸道菌群的影響，結(jié)果顯示Alpha 多樣性的Chao1 指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)這兩種指標在吡嗪酰胺給藥后顯著降低，即對腸道菌群微生物的多樣性具有顯著影響，Beta 多樣性的結(jié)果也證實了這一點，在服用吡嗪酰胺后，菌群結(jié)構(gòu)明顯偏離溶劑對照組。以上結(jié)果說明吡嗪酰胺能明顯改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，有可能會增加腸道菌群失調(diào)的風險。

圖6 吡嗪酰胺對腸道菌群代謝功能的影響

吡嗪酰胺通過滲入含有結(jié)核桿菌的巨噬細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化為吡嗪酸而發(fā)揮抑菌或殺菌的作用〔8〕。吡嗪酰胺常與利福平、異煙肼及乙胺丁醇聯(lián)用治療結(jié)核病，但其副作用明顯，長期大劑量服用易引起肝臟毒性，這一副作用已在臨床有表現(xiàn)，然而吡嗪酰胺引起肝損傷的機制仍在探索研究階段〔9-10〕。吡嗪酰胺組和溶劑對照組小鼠腸道菌群表現(xiàn)出一定的差異，吡嗪酰胺導致乳酸桿菌數(shù)量的減少，這提示吡嗪酰胺引起的腸道菌群紊亂與腸道炎癥和肝損傷有關〔11〕。此外本研究結(jié)果表明相對于溶劑對照組，吡嗪酰胺組的氨基酸、能量和多糖代謝等代謝功能指標均顯著降低，這可能與吡嗪酰胺引起的肝損傷相關〔12〕。雖然越來越多的研究〔13-15〕表明腸道菌群失衡在促進肝臟疾病發(fā)展過程中也起著關鍵作用，但是這一毒副作用是否與吡嗪酰胺能夠改變腸道微生物的平衡及其代謝功能有關尚需進一步驗證。本研究表明吡嗪酰胺對正常小鼠腸道微生物有影響，為進一步探討其藥理作用打開了新視野。