豬場偽狂犬病毒變異與凈化

宋國盛，朱利俊，張錦國，郭少春

（1.湖北省武穴市動物衛(wèi)生監(jiān)督局，湖北 武穴 435400；2.湖北省武穴市動物疫病預(yù)防控制中心，湖北 武穴 435400；3.湖北省武穴市畜牧技術(shù)推廣站，湖北 武穴 435400；4.湖北省武穴市大金鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，湖北 武穴 435400)

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的豬繁殖障礙性疫病，可造成新生仔豬發(fā)熱、腹瀉、嘔吐及神經(jīng)癥狀，死亡率極高[1]。豬偽狂犬病的凈化已被列入國家中長期動物疫病防治規(guī)劃，標記疫苗免疫及鑒別野毒診斷是目前凈化該病的主要手段。本試驗調(diào)查了不同毒株的標記疫苗在不同豬群中的免疫效果、不同豬群的野毒感染情況及凈化效果，以期為偽狂犬病的凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

偽狂犬病毒gB 抗體檢測試劑盒（gB-ELISA）、偽狂犬病毒gE 抗體檢測試劑盒（gE-ELISA）、偽狂犬病毒PCR 抗原檢測試劑盒，武漢科前生物股份有限公司；酶標檢測儀，美國BIO-RAP 公司；實時熒光定量PCR 設(shè)備，西安天隆科技有限公司；豬偽狂犬病毒弱毒疫苗（變異株）、豬偽狂犬病毒滅活疫苗（變異株），武漢科前生物股份有限公司；豬偽狂犬病毒弱毒（Bartha-K61 株）疫苗、豬偽狂犬病毒滅活（Bartha-K61株）疫苗，某動物保健品有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

對襄大（武穴）農(nóng)牧有限公司豬場的偽狂犬病毒野毒進行普查，確定是否有變異偽狂犬病毒野毒感染。為選擇正確的疫苗種類、免疫時機和免疫劑量，分別進行了下列5個試驗。

1.2.1 試驗1 對618 頭生產(chǎn)母豬、186 頭后備母豬進行g(shù)E抗體檢測和PCR抗原檢測，統(tǒng)計檢測結(jié)果及2種檢測方法的符合率。

1.2.2 試驗2 對957 頭哺乳仔豬進行不同日齡哺乳仔豬的血清學(xué)和病原學(xué)普查，統(tǒng)計哺乳仔豬不同日齡的野毒帶毒情況及2種檢測方法的符合率。

1.2.3 試驗3 對1 016 頭斷奶仔豬和育肥豬進行普查，分析變異株野毒感染規(guī)律及2 種檢測方法的符合率。

1.2.4 試驗4 隨機抽取100 頭生產(chǎn)母豬，分為2組，分別注射國產(chǎn)疫苗和進口疫苗，生產(chǎn)母豬注射時間為產(chǎn)前35、20 d，后備母豬注射時間為配種前35、20 d，分別注射1 頭份弱毒疫苗和滅活疫苗；檢測疫苗有效抗體的形成時間、達到高峰時間、持續(xù)時間、開始衰落時間，對比國產(chǎn)疫苗和進口疫苗免疫后的野毒陽性率。

1.2.5 試驗5 根據(jù)試驗4 分組母豬所產(chǎn)后代自動分組，2 組隨機選取478 和479 頭哺乳仔豬，分別于42 日齡和65 日齡各注射1 頭份偽狂犬基因缺失弱毒苗，檢測哺乳仔豬75 日齡的野毒陽性率，進行國產(chǎn)疫苗和進口疫苗的對比試驗。

1.2.6 試驗6 根據(jù)試驗5 分組繼續(xù)檢測斷奶仔豬不同日齡偽狂犬野毒轉(zhuǎn)陽率，在免疫后150 d 檢測育肥豬偽狂犬帶毒陽性率以及出欄存活率。

1.3 血清樣品的采集與處理

試驗1-3 中每頭母豬和仔豬無菌采血1 頭份，保留有效血清5 mL,檢測所有血清中偽狂犬野毒gE抗體和PCR 抗原。試驗4每頭母豬和仔豬無菌采血1 頭份，保留有效血清5 mL,并分別于疫苗注射后15、30、60、90、120、150 d 采血，檢測所有血清疫苗gB 抗體和gE 抗體。試驗5 每頭仔豬無菌采血1 頭份，每隔10 d 采血1 次直至75 日齡，每次保留有效血清5 mL。試驗6 仔豬和育肥豬每隔10 d 采血1次，直至免疫后150 d，每次保留有效血清5 mL.

1.4 野毒抗體和疫苗抗體滴度檢測

按1∶2 的比例稀釋待檢血清，每1 個樣品1 個吸嘴，樣品加到酶標孔內(nèi)之前混合均勻，靜置待檢。參照偽狂犬病gB和gE抗體試劑盒檢測程序進行。

抗體結(jié)果判定：①S/N≥0.42 為PRV-gE 抗體陽性。②S/N≤0.38 為陰性。③0.38＜S/N＜0.42 為可疑樣品，需要重復(fù)試驗確定最終結(jié)果。

1.5 偽狂犬病毒野毒抗原檢測

參照偽狂犬病毒PCR 抗原檢測試劑盒操作規(guī)程執(zhí)行。當標本檢測Ct值≤35 或有明顯指數(shù)增長期，判定為陽性；當標本檢測Ct值在35～38，應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)試驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。當標本檢測Ct值＞38 或無Ct值，判定為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生產(chǎn)母豬、后備母豬PRV gE 抗體和PCR 抗原檢測結(jié)果

該養(yǎng)殖場一直使用武漢科前生物股份有限公司HB98 偽狂犬基因缺失弱毒疫苗,防控效果較好。試驗前期，生產(chǎn)母豬有類似偽狂犬的臨床癥狀，血清學(xué)gE 抗體檢測結(jié)果顯示該豬場PRV 感染嚴重,通過PCR 檢測，確認為偽狂犬變異株所引起。從高胎齡生產(chǎn)母豬、青年母豬到后備母豬野毒陽性率呈明顯上升趨勢，說明野毒是按照后備母豬、青年母豬、高胎齡生產(chǎn)母豬的順序感染的。由表1可見，4胎以上母豬PRV 抗原與血清學(xué)抗體符合率明顯降低，說明母豬自身在清除病毒。

表1 生產(chǎn)母豬、后備母豬PRV的gE抗體陽性率與PCR陽性率檢測結(jié)果

2.2 哺乳仔豬PRV感染gE抗體檢測結(jié)果

由表2可知，哺乳仔豬gE抗體陽性率較高，PCR抗原陽性率較低，可能與仔豬母源抗體有關(guān)；隨著仔豬日齡的增長，PCR抗原陽性率上升，這可能與母源抗體不斷下降有關(guān)。

表2 哺乳仔豬PRV gE抗體陽性率和PCR抗原陽性率檢測結(jié)果

2.3 斷奶仔豬和育肥豬PRV 感染gE 抗體檢測結(jié)果

由表3可知，仔豬斷奶前期，PCR抗原陽性與gE抗體陽性符合率較低，說明存在部分仔豬假陽性的現(xiàn)象，仔豬在90 日齡左右陽性率明顯上升，說明疫苗選擇和免疫程序還有待改善。

表3 斷奶仔豬和育肥豬PRV gE抗體陽性率和PCR抗原陽性率檢測結(jié)果

2.4 國產(chǎn)疫苗和進口疫苗gB和gE抗體檢測結(jié)果

2.4.1 國產(chǎn)疫苗和進口疫苗gB 抗體陽性率檢測結(jié)果 由表4 可知，國產(chǎn)疫苗和進口疫苗的免疫效果均表現(xiàn)良好，免疫后均可產(chǎn)生較高的抗體水平，表明本試驗?zāi)肛i的免疫程序合理。

表4 接種疫苗前后不同時間各組母豬PRV gB抗體陽性率 （單位：%）

2.4.2 國產(chǎn)疫苗和進口疫苗gE 抗體檢測結(jié)果2 組母豬均為50 頭，免疫前陽性母豬均為12 頭，gE 抗體陽性率為24.00%；國產(chǎn)變異株疫苗和進口經(jīng)典株疫苗免疫150 d 分別有3 頭、10 頭陽性母豬，gE 抗體陽性率分別為6.00%和20.00%。這表明國產(chǎn)變異株疫苗與野毒同源性高，而進口經(jīng)典株疫苗同源性低，國產(chǎn)變異株疫苗對野毒阻斷率要優(yōu)于進口經(jīng)典株疫苗。

2.5 哺乳仔豬國產(chǎn)疫苗和進口疫苗野毒抗體檢測結(jié)果

國產(chǎn)變異株疫苗共免疫哺乳仔豬478 頭，免疫前陽性仔豬為94 頭，gE 抗體陽性率為19.67%；免疫后75日齡陽性仔豬為5頭，gE抗體陽性率為1.05%。進口經(jīng)典株疫苗共免疫哺乳仔豬479 頭，免疫前陽性仔豬為94 頭，gE 抗體陽性率為19.62%；免疫后75日齡陽性仔豬為14 頭，gE 抗體陽性率為2.92%。哺乳仔豬注射疫苗前后，國產(chǎn)變異株疫苗組和進口經(jīng)典株疫苗組偽狂犬野毒陽性率沒有明顯差異。

2.6 斷奶仔豬和育肥豬國產(chǎn)疫苗和進口疫苗gE抗體檢測結(jié)果

國產(chǎn)變異株疫苗共免疫斷奶仔豬和育肥豬478頭，免疫前陽性數(shù)為144 頭，gE 抗體陽性率為30.13%；免疫后150 d 陽性數(shù)為39 頭，gE 抗體陽性率為8.16%；出欄472 頭，出欄率為98.74%；進口經(jīng)典株疫苗共免疫479 頭，免疫前陽性數(shù)為143 頭，gE抗體陽性率為29.85%；免疫后150 d陽性數(shù)為138頭，gE 抗體陽性率為28.81%；出欄443 頭，出欄率為92.48%。這表明，國產(chǎn)變異株疫苗組和進口經(jīng)典株疫苗組對斷奶仔豬和育肥豬的野毒感染阻斷率差異明顯，國產(chǎn)變異株疫苗對野毒有良好的阻斷效果。此外，國產(chǎn)變異株疫苗組的出欄數(shù)和出欄率也明顯更高。

3 小結(jié)與討論

國產(chǎn)變異株疫苗和進口經(jīng)典株疫苗都為我國規(guī)?；i場豬偽狂犬病防控做出了重要貢獻[2]，均具有抗體上升速度快、抗體滴度高、穩(wěn)定、保持時間長等優(yōu)點。但從試驗結(jié)果可知國產(chǎn)變異株疫苗相較于進口經(jīng)典株疫苗對變異毒株的阻斷能力明顯更強。

免疫之前，該豬場母豬出現(xiàn)產(chǎn)死胎、弱仔、流產(chǎn)等癥狀，是病毒急性感染胎盤的臨床表現(xiàn)。但母豬自身抗病毒的能力較強，病毒感染表現(xiàn)為隱性，母豬gE 抗體陽性率呈逐步下降的趨勢。病毒一旦感染母豬，會終身在其神經(jīng)系統(tǒng)潛伏。從試驗4 結(jié)果可知，感染過病毒的母豬經(jīng)過疫苗強化免疫，雖然能清除血液中的病毒，但不能清除神經(jīng)系統(tǒng)中病毒。哺乳仔豬出生表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀、腹瀉癥狀，出現(xiàn)高死亡率，這與野毒的毒力有關(guān)，如果阻斷病毒通過血液向胎盤傳播，這些臨床癥狀都可以減輕甚至消除。

從斷奶仔豬的檢測結(jié)果可知，90 日齡時仔豬抗體水平最低，此時是變異株偽狂犬野毒感染斷奶仔豬的重要時期，隨后育肥豬群病毒載量會不斷增加，育肥豬群會出現(xiàn)嚴重咳嗽、喘氣等臨床癥狀，緊急接種偽狂犬弱毒疫苗可以明顯改善臨床癥狀。因此，在哺乳仔豬65 日齡第2 次接種偽狂犬滅活苗或在90 日齡再接種1 次偽狂犬滅活苗，可以保持育肥豬高抗體水平，從而減少育肥豬感染野毒?？刂曝i場偽狂犬病的關(guān)鍵是要控制育肥豬群病毒載量，90 日齡豬群是野毒感染最開始的階段，育肥豬又是豬場最大的飼養(yǎng)群體，因此豬場要著重解決好育肥豬的問題。

自2011 年開始報道豬偽狂犬變異毒株以來[3]，該病已在世界范圍內(nèi)流行。襄大（武穴）農(nóng)牧有限公司養(yǎng)殖場也感染了變異株偽狂犬病毒，試驗開始前，該豬場偽狂犬病毒不穩(wěn)定，表明國內(nèi)外生產(chǎn)的基因缺失弱毒疫苗已出現(xiàn)免疫失效，建議使用國產(chǎn)變異株弱毒疫苗并配合使用變異株滅活疫苗，以加強豬群對PRV的免疫。

國產(chǎn)豬偽狂犬變異株疫苗可以明顯降低母豬和育肥豬野毒gE 抗體陽性率，其對變異株野毒的阻斷能力明顯高于進口經(jīng)典株疫苗。應(yīng)加強對豬偽狂犬變異株疫苗的研制及免疫程序的研究，以實現(xiàn)變異株豬偽狂犬病可防可控，規(guī)?；i場可以通過消毒、免疫、隔離、捕殺、補充陰性豬群等生物安全措施進行凈化。