基于高通量測序的菜頭腎葉綠體基因組的組裝及序列分析

趙 祺，余佳興，秦宇雯，任仙櫻，高海東，吳志剛，姜程曦*

基于高通量測序的菜頭腎葉綠體基因組的組裝及序列分析

趙 祺1, 2，余佳興1#，秦宇雯1, 2，任仙櫻1, 3，高海東4，吳志剛1*，姜程曦1, 3*

1. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325035 2. 浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 溫州 325035 3. 安徽省九華山佛教醫(yī)藥研究所，安徽 池州 242700 4. 南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司，江蘇 南京 210033

以藥用植物菜頭腎為材料，對其葉綠體基因組進(jìn)行組裝和序列分析，為進(jìn)一步開展菜頭腎遺傳與鑒定學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。采用高通量測序技術(shù)首次對菜頭腎葉綠體基因組進(jìn)行測序，以板藍(lán)葉綠體基因組為參考，進(jìn)行特征分析和聚類關(guān)系研究。生物信息學(xué)分析表明，菜頭腎葉綠體基因組總長為144 713 bp，具有典型的被子植物葉綠體基因組環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，GC含量為38.35%；共注釋得到129個基因，包括84個蛋白編碼基因，37個tRNA基因和8個rRNA基因；蛋白編碼基因?qū)?yīng)的密碼子偏好使用A/T堿基。系統(tǒng)發(fā)育研究表明，菜頭腎與板藍(lán)親緣關(guān)系最近，提示它們在進(jìn)化上具有共線性。建立了適于菜頭腎植物完整葉綠體基因組組裝及其特征分析的方法，為菜頭腎的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育研究奠定了基礎(chǔ)。

菜頭腎；板藍(lán)；葉綠體；基因組；高通量測序

菜頭腎C. Ling來源于爵床科馬藍(lán)亞族黃猄草屬多年生草本植物[1]，別名土太子參、肉根馬藍(lán)，是溫州民間著名補腎方劑“七腎湯”的君藥，在臨床上可與其他藥物配伍或單獨使用[2-3]。由于菜頭腎具有顯著的補腎功能，其在民間廣泛使用，并已實現(xiàn)了人工種植[4]。目前，菜頭腎的相關(guān)研究主要集中于栽培、資源調(diào)查[5]、化學(xué)成分鑒定[6-7]等方面研究，有關(guān)該植物葉綠體基因組組裝、基因組成和序列分析等未見報道。

葉綠體是植物細(xì)胞進(jìn)行光合作用的重要場所，擁有一套完整的基因組，可進(jìn)行自主遺傳。20世紀(jì)60年代初，在煙草L.[8]、地錢L.[9]中首次報道了葉綠體全序列。由于葉綠體基因組包含大量遺傳信息，不同物種之間具有良好的共線性，被廣泛應(yīng)用于玉米L.[10]、水稻L.[11]、大豆(Linn.) Merr.[12]等植物分子進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育的研究，并在藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化、基因工程和分子育種等方面發(fā)揮著重要作用[13-17]。鑒于此，本研究利用高通量測序技術(shù)對菜頭腎葉綠體基因組進(jìn)行測序，分析組裝后的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、SSR（Simple Sequence Repeat，簡單重復(fù)序列）位點、IR（inverted repeat，反向重復(fù)序列）區(qū)間特征比較及近緣物種親緣關(guān)系，為菜頭腎的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菜頭腎C. Ling采自溫州市甌海區(qū)大羅山（27°51′N，120°40′E），該地屬南亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候區(qū)，年均氣溫17 ℃，無霜期216～317 d，年均降水量1611 mm，年均相對濕度79%。經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)教研室生藥學(xué)專家鮑康德副教授鑒定所有樣品均來源于爵床科馬藍(lán)亞族黃猄草屬菜頭腎，各樣品均采集新鮮幼嫩的葉片，液氮速凍下研磨，?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA基因提取 全基因組DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒（TIAN?GEN，DP305）提取樣本的總DNA。

1.2.2 測序 總DNA樣品經(jīng)南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序，得到測序reads、質(zhì)控。采用Illumina HiSeq PE150雙末端測序策略進(jìn)行建庫測序，建庫類型為350 bp DNA小片段文庫，測序深度為10倍。

1.2.3 葉綠體基因組組裝 通過Illumina HiSeq PE150測序平臺對樣品進(jìn)行測序，用MITObim 1.8[18]組裝軟件進(jìn)行組裝。由于NCBI數(shù)據(jù)庫中暫未收錄菜頭腎同屬植物參考序列，因此選用同為馬藍(lán)亞族的板藍(lán)(Nees) Kuntze（NC_037485.1）為參考序列。然后用Gap Closer[19]1.12軟件（http://soap.genomics.org.cn/ soapdenovo.html）對組裝結(jié)果進(jìn)行內(nèi)洞修補，最后去除冗余的短序列得到最后的組裝結(jié)果。

1.2.4 基因組特征分析 先用GeneMarkS （Version 4.17）[20]軟件對菜頭腎葉綠體基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測，tRNAscan-SE軟件[21]（Version 1.3.1）、rRNAmmer軟件[22]（Version 1.2）分別對tRNA和rRNA基因進(jìn)行預(yù)測，用OGDRAW軟件[23]呈現(xiàn)葉綠體基因組序列圖，再用MISAI.0[24]軟件分析菜頭腎葉綠體全基因組SSR位點，F(xiàn)ind repeats工具獲得菜頭腎、穿心蓮等6種基因組的IR序列、大單拷貝區(qū)（LSC）和小單拷貝區(qū)（SSC），MAFFT v7.394[25]軟件進(jìn)行序列比對，最后使用PhyML v3.0[26]軟件基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組測序與葉綠體基因組組裝

基于高通量測序，發(fā)現(xiàn)菜頭腎全基因組總長為144 713 bp，堿基為5 196 698 700 bp，具一個典型的4分區(qū)域結(jié)構(gòu)，包含4個區(qū)段：LSC為92 026 bp、SSC為17 825 bp、2段反向互補重復(fù)的IR區(qū)（IRA和IRB）17 431 bp。GC含量為38.35%，有效數(shù)據(jù)20值、30值分別96.58%和90.91%。IR、LSC和SSC區(qū)域的GC值存在一定的差異，IR區(qū)域的GC值最高，為45.47%；LSC次之，36.49%；SSC區(qū)域的GC值最小，僅32.34%（表1）。值得注意的是，部分基因在SSC和IRB交界處重復(fù)（圖l）。

2.2 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)基本特征

菜頭腎葉綠體基因組共注釋129個基因，包括84個蛋白編碼基因，37個tRNA基因和8個rRNA基因。根據(jù)其功能可以把它們分為4大類：分別是光合作用相關(guān)基因、表達(dá)相關(guān)基因、未知功能基因，以及成熟酶基因（）、囊膜蛋白基因（）等其他基因。在這些基因中含有24個內(nèi)含子和17個雙拷貝基因（表2），包括1個光系統(tǒng)亞基（）、4個rRNA基因（、、、）、8個tRNA基因（、、、、、、、）、1個NADH脫氫酶亞基基因（）、2 個核糖體蛋白大小亞基編碼基因（、）及1個未知功能蛋白基因（）。值得注意的是，在菜頭腎葉綠體基因組中存在一些未知功能的基因，如、、、，還需要做進(jìn)一步研究才能確定其功能。在SSC區(qū)共有12個CDS和1個tRNA基因（）存在。然而絕大多數(shù)的基因存在于LSC區(qū)，有59個CDS和22個tRNA 基因（表2），其中內(nèi)含子最長，其片段大小為2450 bp，包含基因。

表1 菜頭腎葉綠體基因組堿基組成

圖1 菜頭腎葉綠體基因組

2.3 SSR分析及爵床科IR區(qū)邊界比較分析

在菜頭腎葉綠體全基因組中，共搜索184個符合條件的SSR位點（表3），多分布于LSC區(qū)，其中包括92個單核苷酸重復(fù)基元，10個二核苷酸重復(fù)基元，67個三核苷酸重復(fù)基元，9個四核苷酸重復(fù)基元，4個五核苷酸重復(fù)基元和2個六核苷酸重復(fù)基元。在所有SSR中，最多重復(fù)基元是A/T，然后依次是AT/TA、TTG/TTA和ATA/ATA。由此可以看出，A/T基元占優(yōu)勢，具有堿基偏好性。這與菜頭腎葉綠體全基因組富含AT（含量為61.65%）一致，這種偏好性可能是由于AT比GC更容易解鏈有關(guān)。

通過與爵床亞科板藍(lán)、穿心蓮(Burm. F.) Nees、黃花戀巖花(Lévl.) J. R. I. Wood、戀巖花Nees、鱷嘴花(Burm. f.) Lindau 4個屬5個物種的葉綠體基因組IR區(qū)邊界進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這6種植物葉綠體基因組長度144 133～152 672 bp，基因具有相對保守性，從大到小依次為黃花戀巖花、戀巖花、穿心蓮、鱷嘴花、菜頭腎、板藍(lán)。其中板藍(lán)與菜頭腎基因結(jié)構(gòu)與種類最相似，與基因都有2份拷貝，基因絕大部分在IRA與IRB區(qū)內(nèi)，板藍(lán)少部分基因（約379 bp）位于LSC/IRA邊界，菜頭腎基因全部位于IRA區(qū)內(nèi)；基因分別位于IRB/SSC和SSC/IRA邊界，這可能與 IR/SSC邊界的擴張有關(guān)（圖2），位于SSC/IRA邊界的基因長度為5496 bp和5514 bp，為正常基因，但位于IRB/SSC邊界的基因全長僅為840 bp和834 bp，它的3’端發(fā)生缺失，該為一個假基因。穿心蓮、鱷嘴花等其他物種沒有基因，鱷嘴花IR區(qū)也沒有基因，基因差異最大。

表2 菜頭腎葉綠體基因組編碼的基因

*具有1個內(nèi)含子的基因**具有2個內(nèi)含子的基因△多拷貝基因#假基因

*indicate one intron in the gene**indicate two introns in the gene△multiple copy gene#pseudogene.

表3 菜頭腎葉綠體基因組中SSR位點類型及數(shù)量

圖2 爵床科6個物種葉綠體全基因組IR邊界的比較示意圖

2.4 基于葉綠體基因組全序列的聚類分析

葉綠體基因組對系統(tǒng)發(fā)育研究具有重要意義[27]。為了鑒定菜頭腎在爵床科中的進(jìn)化位置，將測得的菜頭腎葉綠體基因組序列與NCBI網(wǎng)站下載的其他10個物種葉綠體全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由于目前暫無黃猄草屬植物葉綠體基因組GenBank，且爵床科植物葉綠體基因組研究有限，在此選取了在分類上與菜頭腎同一亞族的板藍(lán)，同一族的黃花戀巖花、黃花假杜鵑L.等4個物種，同一亞科的鱷嘴花、穿心蓮、孩兒草(L.) Nees 3個物種，同一科的老鼠筋L. Sp.和小花老鼠筋Vahl，及不同科的日本紫莖Sieb. et Zucc.。結(jié)果顯示（圖3），不同科物種與爵床科距離最遠(yuǎn)，說明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，此與《中國植物志》植物分類結(jié)果相一致[28]；包括菜頭腎在內(nèi)的11個爵床科物種集為一支，屬間關(guān)系比較清晰，支持率為100%；菜頭腎與板藍(lán)組成的小分支是姐妹關(guān)系，說明其親緣關(guān)系密切，此與《中國植物志》植物分類結(jié)果一致，暗示它們在進(jìn)化上具有共線性。

圖3 基于葉綠體全基因組的12個物種的最大似然法(ML)聚類結(jié)果

3 討論

菜頭腎是溫州民間特色中草藥，主要作為驗方“七腎湯”組方之一，根據(jù)臨床病情的不同，可調(diào)整藥物劑量，當(dāng)肝炎遷延期、慢性腎炎腰痛時，重用菜頭腎[29-30]。此外，菜頭腎曾被《中國物種紅色名錄》列為極危（CR）等級[31]，因而具有重要的保護(hù)、研究和開發(fā)利用價值。本研究利用第2代測序技術(shù)，對爵床科植物菜頭腎進(jìn)行了葉綠體基因組測序，獲得其全長144 713 bp，注釋得到129個基因；鑒定184個SSR 位點，大多數(shù)位點具有A/T堿基偏好性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明菜頭腎與已報道的同一亞族植物板藍(lán)的親緣關(guān)系最近，暗示它們在進(jìn)化上具有共線性。

黃猄草屬Bremek. 植物全世界共有10種，我國有7～9種。目前，黃猄草屬植物遺傳背景工作研究有限，本實驗首次報道該屬物種葉綠體基因組序列，不僅可以豐富葉綠體基因組序列的數(shù)量，還可以為研究菜頭腎的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。然而，與爵床科其它屬所具有的物種多樣性水平相比，基礎(chǔ)研究工作有待加強。

通過對比分析，菜頭腎與已發(fā)表的爵床科植物葉綠體基因組GC含量相似，基因構(gòu)成和次序一致，體現(xiàn)了葉綠體基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，總體進(jìn)化速率較低[32-34]。因為葉綠體基因組在總體上的保守性，在利用葉綠體基因組信息時，通常會篩選其中的高變區(qū)如、、等常用的葉綠體片段。值得注意的是，在該基因組中存在一些未知功能的基因，如、、和，還需要做進(jìn)一步研究才能確定其功能。

SSR廣泛存在于原核生物和真核生物基因中，具有共顯性：本研究經(jīng)分析鑒定出184個SSR，多分布于LSC區(qū)，主要由堿基A和T組成，這與爵床屬葉綠體基因SSR分析結(jié)果類似[35-36]。SSR分布還具有物種特異性：二至六核苷酸重復(fù)類型SSR 位點中，菜頭腎轉(zhuǎn)錄組以三核苷酸重復(fù)為主，其優(yōu)勢重復(fù)基元類型是TTG/TTA和ATA/ATA，共占比22.39%；不同屬植物穿心蓮和板藍(lán)以二核苷酸重復(fù)為主，其優(yōu)勢重復(fù)基元類型是AT/AT和AG/CT，穿心蓮占比33.60%，板藍(lán)占比90.70%[37-38]。SSR豐富的變異位點，為今后開發(fā)SSR標(biāo)記及進(jìn)一步揭示菜頭腎的系統(tǒng)進(jìn)化提供了可靠的分子手段。

《中國植物志》記載：菜頭腎暫仍保留在黃猄草屬，然而其具根莖，側(cè)根肉質(zhì)增厚，這在馬藍(lán)亞族（Strobilanthinae）實不多見，或許為一新屬，有待進(jìn)一步深入研究。通過對比分析，發(fā)現(xiàn)菜頭腎與板藍(lán)葉綠體基因長度相近（相差580 bp），mRNA、rRNA、tRNA分別均為84、8、37個，IR區(qū)間結(jié)構(gòu)相近，基于葉綠體全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，爵床科內(nèi)分支支持率全為100%，且菜頭腎與同一亞族的板藍(lán)親緣關(guān)系最近，構(gòu)成姐妹關(guān)系。但因受黃猄草屬物種葉綠體全基因組序列信息不全的影響，無法利用葉綠體基因組對菜頭腎進(jìn)行屬內(nèi)鑒別。因此，對菜頭腎的鑒別和系統(tǒng)發(fā)育研究，后期還需從形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)等進(jìn)一步研究、驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Assembly and sequence analysis of chloroplast genome ofbased on high-throughput sequencing

ZHAO Qi1, 2,YU Jia-xing1, QIN Yu-wen1, 2, REN Xian-ying1, 3, GAO Hai-dong4, WU Zhi-gang1, JIANG Cheng-xi1, 3

1. School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China 2. Zhejiang Biomedical Collaborative Innovation Center, Wenzhou 325035, China 3. Jiuhua Mountain Buddhist Medicine Research Institute of Anhui Province, Chizhou 242700, China 4. Nanjing Jisihuiyuan Biotechnology Co., Ltd., Nanjing 210033, China

The chloroplast genome ofwas assembled and sequenced, laying a foundation for the further development of the genetics and identification of.The chloroplast genome ofwas sequenced using high-throughput sequencing technology for the first time, taking the chloroplast genome ofas a reference, the feature analysis and clustering relationship study were carried out.Bioinformatics analysis showed that the total length of the chloroplast genome ofis 144,713bp, containing a typical angiosperm chloroplast genome circular tetrad structure, with a GC content of 38.35%. A total of 129 genes were annotated, including 84 protein-coding genes, 37 tRNA genes and eight rRNA genes. The codons corresponding to protein coding genes are preferred with A/T bases. Phylogenetic studies showed that the relationship betweenandwas the closest, suggesting that they were evolutionarily co-linear.The research provided a method suitable for the assembly of the complete chloroplast genome and the analysis of characteristics of the whole chloroplast genome of the, which also could lay the foundation for the research on the identification and phylogeny of.

C. Ling;(Nees) Kuntze;chloroplast; genome; high-throughput sequencing

R282.12

A

0253 - 2670(2021)06 - 1744 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.024

2020-12-01

國家中醫(yī)藥管理局中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)項目（ZYBZH-Y-SC-40）；云南大理藥業(yè)股份有限公司課題（KJHX1603）；溫州醫(yī)科大學(xué)人才科研啟動項目（OTJ18037）

趙 祺（1994—），女，湖北襄樊人，碩士，研究方向為中藥鑒定學(xué)。Tel: (0577)86591685 E-mail: 1297909219@qq.com

姜程曦，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥學(xué)。Tel: 18969715696 E-mail: jiangchengxi@126.com

吳志剛，副教授，研究方向為中藥次生代謝產(chǎn)物研究。Tel: 15867176058 E-mail: wuzhigang177@126.com

#并列第一作者：余佳興（1997—），女，四川成都人，碩士，研究方向為中藥學(xué)。Tel: (0577)86591685

[責(zé)任編輯 時圣明]