快樂鼠尾草精油GC-MS分析及其抗菌、抗炎活性研究*

伍建中，顏瑋韜，張雨云，周曉波，陳 嘉，張 瑱，葛 建

(1 大理大學(xué)，云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心/中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000;2 上海華匯拓醫(yī)藥科技有限公司，上海 201203)

快樂鼠尾草(SalviasclareaL.)，別名歐鼠尾草，香紫蘇，為唇形科，鼠尾草屬草本植物。精油蒸餾自其葉子與花朵，帶有些甜味及茴香、樟腦的香味。在國外用來調(diào)味，防腐等[1-2]。國外學(xué)者報(bào)道快樂鼠尾草精油有效成分主要為揮發(fā)油，酚類、酚酸及其衍生物[3]等；其藥理作用主要包括，抗氧化，抗菌和抗炎鎮(zhèn)痛等[3]，是一種重要的天然醫(yī)藥資源。但因?yàn)椴煌瑥S家工藝的差異。導(dǎo)致快樂鼠尾草精油的組成成分和藥理活性也有一定不同。因此實(shí)驗(yàn)對選取國內(nèi)三種廠家快樂鼠尾草精油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對其進(jìn)行分析和峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對含量，并對三種廠家快樂鼠尾草精油進(jìn)行抑菌和抗炎活性評價(jià)，以期為其進(jìn)一步的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

7890A GC/5975C MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器，美國Agilent Technologies公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BSA-124S型精密分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HF160W型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；201型奧地利安圖斯2010酶標(biāo)儀，奧地利安圖斯公司。

1.2 試 藥

青鏈霉素(100×，批號：20190712)，Solarbio公司；氯霉素注射液(批號：1906318)，國藥集團(tuán)榮生制藥有限公司；克霉唑溶液(批號：E1009)，白云山何濟(jì)公制藥廠；快樂鼠尾草精油分別購于云南大理A(批號20180605)、云南西雙版納B(批號20190411)、廣西南寧C(批號20190320)，規(guī)格均為10 mL。

脂多糖(批號：NO.320V035)，北京索萊寶科技有限公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium(批號：2009115)，Gibco公司；RPMI-1640(批號：1833738)，Gibco公司；Fetal Bovine Serum(批號：1828728)，Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO，色譜級，批號：201608206)，天津市福晨化工廠公司；小鼠細(xì)胞上清腫瘤壞死因子-α(批號：M1090729-102a)，欣博盛生物科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：180726)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙氏瓊脂培養(yǎng)基(批號：705K021)，北京索萊寶科技有限公司。

金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus(25923)、大腸埃希菌Escherichiacoli(25922)、白色念珠菌Candidaalbicans(10231)，由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；小鼠白血病巨噬細(xì)胞RAW264.7，F(xiàn)5(廣州，KCB200603YJ)。

2 方 法

2.1 快樂鼠尾草精油GC-MS定性分析

2.1.1 GC-MS分析樣品制備

稱取快樂鼠尾草精油適量，以甲醇配制成濃度為3 mg·mL-1的供試品溶液，使用孔徑為0.22 μm的聚醚砜針式過濾器過濾，備用。

2.1.2 GC-MS分析條件

色譜條件：Agilent氣相色譜柱(HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm)；色譜工作站OpenLab CDS ChemStationC.01.01；載氣為氦氣；載氣流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積0.3 μL；以分流比10:1分流進(jìn)樣；梯度升溫程序見表1；分析時間34 min。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～550；質(zhì)譜檢索采用NIST11.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，各組分的相對百分含量采用峰面積歸一化法計(jì)算。

表1 梯度洗脫程序

2.2 快樂鼠尾草精油抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 菌懸液的制備

取一只無菌試管，用注射器抽取4 mL 0.9%無菌生理鹽水，注入到試管中。用接種環(huán)挑取待測菌種1～2個單個菌落，制成菌懸液，與0.5麥?zhǔn)媳葷嵋罕葷?約含菌1.5×108CFU·mL-1)，整個操作在20 min內(nèi)完成。

2.2.2 陽性藥的制備

氯霉素溶液：將氯霉素注射液2 mL 0.25 g加入8 mL生理鹽水配制成10 mL濃度為0.05 g·mL-1的母液，備用；

克霉唑溶液：將1 mL 15 mg·mL-1的克霉唑溶液加入9 mL生理鹽水配制成10 mL濃度為1.5 mg·mL-1的母液，備用。

2.2.3 牛津杯法測定抑菌活性[4]

將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固后將適量的菌懸液均勻地涂在培養(yǎng)基表面。在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯。輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，在杯中加入樣品。分組如下：陽性對照組氯霉素溶液1.563 mg·mL-1、0.781 mg·mL-1、0.391 mg·mL-1、0.195 mg·mL-1，0.098 mg·mL-1?？嗣惯蛉芤?.5 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、0.375 mg·mL-1、0.1 875 mg·mL-1、0.009375 mg·mL-1。陰性對照組為生理鹽水，給藥組為200 μL不同廠家的快樂鼠尾草精油。加藥后將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌置于溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，白色念珠菌置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h。用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。每組重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

2.3 快樂鼠尾草精油的抗炎實(shí)驗(yàn)[5]

將RAW264.7細(xì)胞以1×105個/孔于96孔板接種并分為：陰性對照組、模型組(LPS)、給藥組(LPS+不同濃度精油)，37 ℃，0.5%CO2培養(yǎng)24 h 后，除陰性對照組外，其余各組均加入LPS使其終濃度為1 μg·mL-1LPS刺激4 h，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行以下處理：陰性對照組和LPS模型對照組給予PBS緩沖溶液10 μL，給藥組分別加入三種不同品牌的快樂鼠尾草精油，使其終濃度為高劑量(30 μg·mL-1)、中劑量(15 μg··mL-1)、低劑量(7.5 μg·mL-1)，每組6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測上清液中TNF-α的含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié) 果

3.1 快樂鼠尾草精油GC-MS成分分析結(jié)果

按照上述“2.1”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到快樂鼠尾草精油的總離子流圖，見圖1～圖3；質(zhì)譜檢索采用 NIST11. L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]。為扣除噪音干擾，本研究采用提取離子的方法對空白溶液與快樂鼠尾草精油供試品溶液圖譜進(jìn)行處理。設(shè)定提取離子波動范圍±0.5u，化合物鑒定方法如上所述，如提取離子m/z 136，快樂鼠尾草精油供試品溶液圖譜如圖1所示。快樂鼠尾草精油供試品溶液圖譜中于12.652 min處出現(xiàn)一差異峰，通過與對照品及NIST11. L數(shù)據(jù)庫比對，該化合物最終被確定為d-檸檬烯。成分鑒定結(jié)果見表2。

圖1 A快樂鼠尾草精油總離子圖

圖2 B廠家快樂鼠尾草精油總離子圖

圖3 C快樂鼠尾草精油總離子圖

表2 快樂鼠尾草精油中的主要化學(xué)成分

續(xù)表2

表3 快樂鼠尾草精油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及白色念珠菌的抑菌直徑

3.2 快樂鼠尾草精油的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抑菌直徑敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)：直徑>20 mm屬于極敏；20 mm≥直徑>15 mm屬于高敏；15 mm≥直徑≥10 mm屬于中敏；直徑<10 mm屬于低敏。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，快樂鼠尾草精油對于三種受試菌種都具有一定的抑菌效果。其中A廠家快樂鼠尾草對白色鏈球菌高敏，對大腸埃希菌中敏，金黃色葡萄球菌低敏，B廠家尾草對白色鏈球菌和大腸埃希菌高敏，對金黃色葡萄球菌極敏。三種精油中C快樂鼠尾草精油品牌的抑菌效果最佳，對三種受試菌均為極敏。其抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4和表4。

A1-1500.00 μg·mL-1克霉唑；A2-750.00 μg·mL-1克霉唑；A3-375.00 μg·mL-1克霉唑；A4- 187.50 μg·mL-1克霉唑；A5-9.375 μg·mL-1克霉唑。A6， B6， C6-氯化鈉注射液(陰性對照)；A7，B7，C7-A快樂鼠尾草精油；A8，B8，C8-B快樂鼠尾草精油；A9，B9，C9- C快樂鼠尾草精油；B1，C1-1563 μg·mL-1氯霉素；B2，C2-781 μg·mL-1氯霉素；B3，C3-391 μg·mL-1氯霉素；B4，C4-195 μg·mL-1氯霉素；B5，C5-98 μg·mL-1氯霉素。

圖4 快樂鼠尾精油的抑菌效果

3.3 快樂鼠尾草精油對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響

與空白對照組(152.28±27.2)比較，LPS模型對照組(715.46±88.62)細(xì)胞分泌TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；造模成功。與LPS模型對照組相比較，快樂鼠尾草精油各劑量(7.5 μg·mL-1、15 μg·mL-1、30 μg·mL-1)組細(xì)胞分泌TNF-α表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)并具有一定的劑量依賴趨勢。

圖5 快樂鼠尾草精油對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響

4 結(jié) 論

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果顯示，三種快樂鼠尾草精油共分析鑒定出45種揮發(fā)性成分，僅有5種為其共有。三種廠家快樂鼠尾草精油均以萜烯類化合物為其主要成分，主要有d-檸檬烯，3-蒈烯和3-蒈烯。A廠家主要成分為d-檸檬烯(53.14%)、3-蒈烯(24.12%)，B廠家主要成分為d-檸檬烯(50.35%)、3-蒈烯(19.34%)；C廠家快樂鼠尾草精油主要成分為3-蒈烯(39.93%)、莰烯(13.07%)。三種廠家的主要揮發(fā)性成分于現(xiàn)有研究報(bào)道成分存在一定差異[9]；且C廠家和A，B廠家主要成分相差較大，這可能與各個廠家的工藝不同，檢測方法的不同有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)已鑒定的這些成分中，很多化合物具有一定抗菌、抗炎活性。如d-檸檬烯和3-蒈烯。檸檬烯[10]和3-蒈烯[11]不僅能通過破壞細(xì)胞膜來發(fā)揮抑菌作用，其中銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為10 mL/L和 20 mL/L，還可以通過調(diào)控NF-κB，IκB 和TNF-α 的表達(dá)來抑制炎癥[12]。

牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種廠家快樂鼠尾草精油均對受試菌種均有一定的抑制效果，對白色念珠菌的抑菌效果都為高敏(抑菌圈>15 mm)。相對而言，C廠家的抑菌效果最好，對三種菌種的抑菌圈均>200 mm。對金黃色葡萄球菌的抑菌效果甚至好于濃度為1563 μg·mL陽性藥氯霉素的抑制效果。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物活性的多肽因子，主要功能為抗病毒感染、抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞以及參與免疫調(diào)節(jié)，是參與炎性反應(yīng)及引起組織細(xì)胞損害的主要介質(zhì)[13]。本文通過檢測LPS誘導(dǎo)RAW264.7驗(yàn)證模型中TNF-α的表達(dá)水平來評價(jià)快樂鼠尾草的抗炎效果，結(jié)果顯示，快樂鼠尾草精油各劑量組TNF-α的表達(dá)均明顯降低(p<0.05)。提示快樂鼠尾草精油可能通過降低TNF-α的表達(dá)來起到抗炎作用。

三種快樂鼠尾草精油結(jié)構(gòu)復(fù)雜，各廠家之間成分相差較大。但均含有確切抑菌抗炎效果的3-蒈烯和d-檸檬烯。大量研究[14-16]證實(shí)了3-蒈烯和d-檸檬烯對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，銅綠假單胞菌等的抑制作用。三種快樂鼠尾草精油抑菌效果差異原因未知，可能與3-蒈烯和d-檸檬烯含量的不同有關(guān)。王卉[17]等通過綜述發(fā)現(xiàn)，植物精油在食品防腐抗菌方面的取得了良好的應(yīng)用，且植物精油更加安全可靠。因此推測未來在食品防腐領(lǐng)域的開發(fā)可能是快樂鼠尾草的研究重點(diǎn)。