基于流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法建立高靈敏檢測(cè)血漿頭孢哌酮的方法研究*

劉翠穎，段天昱，劉俊紅，韓俊茹，李勝?gòu)?qiáng)

(1.天津市西青醫(yī)院健康體檢科，天津 300000；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300000)

在治療細(xì)菌性感染的臨床實(shí)踐中，具有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的頭孢菌素是最常用的1種抗生素[1-2]。而頭孢哌酮是第3代廣譜半合成頭孢菌素，對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性厭氧菌、某些類型的革蘭陰性厭氧菌和肺炎球菌都具有良好的治療作用。因此，臨床常常用于治療敏感菌群所導(dǎo)致的呼吸道感染、膽道感染和敗血癥等[3]。

近年來(lái)，隨著細(xì)菌耐藥性的逐年增加，β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)β-內(nèi)酰胺酶變得越來(lái)越敏感。為了應(yīng)對(duì)這種情況，臨床醫(yī)生常常將β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑聯(lián)合使用治療敏感菌群所導(dǎo)致的感染[4]，但合理的使用抗生素需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)抗生素的血藥濃度。相關(guān)報(bào)道顯示，頭孢哌酮在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)個(gè)體差異非常大，特別是對(duì)于那些顱內(nèi)感染的患者，由于人類血腦屏障的天然存在，很大程度阻止了抗菌藥物在腦脊液中的滲透，因此，藥物在患者顱內(nèi)就很難達(dá)到有效的抑菌濃度[5]。而對(duì)于肝腎功能不全的患者，由于其自身原因使藥物的半衰期延長(zhǎng)，造成藥物在體內(nèi)積累，極易引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，臨床上常常需要監(jiān)測(cè)這些患者體內(nèi)抗菌藥物的濃度，最大限度地減小藥物毒性并提高藥物療效，從而降低藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率[6]。基于以上原因，急需發(fā)展一種監(jiān)測(cè)人體內(nèi)頭孢哌酮濃度新的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析儀購(gòu)自西安瑞邁公司；Millipore-Q純水儀購(gòu)自密理博中國(guó)公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器公司；Thermo高速離心機(jī)購(gòu)自賽默飛世爾公司。

1.2 方法

1.2.1儲(chǔ)備液制備

頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0×10-4g/mL)的制備：稱取0.010 0 g的頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)品(華工標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，用適量的去離子水溶解后，定容至100 mL并置于4 ℃冰箱備用。鐵氰化鉀儲(chǔ)備液(2.0×10-3mol/L)的制備：稱取0.065 9 g鐵氰化鉀(上海生工生物工程有限公司)用適量的去離子水溶解后，定容至100 mL并貯于容量瓶備用。魯米諾儲(chǔ)備液(2.0×10-3mol/L)的制備：稱取0.035 4 g魯米諾(上海生工生物工程有限公司)，用適量的0.12 mol/L氫氧化鈉(上海生工生物工程有限公司)溶解后，定容至100 mL，貯于棕色容量瓶中備用，使用時(shí)用0.12 mol/L氫氧化鈉溶液逐級(jí)稀釋。所有試劑均為分析純級(jí)別且未經(jīng)進(jìn)一步純化，實(shí)驗(yàn)中所使用的水均是18 M的去離子水。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法

試劑和樣品溶液(A～D)通過(guò)蠕動(dòng)泵輸送，通過(guò)旋轉(zhuǎn)注射閥(V)將樣品溶液和試劑引入流通檢測(cè)池(E)中，充分混合后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，由于產(chǎn)生信號(hào)微弱，需經(jīng)光電倍增管(PMT)放大后并輸入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行檢測(cè)分析，見(jiàn)圖1。其中，當(dāng)A流路為純水時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)為空白信號(hào)記為I0，當(dāng)A流路為頭孢哌酮時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)為增強(qiáng)信號(hào)記為Ia，那么該體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度則為Ia-I0，記為ΔI。

A：樣品溶液或空白溶液；B：魯米諾溶液；C：氫氧化鈉溶液；D：鐵氰化鉀溶液；P1和P2：蠕動(dòng)泵；V：旋轉(zhuǎn)注射閥；E：流通池；W：廢液池；PMT：光電倍增管；HV：負(fù)高壓；PC：計(jì)算機(jī)。

1.2.3儀器參數(shù)

1.2.3.1采樣時(shí)間的選擇

由于該體系的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)快，因此，選擇合適的采樣時(shí)間就顯得非常重要。本研究評(píng)估了5～20 s儀器采樣時(shí)間對(duì)該體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，參考相關(guān)文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采樣時(shí)間為5 s時(shí)，該反應(yīng)體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度就能夠達(dá)到最大且信號(hào)穩(wěn)定。因此，采樣時(shí)間確定為5 s。

1.2.3.2泵速的選擇

泵速過(guò)大或過(guò)小都可能影響整個(gè)方法的分析性能，為了獲得較低的檢測(cè)限和較寬的線性范圍，本研究觀察了蠕動(dòng)泵的速度對(duì)該體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，參考相關(guān)文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)泵速達(dá)到30 r/min時(shí)，該體系的能夠獲得較高相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度且信號(hào)穩(wěn)定。因此，泵速確定為30 r/min。

1.2.3.3光電倍增管負(fù)高壓的選擇

為了獲得該體系相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的最佳信噪比，本研究評(píng)估了光電倍增管的負(fù)高壓在600～800 V的變化對(duì)該體系相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，參考相關(guān)文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)負(fù)高壓為650 V時(shí)，該體系的信噪比最優(yōu)。因此，光電倍增管負(fù)高壓確定為650 V。

無(wú)障礙導(dǎo)向主要包括以下內(nèi)容：盲人導(dǎo)向帶（盲導(dǎo)帶）、盲文導(dǎo)向牌（盲導(dǎo)牌）、專用電梯（即殘疾人液壓梯）、樓梯升降機(jī)（即樓梯牽引機(jī)）及輪椅坡道、專用電梯及樓梯升降機(jī)吊頂導(dǎo)向燈箱、殘疾人標(biāo)識(shí)牌等。

1.2.4干擾實(shí)驗(yàn)

藥物中包含的各種無(wú)機(jī)物化合物、有機(jī)化合物及其賦形劑和血漿中的一些物質(zhì)可能對(duì)頭孢哌酮測(cè)定的存在影響。為了驗(yàn)證該方法的特異性，在選定的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%的允許量，檢測(cè)樣品中的常見(jiàn)物質(zhì)對(duì)血漿頭孢哌酮測(cè)定的可能影響。

1.2.5樣品分析

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法的可靠性和實(shí)際樣品的檢測(cè)能力。取健康志愿者血漿，用適量去離子水稀釋并加入頭孢哌酮，待用。檢測(cè)時(shí)，用去離子水稀釋至該方法的線性范圍內(nèi)，用建立的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定后，計(jì)算出血漿中頭孢哌酮的含量，最后對(duì)測(cè)定樣品行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1反應(yīng)物混合順序的選擇

該反應(yīng)體系中許多試驗(yàn)條件都影響著相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，其中反應(yīng)物混合順序?qū)ο鄬?duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響比較明顯。研究表明，(頭孢哌酮+魯米諾)+(氫氧化鈉+鐵氰化鉀)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比另兩種(頭孢哌酮+氫氧化鈉)+(魯米諾+鐵氰化鉀)和(頭孢哌酮+鐵氰化鉀)+(氫氧化鈉+魯米諾)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度大且穩(wěn)定。因此，選擇(頭孢哌酮+魯米諾)+(氫氧化鈉+鐵氰化鉀)作為后續(xù)試驗(yàn)的混合順序。

2.1.2魯米諾濃度的選擇

圖2 魯米諾濃度

2.1.3鐵氰化鉀濃度的選擇

該體系中的氧化劑是鐵氰化鉀，很明顯其濃度變化對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有影響。因此，本研究評(píng)估了濃度在8×10-6～30×10-6mol/L的鐵氰化鉀溶液對(duì)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生的影響。結(jié)果如圖3所示，隨著鐵氰化鉀濃度的增加，該體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)，但當(dāng)鐵氰化鉀濃度超過(guò)25×10-6mol/L后，該體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度反而逐漸減弱且穩(wěn)定性變差，見(jiàn)圖3。

圖3 鐵氰化鉀濃度

2.1.4堿性介質(zhì)的選擇

堿性介質(zhì)對(duì)該反應(yīng)體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度也有明顯的影響，氫氧化鈉比碳酸鈉和碳酸氫鈉對(duì)鐵氰化鉀與魯米諾體系的發(fā)光強(qiáng)度增敏作用大且信號(hào)穩(wěn)定，故選用氫氧化鈉作為本研究的堿性介質(zhì)。本研究分析了氫氧化鈉在30×10-3～140×10-3mol/L變化對(duì)該體系相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。研究表明，當(dāng)氫氧化鈉濃度為120×10-3mol/L時(shí)，該體系的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定，見(jiàn)圖4。

圖4 氫氧化鈉濃度

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度

通過(guò)對(duì)影響實(shí)驗(yàn)的主要條件(包括魯米諾的濃度、鐵氰化鉀的濃度及堿性介質(zhì)的選擇及其濃度的確定等)優(yōu)化，確定了最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件。在此條件下，采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血漿中頭孢哌酮的濃度，見(jiàn)圖5。該體系相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與頭孢哌酮在0.2×10-5～5.2×10-5g/mL呈良好線性關(guān)系，該反應(yīng)的線性方程是ΔI=2 672.60+2.76×108 C，相關(guān)系數(shù)為0.986 0，根據(jù)IUPAC建議，以3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算該方法的檢出限為7.1×10-7g/mL，該方法精密度的確認(rèn)是采用多次平行測(cè)定不同濃度的頭孢哌酮方法(濃度為3.0×10-5g/mL，4.0×10-5g/mL，n=11)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.49%和0.51%。因此，該體系所建立的分析方法有良好的重復(fù)性。

圖5 頭孢哌酮的校正曲線

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

300倍的K+、Na+、NH4+、SO42-、NO3-、PO43-，60倍的復(fù)合維生素、復(fù)合氨基酸、淀粉、葡萄糖和糊精均不影響血漿中頭孢哌酮測(cè)定。因此，該方法具有良好的特異性。

2.4 樣品分析結(jié)果

該方法對(duì)血漿中頭孢哌酮回收率在100.5%～101.0%，RSD為1.10%～6.11%,見(jiàn)表1。

3 討 論

本課題組成功構(gòu)建了一種檢測(cè)血漿中頭孢哌酮的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光的新方法。本研究中優(yōu)選了反應(yīng)物的混合順序，通過(guò)對(duì)各反應(yīng)物濃度的逐項(xiàng)研究，確定了在本研究中當(dāng)魯米諾為9×10-6mol/L、鐵氰化鉀為25×10-6mol/L、氫氧化鈉為120×10-3mol/L時(shí)，該體系的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定。同時(shí)還優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)儀器的關(guān)鍵參數(shù)，優(yōu)選出了5 s的采樣時(shí)間，30 r/min的泵速及650 V的負(fù)高壓。在此實(shí)驗(yàn)條件下，該反應(yīng)體系的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與0.2×10-5～5.2×10-5g/mL的頭孢哌酮呈良好的線性關(guān)系。檢出限為7.1×10-7g/mL，該方法的靈敏度高、選擇性強(qiáng)、精密度優(yōu)，并成功地運(yùn)用于人血漿中頭孢哌酮含量測(cè)定。

據(jù)報(bào)道，目前檢測(cè)頭孢哌酮大多采用高效液相色譜法[7-9]、芯片電泳[4]、紫外分光光度法[10]、二維高效液相色譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]等。毫無(wú)疑問(wèn)，以上這些方法可以準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)頭孢哌酮的濃度，但是仍然存在一些明顯缺點(diǎn)，如高效液相色譜法/二維高效液相色譜法不僅需要高純度的有機(jī)溶劑和復(fù)雜的前期樣品準(zhǔn)備，且方法穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法除需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器外，還需要專門人才進(jìn)行操作。因此，建立一種簡(jiǎn)便、靈敏、低成本的檢測(cè)頭孢哌酮的新方法十分必要。

一般來(lái)說(shuō)，化學(xué)發(fā)光是在放熱化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的電磁輻射[14]。近年來(lái)，流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法作為一種定量分析方法，因其具有寬泛的線性范圍、較高的靈敏度及較快的響應(yīng)速度等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品分析等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[15-17]。迄今為止，以魯米諾體系為基礎(chǔ)的頭孢哌酮流動(dòng)注射分析方法還少見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題組建立了以魯米諾體系為基礎(chǔ)的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法分析血漿中頭孢哌酮的濃度。

綜上所述，本文基于頭孢哌酮對(duì)魯米諾與鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系的增敏作用，首次建立了一種流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血漿中頭孢哌酮。相對(duì)于彭國(guó)茳等[3]報(bào)道的傳統(tǒng)的色譜分析法，該方法不僅克服了包括儀器昂貴、預(yù)處理工藝復(fù)雜、操作專業(yè)等明顯缺點(diǎn)，且實(shí)現(xiàn)了操作簡(jiǎn)單、5 s內(nèi)快速完成采樣、低成本的檢測(cè)人血漿中的頭孢哌酮的濃度。為了使該方法達(dá)到最優(yōu)性能，本課題組對(duì)可能影響該方法的實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了適合該方法的最佳魯米諾和鐵氰化鉀的濃度及最佳堿性介質(zhì)及其濃度等，在此實(shí)驗(yàn)條件下，本研究建立了檢測(cè)頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線展示出了較寬的線性范圍(達(dá)1個(gè)數(shù)量級(jí))，較高的靈敏度(檢出限達(dá)7.1×10-7g/mL)及較快的分析速度。該方法不僅可滿足該藥的臨床治療濃度監(jiān)測(cè)，且為其他抗生素的血藥濃度監(jiān)測(cè)和快速分析檢測(cè)提供了一種新思路。更進(jìn)一步講，這種基于鐵氰化鉀與魯米諾化學(xué)發(fā)光體系所建立流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法為生物醫(yī)學(xué)研究、臨床化學(xué)、新藥研發(fā)及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。