雙黃連口服液對(duì)豚鼠宮內(nèi)感染巨細(xì)胞病毒致子代腦損傷的影響

姚 遠(yuǎn)，謝集建，劉彩霞

(十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000)

宮內(nèi)感染是指孕婦在妊娠期間胎盤(pán)或下生殖道致病微生物的逆行擴(kuò)散導(dǎo)致胎兒的宮內(nèi)感染，又稱(chēng)先天性感染或母嬰傳播疾病，在產(chǎn)前或產(chǎn)后對(duì)新生兒生長(zhǎng)發(fā)育均產(chǎn)生不良影響，是引起新生兒腦損傷的重要因素[1-2]。宮內(nèi)感染對(duì)胎兒的影響與致病微生物的種類(lèi)、感染時(shí)孕婦的免疫狀態(tài)、胎齡等均有關(guān)。因妊娠早期胎兒器官發(fā)育較為敏感，故孕早期宮內(nèi)感染導(dǎo)致新生兒生長(zhǎng)發(fā)育障礙、特別是腦損傷最為嚴(yán)重[3]。流行病學(xué)研究顯示，人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染占孕婦原發(fā)感染的1%～4%，24%～75%HCMV感染者可發(fā)生母嬰垂直傳播，是導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)及子代發(fā)育畸形、小頭、癲癇、失明、耳聾、智力障礙甚至死亡的重要病因，而實(shí)施早期感染控制措施可顯著改善妊娠結(jié)局和子代預(yù)后[4]。故篩選一種有效的抗HCMV感染藥物用于防治宮內(nèi)感染有重要意義。雙黃連口服液為臨床常用中成藥，主要由黃芩、連翹和金銀花的提取物精制而成，具有清熱解毒、疏風(fēng)解表之功效及抗炎、抗病毒等作用[5]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，雙黃連口服液可降低HCMV感染小鼠肝組織中HCMV-DNA載量，能明顯減輕HCMV感染引起的急性原發(fā)小鼠肺部炎癥損害并降低小鼠肺組織中HCMV-DNA載量，還具有抑制HCMV復(fù)制、減輕感染小鼠內(nèi)耳炎癥損害而改善小鼠聽(tīng)力的作用[6-8]。但雙黃連口服液對(duì)宮內(nèi)感染HCMV是否有影響尚不明確，因此，本研究通過(guò)建立豚鼠巨細(xì)胞病毒(GPCMV)宮內(nèi)感染模型，觀察了雙黃連口服液干預(yù)后孕鼠的妊娠結(jié)局及子代腦損傷情況，旨在為篩選抗HCMV宮內(nèi)感染藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Hartley豚鼠，雌40只，雄10只，3月齡，體質(zhì)量(325±15)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(鄂)2019-0031]，飼養(yǎng)于十堰市太和醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)期間保證動(dòng)物福利[湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)(福)第2017-59號(hào)]，動(dòng)物自由飲水、勤換墊料保持衛(wèi)生，喂養(yǎng)普通飼料。動(dòng)物房溫度設(shè)定在(21±2)℃。

1.2儀器與試劑 雙黃連口服液(哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20180409)； GPCMV毒株由湖北省病毒研究所提供；聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位儀(上海名元實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：NTS-2000)；水合氯醛(上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：20180409)；乙酰膽堿(Ach)、乙酰膽堿酯酶(AchE)ELISA檢測(cè)試劑盒由南京金益柏生物科技有限公司提供(批號(hào):L038，L1207)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)前豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，白夜自然交替光照。1周后于18:30開(kāi)始配種，豚鼠按雌雄4∶1合籠，過(guò)夜后于第2天8：00檢測(cè)雌鼠是否授精。判斷方法：取雌鼠陰道分泌物，涂片，于顯微鏡下觀察，以見(jiàn)到精子為受孕 0 d。然后選出其中的30只孕鼠，隨機(jī)分為正常組、GPCMV組和雙黃連組，每組10只。將GPCMV毒株按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，病毒滴度為106～107，50%組織培養(yǎng)感染量為T(mén)CID50/0.1 mL。于孕早期 (孕20 d)，GPCMV組和雙黃連組豚鼠腹腔接種1 mL GPCMV(107TCID50)/只，正常組僅腹腔注射1 mL生理鹽水。雙黃連組接種同時(shí)灌胃雙黃連口服液2 mL/kg，GPCMV組和正常組給予生理鹽水2 mL/kg灌胃，1次/d，均連續(xù)灌胃21 d。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1孕鼠一般情況及仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況 觀察孕鼠接種后行為、體質(zhì)量、進(jìn)食及睡眠等情況。豚鼠孕期較長(zhǎng)，約為63(59～72)d，每鼠可產(chǎn)仔鼠1～4只。以59 d(含59 d)前出生的為早產(chǎn)仔鼠，觀察各組早產(chǎn)仔鼠及正常分娩仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況。

1.4.2靜脈血GPCMV-DNA載量 仔鼠于出生后第35天，每組隨機(jī)取10只，采用 RT-PCR法檢測(cè)靜脈血GPCMV-DNA載量。檢測(cè)時(shí)取靜脈血50 μL，準(zhǔn)確加入10 μL DNase，混勻，37 ℃消化16 h后用乙戊醇抽提GPCMV-DNA。引物序列：上游引物為5’-AATAG AA CCTATG CCTCA G-3’，下游引物為5’-GAATACCC GTA ATCGTAAG -3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)231 bp，2%瓊脂糖凝膠電泳判斷GPCMV-DNA載量。

1.4.3靜脈血Ach水平和AchE活性 取出生后第35天仔鼠靜脈血0.1 mL，采用ELISA法、參考試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Ach水平和AchE活性。

1.4.4腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位(BAEP) 參考文獻(xiàn)[9]方法對(duì)出生后第35天仔鼠進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)前腹腔注射10%水合氯醛，使動(dòng)物進(jìn)入深睡眠，接NTS-2000肌電圖與聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位儀檢測(cè)BAEP。地線粘于仔鼠后肢裸露部位、記錄電極用4.5號(hào)針頭插入仔鼠頭頂部中央?yún)^(qū)，參考電極置于雙耳后乳突處，用聽(tīng)力學(xué)耳機(jī)給予動(dòng)物單耳濾波短聲刺激，對(duì)側(cè)耳給予白噪聲遮蔽，參數(shù)設(shè)置：刺激頻率11 Hz，脈沖寬100 ms，刺激強(qiáng)度60 dB，帶通范圍100～2 000 Hz，分析時(shí)間10 ms，平均疊加996次，每耳測(cè)試3次取均值。

2 結(jié) 果

2.1各組孕鼠一般情況及仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況 正常組孕鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，均無(wú)早產(chǎn)，存活仔鼠36只，出生時(shí)體質(zhì)量(94.69±1.73)g。 GPCMV組孕鼠接種GPCMV后全部感染，7 d后均出現(xiàn)病毒血癥的表現(xiàn)，表現(xiàn)為躁動(dòng)、被毛聳立、嗜咬籠架、少食多睡現(xiàn)象，體質(zhì)量至產(chǎn)仔時(shí)不增或少增等，有3只孕鼠體質(zhì)量甚至下降，接種17 d后死亡1只；4只孕鼠早產(chǎn)；存活仔鼠15只，出生時(shí)體質(zhì)量(78.70±3.99)g，均感染GPCMV。雙黃連組孕鼠GPCMV感染率為80%(8/10)，病毒血癥的表現(xiàn)較GPCMV組輕，孕鼠無(wú)死亡；2只孕鼠早產(chǎn)；存活仔鼠19只，出生時(shí)體質(zhì)量(85.56±4.47)g，13只(68.4%)感染GPCMV。GPCMV組和雙黃連組存活仔鼠均明顯少于正常組(P均<0.05)，仔鼠體質(zhì)量均明顯低于正常組(P均<0.05)。雙黃連組孕鼠GPCMV感染率、早產(chǎn)孕鼠率及仔鼠GPCMV感染率均明顯低于GPCMV組(P均<0.05)，存活仔鼠數(shù)和仔鼠體質(zhì)量明顯高于GPCMV組(P均<0.05)。

2.2各組靜脈血GPCMV-DNA載量及Ach水平、AchE活性比較 GPCMV組靜脈血GPCMV-DNA載量和AchE活性均明顯高于正常組(P均<0.05)，Ach水平明顯低于正常組(P<0.05)；雙黃連組靜脈血GPCMV-DNA載量和AchE活性均明顯低于GPCMV組(P均<0.05)，Ach水平明顯高于GPCMV組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組仔鼠靜脈血GPCMV-DNA載量及Ach水平、AchE活性比較

2.3各組BAEP測(cè)試結(jié)果比較 GPCMV組仔鼠Ⅲ波、Ⅴ波潛伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰間期均明顯長(zhǎng)于正常組(P均<0.05)，Ⅲ波、Ⅴ波波幅均明顯高于正常組(P均<0.05)。雙黃連組仔鼠Ⅲ波、Ⅴ波潛伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰間期均明顯短于GPCMV組(P均<0.05)，Ⅲ波、Ⅴ波波幅均明顯低于GPCMV組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組仔鼠BAEP測(cè)試結(jié)果比較

3 討 論

宮內(nèi)感染是造成子代腦損傷的主要致病因素，其中又以缺氧缺血性腦病為多見(jiàn)，也是導(dǎo)致子代死亡和后遺癥的重要病因之一[10-11]。缺氧缺血性腦病的發(fā)生多與宮內(nèi)病毒感染后胎兒腦局部血流減少或暫停有關(guān)，胎兒腦組織會(huì)因缺氧導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[12]。宮內(nèi)感染引起的缺氧缺血性腦損傷也是導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡的主要原因[13]，海馬神經(jīng)元凋亡會(huì)造成樹(shù)突軸突發(fā)育不良，神經(jīng)元數(shù)量減少，還可直接造成突觸生成受阻和功能性修飾障礙，從而影響子代近期及遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)記憶功能[14]。在學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中，海馬神經(jīng)元負(fù)責(zé)各種信號(hào)傳遞，在這一過(guò)程中，膽堿能纖維突觸釋放神經(jīng)遞質(zhì)Ach，而Ach傳導(dǎo)的信號(hào)與認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切，記憶能力的強(qiáng)弱主要決定于膽堿能纖維是否豐富和Ach水平[15]。AchE為水解突觸上Ach的酶，二者處于動(dòng)態(tài)平衡。AchE活性過(guò)高會(huì)水解突觸上的Ach，而Ach過(guò)多消耗會(huì)造成中樞神經(jīng)損傷，導(dǎo)致認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶功能下降，提高海馬組織Ach水平可增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶功能[16-17]。因此控制早期宮內(nèi)感染，抑制AchE活性可間接增加Ach，這有利于減輕腦損傷，促進(jìn)子代近期及遠(yuǎn)期智力發(fā)育。

由于GPCMV感染具有動(dòng)物種族易感性，且可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播，感染后的表現(xiàn)與HCMV感染極為接近，故目前在相關(guān)研究中多采用GPCMV宮內(nèi)感染模型來(lái)探討HCMV宮內(nèi)感染機(jī)制[18]。本實(shí)驗(yàn)亦選擇此模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示雙黃連組孕鼠GPCMV感染率、早產(chǎn)孕鼠率、仔鼠GPCMV感染率、仔鼠靜脈血GPCMV-DNA載量均明顯低于GPCMV組，存活仔鼠數(shù)、仔鼠體質(zhì)量均明顯高于GPCMV組。提示雙黃連口服液不但可降低孕鼠GPCMV感染率，還可抑制子代感染。由于Ach主要在腦膽堿能纖維突觸上合成和釋放，故檢測(cè)子代Ach水平可一定程度上反映其近期和遠(yuǎn)期智力發(fā)育情況。本實(shí)驗(yàn)中雙黃連組仔鼠靜脈血AchE活性明顯低于GPCMV組， Ach水平明顯高于GPCMV組，提示雙黃連口服液通過(guò)抑制AchE活性而間接降低AChE對(duì)Ach的水解作用，使Ach水平提高，這有利于改善子代因?qū)m內(nèi)感染GPCMV而造成的腦損傷。

BAEP檢測(cè)是記錄聲刺激引起的神經(jīng)沖動(dòng)在腦干聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路上的電活動(dòng)的重要方法， 所記錄到的電位活動(dòng)能客觀反映聽(tīng)神經(jīng)到丘腦水平聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)功能，是判斷腦干及聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路是否受損的敏感指標(biāo)，其不僅可早期、準(zhǔn)確地診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，判斷聽(tīng)力損傷程度，還可對(duì)損傷部位進(jìn)行定位，為評(píng)估腦干和大腦損傷的重要指標(biāo)[19-21]。一般情況下，聽(tīng)神經(jīng)損傷時(shí)Ⅲ波、Ⅴ波波幅異常升高，Ⅲ波、Ⅴ波潛伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰間期會(huì)異常延長(zhǎng)，這在本實(shí)驗(yàn)GPCMV組得以體現(xiàn)，說(shuō)明造模是成功的。而雙黃連組仔鼠Ⅲ波、Ⅴ波潛伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰間期均明顯短于GPCMV組，Ⅲ波、Ⅴ波波幅明顯低于GPCMV組，說(shuō)明雙黃口服液可以改善仔鼠聽(tīng)神經(jīng)發(fā)育，遏制聽(tīng)力損傷。

綜上所述，雙黃連口服液早期干預(yù)可抑制GPCMV引起宮內(nèi)感染，降低早產(chǎn)率及正常分娩的子代鼠因GPCMV感染而導(dǎo)致腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)，可能與雙黃連口服液可抑制GPCMV復(fù)制，阻止病毒母嬰垂直傳播，降低GPCMV-DNA載量，抑制AchE活性，從而減弱對(duì)子代神經(jīng)發(fā)育的影響有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。