子癇前期患者血清代謝物水平及其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究*

樊娜娜,詹 瑛△,徐 文,王 青,種瑩瑩,劉世國

青島大學(xué)附屬醫(yī)院:1.產(chǎn)科;2.藥學(xué)部,山東青島 266003;3棗莊市婦幼保健院產(chǎn)科,山東棗莊 277000

子癇前期是在妊娠20周以后發(fā)生的以高血壓和蛋白尿(或臟器損害)為特征的多器官疾病，可嚴(yán)重影響母嬰健康。將高血壓和蛋白尿作為子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)，遠不足以體現(xiàn)子癇前期的病理生理學(xué)特征[1]，且診斷后再進行干預(yù)為時已晚。目前認為，子癇前期發(fā)病主要與胎盤淺著床、免疫反應(yīng)、血管內(nèi)皮受損、遺傳因素、炎性反應(yīng)、胰島素抵抗等有關(guān)[2]。有研究者報道甜菜堿具有抗氧化、降壓作用,脯氨酸對機體應(yīng)激有保護活性,溶血性磷脂酰膽堿可損傷內(nèi)皮細胞[3-4]。這些小分子可能參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。有學(xué)者用電噴霧液質(zhì)聯(lián)用四級桿飛行時間質(zhì)譜(LC-Q-TOF)設(shè)備監(jiān)測出甜菜堿和脯氨酸是診斷重度子癇前期潛在靈敏和特異的生物標(biāo)志物[5]，譚兵等[6]用LC-Q-TOF設(shè)備篩選出1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿(LPC18:0)在重度子癇前期孕婦及健康孕婦存在差異。L-異亮氨酸是人體內(nèi)必需支鏈氨基酸，丙氨酸水平增加導(dǎo)致兒茶酚胺水平升高，有研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清L-異亮氨酸和苯丙氨酸水平升高[7]。然而LC-Q-TOF設(shè)備側(cè)重于定性分析，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)專注于定量分析。LC-MS/MS是一種代謝組學(xué)技術(shù)，其代謝譜的分析技術(shù)是針對性的，對預(yù)設(shè)代謝物進行定量或半定量測定，驗證出有意義的生物標(biāo)志物，而且在測定標(biāo)本前經(jīng)過系統(tǒng)的方法學(xué)驗證，結(jié)果更準(zhǔn)確。本文利用LC-MS/MS對可能與子癇前期有關(guān)的小分子代謝物如甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0、L-異亮氨酸、苯丙氨酸進行驗證性研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5—12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院就診的子癇前期患者共40例作為觀察組，包括輕度子癇前期組孕婦20例，重度子癇前期組孕婦20例，另選取同期健康孕婦20例作為對照組。重度子癇前期、輕度子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)[8]，子癇前期定義為妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mm Hg和(或)舒張壓≥90 mm Hg，且伴有下列任一項：尿蛋白≥0.3 g/24 h，或尿蛋白/肌酐比值≥0.3，或隨機尿蛋白≥(+)，血壓和(或)尿蛋白水平持續(xù)升高，發(fā)生母體器官功能受損或胎盤-胎兒并發(fā)癥是子癇前期病情向重度發(fā)展的表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性高血壓、腎病、糖尿病、心血管疾病、肝病、多胎妊娠、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病等。所有納入研究的孕婦均簽署了知情同意，并經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 Agilent 1290Ⅱ高效液相色譜儀(配備G7120高壓二元泵，G7167B自動進樣器，G7116B柱溫箱，美國Agilent 公司)；API4000+三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，Analyst 1.6.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件(美國AB公司)。

甜菜堿(純度99%)、脯氨酸(純度99%)、苯丙氨酸(純度99%)、LPC18:0(純度>99%)、L-異亮氨酸(純度99%)由上海蔚霆生物科技有限公司提供；甲醇、乙腈和甲酸(色譜純,德國Merck公司)。

1.3方法

1.3.1樣品預(yù)處理 采集研究對象晨起空腹靜脈血液5 mL于促凝管中，3 000 r/min速度的條件下離心10 min，取上清液作為樣品儲存于-80 ℃冰箱中。將樣本血清4 ℃解凍后,取100 μL與30 μL甲醇混合，渦旋振蕩30 s后,4 ℃下靜置5 min。將混合物在4 ℃，離心半徑為8 cm，12 000 r/min的條件下離心5 min，取5 μL上清液得到待測樣品。

1.3.2樣本分析 色譜條件色譜柱為Ultimate AQ-C18 column(3.0 μm,2.1 mm×100 mm，上海月旭科技有限公司)；流動相乙腈(A)-0.1%的甲酸溶液(B)梯度洗脫(0.0～0.5 min，8% A；0.5～1.0 min，8%→100% A；1.0～6.0 min，100% A)；流速為0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量為5 μL。質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(ESI)。(1)正離子模式，質(zhì)譜參數(shù)：碰撞氣6×104Pa，氣簾氣2×105Pa，霧化氣4.48×105Pa,輔助氣4.48×105Pa，噴霧電壓5 500 V，霧化溫度550 ℃。(2)負離子模式,質(zhì)譜參數(shù)：碰撞氣6×104Pa，氣簾氣2×105Pa，霧化氣4.48×105Pa,輔助氣4.48×105Pa,噴霧電壓4 500 V,霧化溫度550 ℃。甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0、L-異亮氨酸的質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源為正離子模式，苯丙氨酸的質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源為負離子模式，具體多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)條件見表1。

表1 甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0、L-異亮氨酸、苯丙氨酸的 MRM條件

2 結(jié) 果

2.1各組孕婦臨床資料比較 重度子癇前期組、輕度子癇前期組在年齡、體質(zhì)量指數(shù)、分娩孕周方面與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組臨床資料比較

2.2典型色譜圖 甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0、L-異亮氨酸、苯丙氨酸典型色譜圖見圖1。

2.3觀察組和對照組血清指標(biāo)水平比較 觀察組血清LPC18:0水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4各組血清指標(biāo)水平比較 重度子癇前期組血清甜菜堿、脯氨酸水平低于輕度子癇前期組、對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；重度子癇前期組、輕度子癇前期組血清LPC18:0水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組血清苯丙氨酸、L-異亮氨酸水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3 觀察組和對照組血清指標(biāo)水平比較(μg/mL)

表4 各組血清指標(biāo)水平比較(μg/mL)

注： A為甜菜堿、B為脯氨酸、C為LPC18:0、D為L-異亮氨酸、E為苯丙氨酸；1為對照組、2為觀察組。

2.5血清甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0與子癇前期的病情程度相關(guān)性分析 血清甜菜堿與子癇前期的病情程度呈負相關(guān)(r=-0.317,P<0.05)，血清LPC18:0與子癇前期的病情程度呈正相關(guān)(r=0.618,P<0.05),血清脯氨酸與子癇前期的病情程度呈弱相關(guān)(r=-0.288,P=0.026)。

2.6血清甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0 診斷重度子癇前期患者的效能 應(yīng)用重度子癇前期組和健康對照組血清甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0 3種代謝物水平制作診斷重度子癇前期患者的ROC曲線，血清甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0對于重度子癇前期患者有一定的診斷價值。3種代謝物聯(lián)合檢測重度子癇前期患者的AUC為0.907，具有較高的診斷價值。見表5。

表5 3種代謝物單獨及聯(lián)合檢測對重度子癇前期患者的診斷價值

3 討 論

子癇前期是發(fā)生在妊娠中晚期的疾病，但導(dǎo)致其發(fā)病的分子變化在妊娠早期就已經(jīng)開始[9]。由于重度子癇前期嚴(yán)重影響母嬰安全及預(yù)后，因此，尋找診斷重度子癇前期的標(biāo)志物，對早期診斷及干預(yù)具有重要意義。代謝組學(xué)研究的一般為小分子，而這些小分子恰恰能夠真實反映人體各系統(tǒng)的生理、病理狀態(tài),為臨床診治提供有力依據(jù)[10]。從本研究可以看出子癇前期患者與健康妊娠女性在血清代謝物上有區(qū)別。這些代謝物可能對子癇前期的病情診斷、評估、藥物干預(yù)具有指導(dǎo)意義。

甜菜堿是甘氨酸的三甲基衍生物，可能通過減少機體缺氧-再灌注損傷[11]，產(chǎn)生氧化應(yīng)激的抗氧化作用[12]，作為一種保護性因子參與胎盤缺血、缺氧，減少氧化應(yīng)激等一系列反應(yīng)的過程，從而達到抗氧化、降壓作用[13]，故甜菜堿可能參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。ODIBO等[14]通過UPLC-MS方法檢測血清中酰肉堿和氨基酸明顯升高。KOSTER等[15]利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析子癇前期和健康孕婦的血清樣品發(fā)現(xiàn)血清牛磺酸及硬脂酰肉毒堿升高顯著，而肉堿的合成需要甜菜堿的參與，故在子癇前期孕婦血清中，可出現(xiàn)甜菜堿的消耗過多而減低。本研究驗證了重度子癇前期孕婦血清甜菜堿水平明顯降低，說明甜菜堿在子癇前期的發(fā)病過程中起重要作用，可能作為一種保護性成分參與病情的發(fā)生發(fā)展，并且其檢測重度子癇前期患者的AUC為0.725，靈敏度為70%，特異度為75%，對重度子癇前期患者有一定的診斷效能。本研究顯示重度子癇前期孕婦甜菜堿水平明顯低于輕度子癇前期組與對照組,且相關(guān)性分析結(jié)果證實這種代謝物與子癇前期病情程度呈負相關(guān),說明妊娠期間這種代謝物水平降低可導(dǎo)致子癇前期發(fā)病風(fēng)險增加，檢測其水平可評估子癇前期的病情嚴(yán)重程度。另甜菜堿已被證明可以保護內(nèi)臟，改善心血管系統(tǒng)，提高運動能力，是預(yù)防慢性病的重要營養(yǎng)素[16]。有研究者通過對一組病態(tài)模型小鼠補充甜菜堿后，小鼠的多種促炎細胞因子的表達和血液高凝狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)[17]。子癇前期疾病發(fā)生也與多種促炎因子表達有關(guān)，因此，補充甜菜堿有望作為治療重度子癇前期的新靶點，治療或延緩疾病子癇前期的進展，改善預(yù)后，這需要進一步的研究。

TANG等[18]的研究表明脯氨酸是一種容易釋放的應(yīng)激底物，通過調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子參與缺氧性疾病的發(fā)生、發(fā)展。子癇前期發(fā)病可能是一種胎盤缺氧性疾病[19]，脯氨酸可能作為一種應(yīng)激保護活性作用的因子參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[20]。本研究中脯氨酸在重度子癇前期孕婦血清中水平明顯降低，檢測重度子癇前期患者的AUC為0.722，靈敏度為60%，特異度為85%。但是目前關(guān)于脯氨酸的研究不多，對機體的應(yīng)激保護及減少機體缺氧等作用具體機制不清，需要進一步研究證實。

LPC18:0屬于溶血性磷脂酰膽堿一種，近期的研究發(fā)現(xiàn)溶血性磷脂酰膽堿可促進平滑肌細胞的增殖，增加血管剪應(yīng)，損傷內(nèi)皮系統(tǒng)依賴的血管舒張功能，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的凋亡，損傷血管皮組織的連續(xù)性，促進血管炎性反應(yīng)并影響了血小板聚集及血栓形成的過程[21-23]?？烧T導(dǎo)淋巴細胞和巨噬細胞遷移，增加促炎細胞因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進細胞凋亡，從而聚集炎癥，促進子癇前期的發(fā)展[24]。溶血磷脂酰膽堿作為最簡單的水溶性甘油磷脂廣泛參與脂質(zhì)代謝，其異常說明了在子癇前期早期可能發(fā)生了脂代謝紊亂，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示輕度子癇前期組孕婦血清LPC18:0水平明顯高于對照組,并且LPC18:0有一定的診斷效能，其檢測重度子癇前期患者的AUC為0.805，靈敏度為90%，特異度為65%。相關(guān)性分析顯示血清LPC18:0水平與子癇前期的病情程度呈正相關(guān),即LPC18:0水平越高,孕婦發(fā)生子癇前期風(fēng)險越大,病情越重，故臨床可根據(jù)其水平對病情進行預(yù)測，從而在疾病早期進行干預(yù)。根據(jù)以上研究，研究者有望在臨床治療子癇前期患者時通過降低這些溶血性磷脂水平，從而干預(yù)相關(guān)的脂質(zhì)代謝通路，改善患者的癥狀。

血清甜菜堿、LPC18:0與子癇前期的病情程度具有相關(guān)性，測定其水平變化能判斷子癇前期病情，在疾病早期進行干預(yù)及指導(dǎo)后續(xù)治療。血清甜菜堿、脯氨酸、LPC18:0 檢測重度子癇前期患者的AUC分別為0.725、0.722和0.805，對于重度子癇前期患者具有一定的診斷價值，3種代謝物聯(lián)合檢測重度子癇前期患者的AUC為0.907，具有較高的診斷價值，可更好地應(yīng)用于臨床；本研究未驗證出 L-異亮氨酸及苯丙氨酸在子癇前期代謝中的特異性，考慮樣本量小，還需進一步擴大樣本量及檢測范圍。隨著研究進展，聯(lián)合不同代謝物及其他指標(biāo)診斷子癇前期，可更好地發(fā)揮其臨床應(yīng)用價值。