甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢方法研究

王波 黃忠勤 丁震乾 常勇 周澗楠 蘇在興 周興根

摘要 [目的]建立甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢體系，為甘薯黑斑病品種抗性鑒定以及藥劑生物測(cè)定奠定基礎(chǔ)。[方法]采用3種方法制備甘薯黑斑病菌甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）孢子懸浮液，研究甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢方法。[結(jié)果]洗滌PDA和洗滌薯片培養(yǎng)5～ 6 d后鏡檢孢子懸浮液，一個(gè)視野內(nèi)孢子數(shù)分別約為93、95個(gè)。利用PS培養(yǎng)液培養(yǎng)1、2、4 d后鏡檢孢子數(shù)分別為 211、136、137個(gè)。[結(jié)論]采用PS液體培養(yǎng)基在特定培養(yǎng)條件下?lián)u培1 d即可獲得大量高濃度孢子懸浮液，極大地縮短了黑斑病菌產(chǎn)孢時(shí)間，顯著提高了產(chǎn)孢量，且不易污染。

關(guān)鍵詞 甘薯黑斑病;孢子懸浮液;制備方法

中圖分類號(hào) S435.311文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）34-0127-03

甘薯（Ipomoea batatas Lam.）在我國每年的種植面積約500萬hm 占世界甘薯種植面積的50%左右[1]。甘薯黑斑?。╯weeppotato black rot）是甘薯栽培和貯藏中的主要病害之一，在世界各甘薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其病原菌為甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted），該菌分布廣泛、種群分化復(fù)雜，主要為害幼苗莖基部及塊根組織，引起死苗、爛床、爛窖，對(duì)甘薯生產(chǎn)影響極大[2]。帶有黑斑病菌的病薯中含有甘薯黑疤霉酮等物質(zhì)，家畜食用后可引起中毒癥狀[3];用病薯做發(fā)酵原料會(huì)延緩發(fā)酵過程，降低乙醇產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴(yán)重制約甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，甘薯黑斑病的防治主要是以選育抗病品種及化學(xué)殺菌劑防治為主[4-5]。而甘薯抗病育種及藥劑篩選都需要大量的孢子懸浮液進(jìn)行試驗(yàn)。目前主要采用薯片法和黑斑病菌平板洗滌孢子法制備孢子懸浮液，但這2種方法耗時(shí)較長。同時(shí)，薯片法制備的孢子懸浮液由于無法保證全程無菌操作，不可避免地會(huì)被雜菌污染[6];而采用傳統(tǒng)的從黑斑病平板中洗滌孢子過濾的方法耗時(shí)長效率低，無法快速大量地為藥劑篩選和抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供試驗(yàn)所需的分生孢子懸浮液。因此，建立一種甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢的技術(shù)體系是甘薯黑斑病精準(zhǔn)抗病鑒定、甘薯黑斑病藥劑生物測(cè)定以及抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究的重要條件之一。筆者研究甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢方法，旨在建立一種新型的甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢的技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑斑病菌的分離和純化：從甘薯窖中采集黑斑病發(fā)病薯塊，采用組織分離法分離甘薯黑斑病菌。首先清洗薯塊表面，然后用自來水流水沖洗約20 min，將帶病薯塊取出擦干置于超凈工作臺(tái)中，取黑斑病病健交接部位置于75%乙醇中進(jìn)行表面消毒，再用0.1 %的升汞消毒后，用滅菌水清洗干凈后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板中培養(yǎng)，經(jīng)分離純化以及柯赫氏法則驗(yàn)證確定后保留菌株。該菌株分離并保存于4 ℃冰箱中。

黑斑病菌培養(yǎng)：打取PDA平板中的菌碟，每個(gè)三角瓶中接種10 ～ 12個(gè)菌碟，將接種好的三角瓶置于30 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min搖培24 h。

孢子懸浮液制備：將搖培獲得的懸浮液用紗布過濾去除菌絲后，鏡檢測(cè)定孢子液濃度，并采用無菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至試驗(yàn)所需即可。

PS培養(yǎng)液的制備：馬鈴薯20 g加入1 L超純水煮沸至馬鈴薯完全爛軟，紗布過濾后加入15 g蔗糖，加超純水定容至1 L，每個(gè)三角瓶分裝30 mL，然后置于121 ℃高壓滅菌15 min備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘薯黑斑病菌最佳產(chǎn)孢方法篩選。采用PDA平板接種活化后的黑斑病菌菌碟，將接種好的平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～ 6 d，采用30 mL無菌水洗滌平板表面孢子，紗布過濾去除菌絲后，測(cè)量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個(gè)視野內(nèi)孢子數(shù)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)制片3張。該方法設(shè)為對(duì)照組①。

選擇大小適中、無病蟲害侵染的薯塊洗凈自然晾干后，采用75 %乙醇表面消毒后晾干，切成厚約1 cm的薯片，把切好的薯片放入配好的孢子懸浮液內(nèi)浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，期間采用紙巾或棉花團(tuán)保濕紙，將接種的薯塊置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，薯片表面長滿淺灰色的分生孢子，用30 mL無菌水沖洗，紗布過濾去除菌絲后，測(cè)量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個(gè)視野內(nèi)孢子數(shù)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)制片3張。該方法設(shè)為對(duì)照組②。

采用馬鈴薯20 g加入1 L超純水煮沸至馬鈴薯完全爛軟，紗布過濾后加入15 g蔗糖，用超純水將培養(yǎng)液補(bǔ)足至1 L，每個(gè)三角瓶分裝30 mL，然后121 ℃高壓滅菌15 min備用。打取PDA平板中的菌碟，每個(gè)三角瓶中接種10～12個(gè)菌碟，將接種好的三角瓶置于30 ℃恒溫?fù)u床中120 r/min搖培，1 d后取出，測(cè)量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個(gè)視野的孢子數(shù)。該方法為PS液體培養(yǎng)法。

1.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間PS液體培養(yǎng)法產(chǎn)孢量測(cè)定。采用上述PS液體培養(yǎng)法，培養(yǎng)甘薯黑斑病菌。每1、2、3、4 d取出3瓶培養(yǎng)液，每瓶培養(yǎng)液制片3張，測(cè)量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個(gè)視野的孢子數(shù)，不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)孢數(shù)。以上述對(duì)照組①和對(duì)照組②方法培養(yǎng)5～6 d作為處理對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳產(chǎn)孢方法篩選

由圖1可知，培養(yǎng)5～ 6 d后孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個(gè)視野內(nèi)孢子數(shù)約為93個(gè)。由圖2可知，培養(yǎng)5～ 6 d后鏡檢孢子數(shù)約為95個(gè)，且該方法存在雜菌污染的可能性。PS液體培養(yǎng)法見圖3。由圖3可知，培養(yǎng)1 d后鏡檢孢子數(shù)為211個(gè)。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間PS液體培養(yǎng)法產(chǎn)孢量

由圖4可知，使用PS液體培養(yǎng)基在特定培養(yǎng)條件下?lián)u培1 d，在放大200倍顯微鏡下每個(gè)視野均可觀察到211個(gè)孢子，與采用對(duì)照①和對(duì)照②培養(yǎng)5～6 d制備的孢子懸浮液制備方法下平均每個(gè)視野可觀察到的孢子數(shù)93和95差異極顯著;同時(shí)，對(duì)比采用PS液體培養(yǎng)基搖培0、1、2和4 d所制備的孢子懸浮液，發(fā)現(xiàn)搖培2和4 d后獲得的孢子懸浮液在同樣放大倍數(shù)的顯微鏡下平均每個(gè)視野觀察到的孢子數(shù)分別為136和137，方差分析結(jié)果表明，PS液體培養(yǎng)基搖培2和4 d比搖培1 d所得到的孢子懸浮液中平均每個(gè)視野的孢子數(shù)211顯著降低，從圖5可以看出，培養(yǎng)4 d黑斑病菌孢子已有部分開始消解。

3 結(jié)論與討論

甘薯黑斑病菌侵染薯塊后會(huì)形成黑色凹陷病斑，并在病斑及周圍產(chǎn)生有毒物質(zhì)，是造成甘薯爛窖的主要原因之一[7-8]。因此，建立甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢的技術(shù)體系是甘薯黑斑病精準(zhǔn)抗病鑒定、甘薯黑斑病藥劑生物測(cè)定以及抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究的基礎(chǔ)之一。該研究通過對(duì)比3種甘薯黑斑病產(chǎn)孢方法，建立一種新型的甘薯黑斑病產(chǎn)孢體系。該試驗(yàn)采用的PS液體培養(yǎng)基在特定培養(yǎng)條件下?lián)u培1 d即可獲得大量高濃度孢子懸浮液，極大地縮短了黑斑病菌產(chǎn)孢時(shí)間，顯著提高了產(chǎn)孢量;同時(shí)由于培養(yǎng)期間全程無菌操作條件簡易可控，因此病原菌不易被污染，可以有效避免薯片法產(chǎn)孢培養(yǎng)的薯片腐爛、雜菌多、時(shí)間長等引起孢子液不純，使甘薯黑斑病抗性鑒定和甘薯黑斑病藥劑生物測(cè)定試驗(yàn)更為精準(zhǔn)高效。

參考文獻(xiàn)

[1]馬代夫，李洪民，唐君，等.中國甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[C]//馬代夫.甘薯與糧食能源安全——中國徐州第四屆國際甘薯學(xué)術(shù)討論會(huì)暨第四屆中日韓甘薯學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010：3-10.

[2]HALSTED B D.Some fungous diseases of the sweet potato：The black rot [J].New Jersey agriculture experiment station bulletin， 1890，76：7-14.

[3]孫厚俊，劉美艷，宗瑋瑋，等.黑斑病對(duì)甘薯體內(nèi)幾種保護(hù)酶活性的影響[J].廣西農(nóng)學(xué)報(bào)，201 26（3）：14-16.

[4]謝一芝，邱瑞鐮，戴起偉，等.甘薯抗黑斑病育種研究進(jìn)展[J].雜糧作物，1997（2）：22-24.

[5]謝一芝，尹晴紅，戴起偉，等.甘薯品種抗黑斑病鑒定及其遺傳趨勢(shì)[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4（4）：311-313.

[6]張德勝，張永超，喬奇，等.10種殺菌劑對(duì)甘薯黑斑病的毒力及聯(lián)合毒力[J].農(nóng)藥，201 51（6）：452-454.

[7]賈趙東，郭小丁，尹晴紅，等.甘薯黑斑病的研究現(xiàn)狀與展望[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（1）：144-147.

[8]王碩.甘薯ACE抑制肽的制備及其降血壓活性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.