PD-L1在NSCLC組織中的表達(dá)及對(duì)患者預(yù)后影響的多因素分析

曾雪華， 吳 剛， 祁永健

(江蘇省中醫(yī)院南院呼吸科，江蘇省南京市 210029)

肺癌是臨床常見的胸部惡性腫瘤，占到所有癌癥新發(fā)病例的17%，也是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者死亡的首要原因。近年來肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占到原發(fā)性肺癌總數(shù)的80%～85%，其中近三分之二患者確診時(shí)已處于中晚期，因此早期診斷和盡早治療成為改善肺癌患者預(yù)后的重中之重[1]。研究顯示協(xié)同刺激因子和相關(guān)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中具有重要作用，表達(dá)異常則與腫瘤免疫逃逸之間關(guān)系密切，程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1,PD-L1)屬于協(xié)同刺激分子超家族主要成員，會(huì)造成人體免疫抑制微環(huán)境抑制T、B淋巴細(xì)胞功能，造成腫瘤細(xì)胞惡性增殖[2]。本研究分析了PD-L1在NSCLC組織中表達(dá)特點(diǎn)及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性，以期為臨床提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性選取本院病理科收集的2016年1月—2017年1月90例NSCLC組織(NSCLC組)、40例癌旁正常肺組織作為癌旁正常組。NSCLC組，男56例、女34例，年齡41～78歲，平均(62.7±10.8)歲，90例NSCLC患者病理學(xué)分期依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟第8版腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor node metastasis，TNM)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期患者20例、Ⅱ期患者27例、Ⅲ期患者30例、Ⅳ期患者13例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例；腫瘤直徑≥5 cm 17例。癌旁正常組，男23例、女17例，年齡44～75歲，平均(60.8±11.8)歲。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①NSCLC患者的診斷依據(jù)《外科學(xué)》人民衛(wèi)生出版社第八版；②患者年齡19～79歲；③肺癌組織均經(jīng)過病理學(xué)檢查證實(shí)；④本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性肺癌；②術(shù)后復(fù)發(fā)性肺癌；③獲取癌組織標(biāo)本前具有放化療病史；④臨床資料、病歷資料缺失，難以納入統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 免疫組化染色

制作石蠟切片、烤片待用，常規(guī)二甲苯脫蠟并水化，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化酶，隨后進(jìn)行抗原修復(fù)，采用檸檬酸緩沖液作為抗原修復(fù)液，在切片加入10%正常山羊血清封閉，清除血清后甩去緩沖液，加入0.04%二氨基聯(lián)苯胺、0.03%過氧化氫溶液顯色，采用雙蒸餾水沖洗終止染色，蘇木精復(fù)染30 s后使用雙蒸餾水沖洗脫水透明，顯微鏡下進(jìn)行觀察。PD-L1試劑盒由上海潤(rùn)裕生物科技有限公司提供，克隆號(hào)22C3。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

免疫組化染色切片的結(jié)果判定：PD-L1蛋白主要在NSCLC癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。①依據(jù)染色深淺程度進(jìn)行評(píng)分：0分、1分、2分、3分分別對(duì)應(yīng)無著色、淡黃色、棕黃色、褐色甚至黑色；②依據(jù)染色細(xì)胞的占比情況進(jìn)行評(píng)分：陽性染色細(xì)胞占比≤10%則評(píng)為1分、染色細(xì)胞比例范圍10%～50%評(píng)為2分、染色細(xì)胞占比范圍50%～75%評(píng)為3分、當(dāng)染色細(xì)胞占比>75%評(píng)分為4分。蛋白染色深淺評(píng)分及染色細(xì)胞占比評(píng)分相乘為免疫組化染色的總分，<3分為陰性“-”；3～5分為陽性“+”；6～9分為較強(qiáng)陽性“++”；>9分為強(qiáng)陽性“+++”。

1.5 PD-L1蛋白陽性判定及隨訪

分析NSCLC病灶組織標(biāo)本中的PD-L1蛋白表達(dá)與相關(guān)參數(shù)的關(guān)系，NSCLC組織中PD-L1蛋白陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。對(duì)所有患者進(jìn)行電話聯(lián)系，跟蹤隨訪，隨訪周期3年。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PD-L1蛋白陽性表達(dá)率情況

90例NSCLC中PD-L1蛋白表達(dá)陽性72例為PD-L1陽性組，表達(dá)陰性18例為PD-L1陰性組。NSCLC組標(biāo)本中PD-L1蛋白陽性表達(dá)率80.00%，癌旁正常組陽性表達(dá)率5.00%，NSCLC組高于癌旁正常組(χ2=63.526，P<0.05，表1，圖1)。

表1 PD-L1蛋白陽性表達(dá)率情況對(duì)比 單位：例(%)

圖1 PD-L1蛋白免疫組化染色結(jié)果(SP，100×)

2.2 NSCLC病灶組織標(biāo)本中的PD-L1蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系

肺癌組織學(xué)分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床分期的NSCLC患者PD-L1蛋白陽性表達(dá)率組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同年齡、性別、病灶直徑大小的NSCLC患者中，PD-L1蛋白陽性表達(dá)率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 NSCLC病灶組織標(biāo)本中的PD-L1表達(dá)與相關(guān)參數(shù)的關(guān)系 單位：例(%)

2.3 NSCLC組織中PD-L1蛋白陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

所有患者得到隨訪，其中PD-L1陽性組失訪6例(8.33%)，PD-L1陰性組失訪1例(5.56%)。PD-L1蛋白陽性表達(dá)的NSCLC患者3年生存率(19.70%)顯著低于陰性患者的52.94%(P<0.05)。PD-L1蛋白陽性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間21.0月，陰性表達(dá)患者中位生存時(shí)間28.0月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank (Mantel-Cox)=6.019，P=0.014；圖2)。

圖2 NSCLC組織中PD-L1蛋白表達(dá)與患者遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系函數(shù)圖

2.4 多因素分析結(jié)果

以患者的3年生存率作為因變量，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1蛋白表達(dá)作為自變量，采用非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：TNM分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1蛋白陽性表達(dá)是NSCLC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)；分化程度對(duì)NSCLC患者的預(yù)后影響不明顯(P>0.05，表3)。

表3 多因素分析結(jié)果

3 討 論

肺癌屬于全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率位居首位的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年提升，在中國(guó)，空氣環(huán)境污染、工業(yè)化加速以及人口老齡化等多種因素導(dǎo)致肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越來越高。早期肺癌病灶十分隱匿，雖然CT檢查在診斷肺癌中的地位越來越重要，但是潛在的輻射誘發(fā)癌變風(fēng)險(xiǎn)和檢查費(fèi)用高昂導(dǎo)致部分患者無法接受，而其他諸如超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)支氣管黏膜活檢術(shù)等診斷方式的準(zhǔn)確性較高，但操作復(fù)雜，無法在臨床普及，因此多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已處于晚期，失去了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)[3-4]。另一方面，目前采取全身化療方法雖然可以適度延長(zhǎng)患者生存期，但是傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物療效已經(jīng)達(dá)到平臺(tái)期，腫瘤對(duì)臨床使用的化療藥物存在一定的耐藥性，而且對(duì)患者正常組織與細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生殺傷作用，需要尋求新的抗腫瘤靶點(diǎn)以提升患者臨床治療效果[5-6]。腫瘤細(xì)胞侵犯后集體動(dòng)態(tài)平衡被打破，免疫細(xì)胞具有識(shí)別、清除非己抗原作用，然后惡性腫瘤能夠建立適應(yīng)自身生長(zhǎng)的微環(huán)境，而且建立時(shí)間段，人體免疫監(jiān)視出現(xiàn)漏洞，腫瘤細(xì)胞會(huì)繼續(xù)增殖并發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤的微環(huán)境一般是多種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及各種細(xì)胞因子構(gòu)成，能夠?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、分化、成熟、凋亡以及細(xì)胞表面相關(guān)因子的分泌、表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，這樣人體免疫系統(tǒng)可以正常發(fā)揮作用[7-9]。

本文觀察了程序性死亡配體-1(PD-L1)變化在非小細(xì)胞肺癌中的變化，該因子是I型跨膜糖蛋白，一級(jí)結(jié)構(gòu)具有290個(gè)氨基酸，主要包括胞外區(qū)、疏水跨膜一級(jí)尾部胞質(zhì)區(qū)既可以表達(dá)在活化T細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞中，也可以在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1屬于CD28/B7家族中重要負(fù)性協(xié)同刺激分子通路，這一通路激活后會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞凋亡過程，同時(shí)抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活化，因此能夠參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程[13]。此外，PD-L1同非小細(xì)胞肺癌的分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間密切相關(guān)，表達(dá)程度同腫瘤的負(fù)荷與累計(jì)范圍之間關(guān)系密切，PD-1與PD-L1結(jié)合后可以促進(jìn)T細(xì)胞衰竭與凋亡，腫瘤細(xì)胞可以免受免疫細(xì)胞殺傷，造成腫瘤細(xì)胞增殖加速，腫瘤負(fù)荷加重，腫瘤出現(xiàn)局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[14-15]。有學(xué)者應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了20例PC石蠟包埋組織標(biāo)本中PD-1和PD-L1的蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，PD-1和PD-L1的表達(dá)在40%左右的PC患者中呈陽性，其中,吸煙類患者腫瘤組織中PD-l的陽性表達(dá)率明顯高于不吸煙患者，結(jié)果提示PD-1和PD-L1的陽性表達(dá)可能與PC的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性，與本研究結(jié)果相似[15]。

本研究顯示PD-L1在NSCLC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，NSCLC組織中的PD-L1陽性表達(dá)與患者臨床分期、腫瘤分化程度、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性，說明NSCLC可能利用PD-L1腫瘤抑制性通路發(fā)生免疫逃逸，此通路可能成為NSCLC治療的新靶點(diǎn)。采用非條件Logistic回歸分析，TNM分期增高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1陽性表達(dá)是NSCLC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說明上述因素同非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后具有密切關(guān)聯(lián)性，可以作為評(píng)定患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究?jī)?yōu)勢(shì)在于證實(shí)了PD-L1表達(dá)同NSCLC發(fā)生發(fā)展具有密不可分關(guān)系，有望成為治療的新靶標(biāo)以及預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，但是本研究屬于回顧性分析，由于病理類型選擇以及患者數(shù)量不一致可能導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏倚，有待進(jìn)一步開展深入研究。

綜上所述，PD-L1在NSCLC組織中表達(dá)程度上調(diào)，并且與患者腫瘤發(fā)生、不良預(yù)后具有顯著的關(guān)系。