敲低ACTL8基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖與遷移的影響

呂 燕, 王武艷, 季曉黎

(1.邛崍市中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川省邛崍市611530;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 四川省中醫(yī)院婦科,四川省成都市 610072)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道的惡性腫瘤，占女性癌癥的6%,原因可能與長期持續(xù)雌激素刺激，肥胖，不育，更年期晚，遺傳因素和其他因素有關(guān)[1]。盡管診斷技術(shù)和治療取得了巨大進(jìn)步，但子宮內(nèi)膜癌患者的發(fā)病率和死亡率仍然很高。惡性腫瘤浸潤周圍組織和器官轉(zhuǎn)移仍是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。新的分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展有助于識別在腫瘤抑制或促進(jìn)中發(fā)揮作用的分子[2]。靶向治療已成為治療癌癥的有效策略，并可能最終提高癌癥患者的無病生存率。癌-睪丸抗原(cancer testicular antigen，CTA)是一種具有200多個成員的腫瘤相關(guān)抗原，在胎盤組織、各種腫瘤組織和睪丸中特異性表達(dá)，但在其他正常組織中不表達(dá)[3]。肌動蛋白樣蛋白8(actin-like protein 8，ACTL8)是CTA家族的成員，包含366個氨基酸[4]。迄今為止，關(guān)于ACTL8在惡性腫瘤中的作用的研究很少。短發(fā)夾RNA(shRNA)是一種小RNA分子，可以克隆到表達(dá)載體中并表達(dá)干擾RNA(siRNA)，可以抑制基因表達(dá)[5]。為了探討采用攜帶shRNA特異序列的載體轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞敲低ACTL8基因?qū)?xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響及其機(jī)制，本研究選取人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株進(jìn)行實驗研究。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥物

PHEX、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibico公司，Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司；DNA Maker LD2000購自日本TaKaRa公司；兔抗人ACTL8多克隆抗體、Matrigel基底膜購自美國BD公司；Western免疫印跡檢測試劑盒購自美國Amersham公司，BioTek酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。E-cadherin、N-cadherin、MMP-9及P-21抗體購自北京中山金橋有限公司，山羊抗兔IgG-HRP二抗、攜帶shRNA特異序列的載體及空載PLKO.1購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

Ishikawa細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。使用RPMI-1640(10%血清、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素)在37 ℃ 5%CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時，使用PBS洗3次，然后用胰酶消化，待細(xì)胞變圓之后，終止消化，反復(fù)吹打，變成單細(xì)胞懸液，種植到六孔板中。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。待六孔板中的細(xì)胞長至對數(shù)期時更換新鮮的完全培養(yǎng)液。脂質(zhì)體Lipofectamine2000 10 μL溶于250 μL無血清無抗生素培養(yǎng)基中，輕輕混勻后室溫靜置5 min；30 min內(nèi)混合脂質(zhì)體和載體混合液，輕輕混勻后室溫靜置30 min。棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，PBS洗2次。將500 μL脂質(zhì)體和載體混合液加入每孔細(xì)胞中，輕輕混勻，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)液。

1.3 熒光定量PCR技術(shù)

提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，實時熒光定量PCR檢測ACTL8的表達(dá)。ACTL8: F: 5′-GAGTTCGGCAGCTCACACAG-3′,R： 5′-CCAG CCTTCAAAAAGCCAGAC-3′。內(nèi)參：GAPDH: F: 5′-GGA GCGAGATCCCTCCAAAAT-3′ R： 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。熒光定量PCR程序：95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,循環(huán)40次，60 ℃ 45 s,72 ℃ 30 min；每組設(shè)3個復(fù)孔，2-△△Ct法計算ACTL8的表達(dá)量。獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 Western blot法

細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后，將六孔板置于冰上，加RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定其含量，95 ℃加熱5 min。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(兔抗人ACTL8、兔抗人E-cadherin、兔抗人N-cadherin、鼠抗人MMP-9、兔抗人P-21)4 ℃孵育過夜，TBST洗3×5 min，二抗室溫孵育1 h，洗膜后加ECL顯影。

1.5 Transwell遷移和侵襲實驗

將預(yù)先溶解的Matrigel 100 μL加至24孔板的Transwell室的上層室中，搖勻并將其放入培養(yǎng)箱中，靜置4～6 h以形成凝膠，然后吸干培養(yǎng)液加入500 μL無血清培養(yǎng)液，靜置0.5 h使基底膜水合。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液添加到上腔室中(1×105個細(xì)胞)，并將500 μL完全培養(yǎng)液添加到下腔室中。過夜后，移開培養(yǎng)室，用棉簽擦拭上部培養(yǎng)室中的剩余細(xì)胞，用PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用PBS洗滌，顯微鏡視野下計數(shù)。遷移實驗過程類似于侵襲實驗。Transwell細(xì)胞無需鋪膠，細(xì)胞數(shù)量為5 000個/孔。

1.6 CCK8細(xì)胞增殖實驗

將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后的細(xì)胞消化計數(shù)，制備細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液,以每孔1 000個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)種到96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，每24 h檢測一次細(xì)胞數(shù)目，檢測前每孔加10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀用450 nm激發(fā)光檢測OD值，繪制增殖曲線。

1.7 平板克隆實驗

以每皿1 000個細(xì)胞梯度接種于含5 mL 37 ℃預(yù)溫培養(yǎng)液的60 mm皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。對照組加0.1% DMSO，shACTL8組加10 μmol/L PHEX。置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS洗2次。加4%多聚甲醛5 mL固定30 min。然后移去固定液，加適量0.1%結(jié)晶紫染色30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，干燥。計數(shù)克隆，并比較克隆形成的大小和數(shù)目。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Ishikawa細(xì)胞株敲低ACTL8基因后的ACTL8 mRNA和蛋白表達(dá)情況

shACTL8組ACTL8 mRNA和蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度均低于對照組(P<0.05；圖1)。

2.2 Ishikawa細(xì)胞侵襲、遷移實驗結(jié)果

shACTL8組的Ishikawa細(xì)胞侵襲、遷移水平均低于對照組(P<0.05；圖2)。

圖1 敲低ACTL8基因后的ACTL8 mRNA(熒光定量PCR)及蛋白(Western blot)表達(dá)

圖2 Ishikawa細(xì)胞侵襲、遷移實驗結(jié)果

2.3 Ishikawa細(xì)胞增殖及克隆實驗結(jié)果

在細(xì)胞培養(yǎng)后1天、2天、3天，對照組的Ishikawa細(xì)胞數(shù)目測定OD值顯著高于shACTL8組(P<0.05；圖3)。平板克隆實驗分析可見shACTL8組培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05；圖3)。

2.4 兩組E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、P21蛋白表達(dá)情況

shACTL8組E-cadherin蛋白、P21蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于對照組(P<0.05)；shACTL8組N-cadherin蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度低于對照組(P<0.05；圖4)。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的惡性腫瘤，早期治療通常具有良好的預(yù)后，但是腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移使患者的5年生存率顯著降低[5]。對腫瘤細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制的研究有助于為腫瘤治療提供靶點(diǎn)。ACTL8是CTA家族的成員，近年來，通過研究ACTL8的表達(dá)水平及其與癌癥患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，ACTL8在包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥中的關(guān)系已經(jīng)得到證實[6-7]。許多研究認(rèn)為ACTL8是腫瘤免疫療法的潛在靶標(biāo)，表明ACTL8的表達(dá)可能與免疫水平有關(guān)[8]。但是，ACTL8基因在其他惡性腫瘤中的研究較少。因此仍然需要進(jìn)一步的研究。RNA干擾技術(shù)是一種有效且特異性地抑制特定基因表達(dá)的技術(shù)[9]。迄今為止，它已被用于許多疾病的研究和治療。在以前的研究中已經(jīng)證實ACTL8在子宮內(nèi)膜腺癌組織中高表達(dá)[10-11]，但是，ACTL8在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚不清楚。本次研究在前期生物信息學(xué)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，首次研究在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中敲低ACTL8后，細(xì)胞生長、增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的變化，并進(jìn)一步明確ACTL8影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的內(nèi)在機(jī)制。

在這項研究中，用攜帶shRNA特異性序列的載體轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，并檢測了ACTL8 mRNA和ACTL8蛋白表達(dá)水平的變化[12]。結(jié)果顯示shACTL8組ACTL8 mRNA和ACTL8蛋白的相對表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對照組。在Ishikawa細(xì)胞系模型中沉默ACTL8蛋白后，其侵襲和遷移能力顯著降低，并且shACTL8組培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長數(shù)目，細(xì)胞數(shù)目測定OD值明顯少于對照組，進(jìn)一步表明ACTL8的高表達(dá)可能介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，沉默ACTL8基因可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖。ACTL8可能是人類子宮內(nèi)膜癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物和新的治療靶標(biāo)。ACTL8參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，可能與纖溶酶系統(tǒng)和活化的基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān)，促進(jìn)腫瘤周圍的血管生成和細(xì)胞遷移，并調(diào)節(jié)腫瘤的免疫反應(yīng)。ACTL8可能是一種抗凋亡蛋白，高表達(dá)時腫瘤細(xì)胞的凋亡受到抑制促進(jìn)腫瘤的生長。

P21基因是位于p53基因下游的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，通過與P53相互作用來控制細(xì)胞周期，與各種腫瘤的分化，增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。在非小細(xì)胞肺癌，胃癌，宮頸癌和其他癌組織中可見到P21的異常表達(dá)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員之一，裂解細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維膠原。同時，它可以引起骨膠原蛋白的降解，從而加速腫瘤細(xì)胞的增殖過程[14]。本次研究結(jié)果顯示，shACTL8組E-cadherin蛋白、P21蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組，N-cadherin蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對照組。沉默ACTL8基因可能抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和增殖過程。

目前，研究表明ACTL8基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，在膀胱、胰腺、胸腺和結(jié)腸組織中低表達(dá)，而在正常腦組織中不表達(dá)[15-16]。尚未有研究報道其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖遷移的作用。本研究在前期生物信息學(xué)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，觀察子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中敲低ACTL8后，細(xì)胞生長、增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的變化；并測定E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、P21蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步明確ACTL8影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的內(nèi)在機(jī)制。

綜上所述，ACTL8基因低表達(dá)與人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力減弱有關(guān)，ACTL8基因有希望作為治療子宮內(nèi)膜癌的新靶點(diǎn)。