東方百合‘Siberia’無(wú)病毒原原種直接再生體系建立

李雪艷,胡新穎,王偉東,白一光,周俐宏,楊迎東,趙 展

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所,遼寧 沈陽(yáng) 110161)

百合是世界上栽培最廣泛的切花和盆栽花卉之一,栽培歷史悠久,花色品種繁多,市場(chǎng)上有100多個(gè)形色各異的百合品種[1]?！甋iberia’百合花朵碩大、花朵純白、花香濃郁是東方百合雜種系中一個(gè)經(jīng)典品種,也是市面上最常見(jiàn)最受消費(fèi)者歡迎的百合切花品種[2]。

百合種球繁育過(guò)程中很容易受到病毒感染,造成發(fā)育不良和品質(zhì)退化。侵染百合的病毒種類有十余種,其中危害較為嚴(yán)重和常見(jiàn)的有百合無(wú)癥病毒(Lily symptomless virus,LSV),百合斑駁病毒(Lily mottle virus,LMoV),黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)。獲得無(wú)病毒百合種源并通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)大量擴(kuò)繁是百合無(wú)病毒種球生產(chǎn)的重要途徑[3]。

現(xiàn)代百合栽培品種多為種間高度雜合后代,其優(yōu)良性狀只能通過(guò)無(wú)性繁殖保持,組織培養(yǎng)是百合種球繁殖的主要方式,通過(guò)組織培養(yǎng)快速得到大量百合種苗、增加產(chǎn)出是世界百合產(chǎn)業(yè)的趨勢(shì)。百合離體再生有多種途徑,但如何提高繁殖系數(shù)、縮短繁育周期一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。通過(guò)直接再生途徑一次成苗,可以簡(jiǎn)化培養(yǎng)程序,降低成本,保持較低的變異率,有利于品種優(yōu)良性狀的保持,具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。本研究以無(wú)CMV、LSV、LMoV病毒的‘Siberia’種球?yàn)樵嚥?探討小鱗莖直接再生的最適植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度,建立無(wú)病毒‘Siberia’試管小鱗莖直接再生體系,為繁育優(yōu)質(zhì)百合無(wú)病毒種球提供依據(jù),進(jìn)而為百合產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

種球:東方百合‘Siberia’種球?yàn)楹商m進(jìn)口,周徑14～16 cm,RT-PCR檢測(cè)CMV、LSV、LMoV病毒陰性。

培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基采用MS固體培養(yǎng)基(含MS基本培養(yǎng)基,蔗糖30 g/L,瓊脂6.5 g/L,pH為5.8),于121 ℃條件下滅菌20 min。根據(jù)不同試驗(yàn)添加不同激素或試劑。

試劑(激素):芐基腺嘌呤(N6-benzyladenine,6-BA)、萘乙酸(Naphthylacetic acid,NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenosyacetic acid, 2,4-D)、激動(dòng)素(Kinetin,KT)、NaClO、蔗糖、瓊脂均為分析純,購(gòu)自北京康貝斯生物科技有限公司。

試驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)小鱗莖誘導(dǎo)、膨大、生根等不同階段分別設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn),不同激素配方為試驗(yàn)考察因素。

1.2 方法

1.2.1 外植體接種

由外向內(nèi)取第2～5層鱗片,流水沖洗30 min后用0.2%～0.5%的洗衣粉水浸泡10 min,在自來(lái)水下沖洗干凈。然后用75%酒精滅菌30 s,再用10%的NaClO溶液浸泡10 min,期間不斷進(jìn)行搖動(dòng),最后用無(wú)菌水沖洗5～6次。沿鱗片邊緣切去1 mm,然后自基部橫向切成0.2～0.3 cm的小塊,接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

組培苗培養(yǎng)溫度為25±1 ℃。

1.2.2 小鱗莖誘導(dǎo)配方比較試驗(yàn)

1.2.2.1 不同濃度6-BA、NAA對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響試驗(yàn) 從無(wú)菌苗中選取直徑大于1 cm的小鱗莖,剝?nèi)△[片,將鱗片四周切去,然后切成0.2～0.3 cm的小塊,接種至添加不同濃度6-BA(0.5、1.0 mg/L)和NAA(0.1、0.3、0.5 mg/L)培養(yǎng)基中(表1),45 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.2.2 不同濃度2,4-D對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響試驗(yàn) 將無(wú)菌苗鱗片(鱗片狀態(tài)與處理方式同1.2.2.1)置于添加不同濃度2,4-D(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)MS培養(yǎng)基中(表2),45 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.2.3 不同濃度NAA、KT對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響試驗(yàn) 將無(wú)菌苗鱗片(鱗片狀態(tài)與處理方式同1.2.2.1)置 于 添 加 不 同 濃 度NAA(0.05、0.1、0.2 mg/L)與KT(0.05、0.1 mg/L)培養(yǎng)基中(表3),45 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.2.4 不同濃度2,4-D、KT對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響試驗(yàn) 將無(wú)菌苗鱗片(鱗片狀態(tài)與處理方式同1.2.2.1)置于添加不同濃度2,4-D(1.0、2.0 mg/L)、KT(0.05、0.1 mg/L)培養(yǎng)基中(表4),45 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.3 小鱗莖膨大激素配方篩選試驗(yàn)

將直徑0.5 cm左右的小鱗莖轉(zhuǎn)入添加30、60、90、120 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中,觀察并記錄小鱗莖的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)激素配方篩選試驗(yàn)

將直徑大于1 cm小鱗莖接種于添加不同濃度NAA(0.1、0.2、0.5 mg/L)、IBA(0.01、0.1 mg/L)的MS培養(yǎng)基中(表5),45 d調(diào)查根長(zhǎng)、生根率及根數(shù)。

1.2.5 練苗移栽

將生根后的組培苗移至4 ℃冷庫(kù)處理90 d,于20 ℃下練苗7 d,而后將小鱗莖從瓶中取出洗去根部粘著的瓊脂,用化學(xué)殺菌劑百菌清500倍消毒30 min,栽植到草炭和蛭石混合基質(zhì)(體積比為1∶1)中,觀察并統(tǒng)計(jì)小苗移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析方法

試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),45 d觀測(cè)并調(diào)查數(shù)據(jù)。各處理之間差異顯著性用軟件DPS 7.05軟件分析,統(tǒng)計(jì)方法采用鄧肯新復(fù)極差法和One-Way ANOVA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA、NAA對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,‘Siberia’的無(wú)菌苗鱗片在添加6-BA與NAA的培養(yǎng)基中主要以不定芽誘導(dǎo)為主,少量以愈傷組織形態(tài)發(fā)生。從表1看出,各處理的不定芽誘導(dǎo)率沒(méi)有顯著差異,但不定芽誘導(dǎo)系數(shù)差異顯著,且誘導(dǎo)系數(shù)隨著6-BA與NAA濃度的增加而增大,處理5即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L誘導(dǎo)系數(shù)最高,可達(dá)3.92。但是,6-BA與NAA濃度越高,不定芽叢蓮座化現(xiàn)象越嚴(yán)重,小鱗莖形態(tài)畸形越明顯(圖版1),且蓮座化的小鱗莖在后續(xù)增殖與膨大培養(yǎng)中仍會(huì)表現(xiàn)為畸形,不適于百合種球的工廠化繁育。綜上,高濃度的6-BA與NAA可以促進(jìn)不定芽萌發(fā),同時(shí)也會(huì)加重小鱗莖的蓮座化現(xiàn)象。

2.2 不同濃度2,4-D對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

接種14 d左右,在鱗片內(nèi)側(cè)直接再生小鱗莖,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,小鱗莖直徑不斷增加(圖版2)。不同濃度2,4-D對(duì)‘Siberia’鱗片再生小鱗莖誘導(dǎo)率差異較大,其中處理2、處理4與處理6有10%～20%左右的愈傷誘導(dǎo)率(數(shù)據(jù)未列出)。當(dāng)2,4-D濃度為0.5 mg/L時(shí),小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)最高;當(dāng)2,4-D濃度為1.0 mg/L時(shí),小鱗莖誘導(dǎo)率最高且小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)較高(表2),綜合考慮處理3即MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 2,4-D最適宜‘Siberia’鱗片誘導(dǎo)小鱗莖。

2.3 不同濃度NAA、KT對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

無(wú)菌苗鱗片在添加不同濃度NAA、KT的培養(yǎng)基中同樣可直接再生小鱗莖。不同濃度NAA、KT對(duì)‘Siberia’鱗片再生小鱗莖誘導(dǎo)率影響差異不大(表3)。與6-BA不同,NAA與KT配比誘導(dǎo)的小鱗莖球形周正,無(wú)蓮座化現(xiàn)象,且誘導(dǎo)系數(shù)較高(圖版3)。處理2與處理3的小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)均可達(dá)到3.7,綜合比較小鱗莖誘導(dǎo)率,處理2即MS培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L NAA與0.1 mg/L KT最適宜‘Siberia’鱗片誘導(dǎo)小鱗莖。

2.4 不同濃度2,4-D、KT對(duì)無(wú)菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

試驗(yàn)表明,培養(yǎng)基中同時(shí)添加2,4-D與KT既有利于試管內(nèi)小鱗莖直接再生,同時(shí)也伴有少量愈傷組織的發(fā)生。如表4所示,同時(shí)添加2,4-D與KT的小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)要低于單獨(dú)添加2,4-D。當(dāng)2,4-D為2.0 mg/L,KT為0.05 mg/L時(shí),小鱗莖的誘導(dǎo)系數(shù)最低,這是因?yàn)椴糠主[片誘導(dǎo)形成愈傷組織。而處理2即MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L培養(yǎng)基更適于小鱗莖的誘導(dǎo),誘導(dǎo)系數(shù)達(dá)到2.73,誘導(dǎo)率為100%(圖版4)。

表2 不同濃度2,4-D對(duì)鱗片直接再生小鱗莖的影響Table 2 Effects of combinations of 2,4-D on adventitious bud induction of scales explants

表3 不同濃度NAA、KT對(duì)鱗片直接再生小鱗莖的影響Table 3 Effects of combinations of BA with NAA on adventitious bud induction of scales explants

表4 不同濃度2,4-D、KT對(duì)鱗片直接再生小鱗莖的影響Table 4 Effects of combinations of 2,4-D with KT on adventitious bud induction of scales explants

2.5 不同濃度蔗糖對(duì)小鱗莖膨大的影響

在MS培養(yǎng)基中添加蔗糖可以使小鱗莖體積增大,但增大的幅度隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的升高有顯著不同(圖1)。培養(yǎng)基中添加90 g/L蔗糖可使小鱗莖達(dá)到最大周徑3.34 cm,同時(shí)小鱗莖生根效果也較好,最適宜‘Siberia’小鱗莖膨大。

2.6 不同濃度IBA、NAA對(duì)小鱗莖生根的影響

在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度NAA與IBA,均能使‘Siberia’鱗莖生根,且生根率都能達(dá)到100%,但是在根長(zhǎng)和根數(shù)方面有差異(表5)。

就生根數(shù)而言,單獨(dú)添加NAA的培養(yǎng)基生根效果要優(yōu)于單獨(dú)添加IBA,其中處理2即添加0.2 mg/LNAA生根數(shù)最多。而處理7即同時(shí)添加0.2 mg/LNAA與0.1 mg/IBA生根數(shù)最多,可達(dá)12條根。對(duì)于根長(zhǎng)來(lái)說(shuō),添加IBA的效果要優(yōu)于僅含NAA的培養(yǎng)基,其中處理8 MS+IBA 0.01 mg/L與處理7 MS+ NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L效果最好。結(jié)合根長(zhǎng)與生根數(shù),最終培養(yǎng)基MS+ NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L更適合‘Siberia’小鱗莖誘導(dǎo)生根,且生根情況適合移栽(圖版5)。

2.7 煉苗移栽

經(jīng)煉苗后的組培苗鱗莖移栽至消毒完全的基質(zhì)中,各處理得到百合種球成活率均達(dá)到100%,且生長(zhǎng)發(fā)育正常(圖版6)。

圖1 不同蔗糖濃度對(duì)小鱗莖膨大的影響Figure 1 Influence of different concentrations of sucrose on bulb expansion

表5 不同濃度NAA、IBA對(duì)‘Siberia’生根的影響Table 5 Influence of different concentrations of NAA and IBA on rooting of ‘Siberia’

圖版 1.6-BA、NAA誘導(dǎo)蓮座狀不定芽; 2.2,4-D誘導(dǎo)小鱗莖; 3.NAA、KT誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖; 4.2,4-D、KT誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖; 5.移栽后生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論與討論

綜上所述,本研究通過(guò)探討添加不同種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與不同濃度碳源的效果,最終確定東方百合‘Siberia’試管內(nèi)小鱗莖直接再生的最適培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg/L,小鱗莖膨大最適培養(yǎng)基為MS+蔗糖90 g/L,生根最適培養(yǎng)基為MS+ NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L,從而建立完整的‘Siberia’無(wú)病毒原原種直接再生體系。

使用不同外植體建立百合試管內(nèi)再生體系,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)展了許多研究[4],以‘Siberia’百合鱗片[5,6]、葉片[7,8]、無(wú)菌苗葉片[9]、花器官[10～12]、莖尖為外植體成功建立了組培快繁體系[13]。但是從產(chǎn)業(yè)需求出發(fā),針對(duì)如何降低百合種球帶毒率,如何提高增殖系數(shù),如何縮短繁育周期的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)以無(wú)病毒百合無(wú)菌苗鱗片為外植體建立試管內(nèi)直接再生體系,既可以獲得無(wú)病毒百合原始繁殖材料,又可以提高繁殖效率,縮短繁育周期,降低生產(chǎn)成本,實(shí)用性強(qiáng)。

鱗片的分化主要以兩種方式進(jìn)行:一是先形成愈傷組織,然后從愈傷組織上產(chǎn)生不定芽;另一種是通過(guò)直接出芽的方式形成不定芽。崔均濤等研究發(fā)現(xiàn)1.0～1.5 mg/L 2,4-D最適于‘Siberia’鱗片誘導(dǎo)形成愈傷組織[15],高義霞報(bào)道0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+100 mg/L LH有利于愈傷組織的形成[16],蘭倩研究表明在添加0.2 mg/L NAA+0.7 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中鱗片誘導(dǎo)形成不定芽[17],趙慶芳等認(rèn)為低濃度的KT有利于一次性成苗[14],本試驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)NAA 0.05 mg/L+KT 0.1 mg/L最適于小鱗莖直接形成,這可能與添加的外源激素的種類和濃度配比、以及取材時(shí)間與接種方式有關(guān)。