白芥子穴位貼敷抑制肝癌H22移植性腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究*

王雙雙 鄭國(guó)銀 卿照前

1.長(zhǎng)沙市中醫(yī)醫(yī)院(長(zhǎng)沙市第八醫(yī)院)內(nèi)科 (湖南 長(zhǎng)沙， 410100) 2.上海長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科

近些年，中醫(yī)中藥在肝癌治療中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。穴位貼敷是臨床常用的中醫(yī)治療手段，將藥物貼敷于特定穴位，通過(guò)藥物與穴位的共同作用來(lái)調(diào)整經(jīng)絡(luò)臟腑功能，達(dá)到治療疾病的目標(biāo)。肝俞穴、靈臺(tái)穴、中都穴是治療肝臟疾病的常用穴位，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用治癌靈對(duì)上述3個(gè)穴位進(jìn)行貼敷治療能夠抑制肝癌H22移植瘤的生長(zhǎng)[1]。白芥子是十字花科植物白芥的干燥成熟種子，有研究報(bào)道白芥子揮發(fā)油具有抗肝癌活性[2]，但會(huì)產(chǎn)生較嚴(yán)重的毒副作用，而白芥子是否能夠通過(guò)穴位貼敷的給藥方式發(fā)揮治療肝癌的作用尚不明確。

白芥子涂法穴位貼敷最早見(jiàn)于清代醫(yī)家張璐的《張氏醫(yī)通》，國(guó)內(nèi)李寧的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白芥子涂法穴位貼敷能夠在過(guò)敏性哮喘豚鼠中發(fā)揮氣道保護(hù)作用，同時(shí)能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)及p38[3]。在肝癌的發(fā)病過(guò)程中，ERK1/2通路及p38通路均存在異常表達(dá)[4，5]，但能夠調(diào)控ERK1/2及p38的白芥子涂法穴位貼敷是否具有抗肝癌作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)分析了白芥子穴位貼敷通過(guò)MAPK途徑抑制移植瘤生長(zhǎng)的作用及機(jī)制，旨在為發(fā)現(xiàn)肝癌新的治療手段提供思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自ATCC公司。BALB/C雄性小鼠購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2019-0002。

1.2 藥品與試劑 白芥子組方由醫(yī)院藥劑科制備，陰性對(duì)照腺病毒(Ad-NC)、過(guò)表達(dá)ERK1/2的腺病毒(Ad-ERK1/2)購(gòu)自上海吉瑪公司、滴度1×109PFU/ml；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯影試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，ERK1/2、p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK一抗購(gòu)自CST公司，細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)、c-myc、波形蛋白、E-鈣黏蛋白一抗購(gòu)自Abcam公司。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱為T(mén)hermo公司，中藥粉碎機(jī)為山東經(jīng)欣粉體設(shè)備科技公司，電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)為上海天能公司。

1.4 方法

1.4.1 白芥子藥膏制備 白芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛在中藥粉碎機(jī)中粉碎后過(guò)100目篩，按照2∶2∶1∶1的比例混合并過(guò)80目篩3次，藥物粉末與姜汁等體積混合后得到藥膏，每10 g藥膏內(nèi)加入0.1 g麝香并混勻，分裝在15 ml離心管中，密封后放置在-20℃冰箱備用。

1.4.2 肝癌H22移植瘤小鼠模型建立 H22細(xì)胞接種在小鼠腹腔內(nèi)，6～8 d后形成腹水，處死小鼠并抽取腹水，用生理鹽水稀釋并制備成1×107/ ml的細(xì)胞懸液，在小鼠右前肢腋下給予0.2 ml細(xì)胞懸液皮下注射，1周后形成米粒大小的瘤塊判斷為造模成功。

1.4.3 小鼠分組及給藥 造模成功后，肝癌H22移植瘤小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、白芥子組、白芥子+Ad-NC組、白芥子+Ad-ERK1/2組，每組各6只。對(duì)照組小鼠不進(jìn)行特殊處理。白芥子組小鼠選擇移植瘤部位、肝俞穴、靈臺(tái)穴、中都穴進(jìn)行穴位貼敷，取0.05 g白芥子藥膏放置在3 M透明敷料上，制成直徑3 mm的貼膏，貼于相應(yīng)的部位，隔日換藥1次，共4次。白芥子+Ad-NC組、白芥子+Ad-ERK1/2組小鼠按照白芥子組相同的方法進(jìn)行白芥子穴位貼敷，在首次穴位貼敷前在瘤體分別進(jìn)行多點(diǎn)注射Ad-NG、ERK1/2，共5點(diǎn)，每點(diǎn)注射4 μl。

1.4.4 小鼠一般狀態(tài)及移植瘤重量的觀察 造模成功后，每日觀察小鼠的精神狀況、活動(dòng)情況，穴位貼敷干預(yù)前1 d及每次穴位貼敷干預(yù)后(即干預(yù)第1天、第3天、第5天、第7天)時(shí)均進(jìn)行稱重；末次穴位貼敷干預(yù)后48 h，處死小鼠，完整解剖移植瘤并稱重。

1.4.5 蛋白表達(dá)的western blot檢測(cè) 取移植瘤，加入RIPA裂解液后勻漿，采用BCA試劑盒檢測(cè)勻漿液中的蛋白含量，取30 μg蛋白樣本進(jìn)行western blot檢測(cè)，將蛋白樣本與上樣緩沖液混合，加入SDS-聚丙烯氨酰胺凝膠，電泳分離蛋白，而后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中、室溫封閉1 h。將PVDF膜放入1∶1 000稀釋的p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK、cyclinD1、c-myc、波形蛋白、E-鈣黏蛋白一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗中、4℃孵育過(guò)夜，將PVDF膜放入1∶2 000稀釋的二抗中、室溫孵育1 h，最后加入ECL顯影液并在凝膠成像儀中曝光，根據(jù)蛋白條帶的灰度值，分別以ERK1/2、p38、JNK為內(nèi)參計(jì)算p-ERK1/2、p-p38、p-JNK的表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參，分別計(jì)算目的基因cyclinD1、c-myc、波形蛋白、E-鈣黏蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值，即為目的基因的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件錄入數(shù)據(jù)，4組間計(jì)量資料的比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠一般狀態(tài) 干預(yù)期間，4組小鼠精神狀況良好、活動(dòng)正常，均未出現(xiàn)死亡。干預(yù)前及干預(yù)第1天、第3天、第5天、第7天時(shí)，4組小鼠體質(zhì)量比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠體質(zhì)量比較

2.2 4組小鼠移植瘤重量 與對(duì)照組比較，白芥子組小鼠移植瘤的重量明顯減輕(P<0.05)；與白芥子組比較，白芥子+Ad-NC組小鼠移植瘤的重量無(wú)顯著差異(P>0.05)，白芥子+Ad-ERK1/2組小鼠移植瘤的重量明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 4組小鼠移植瘤重量比較

2.3 4組小鼠移植瘤中MAPK信號(hào)通路 與對(duì)照組比較，白芥子組小鼠移植瘤中p-ERK1/2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，p-p38、p-JNK的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)；與白芥子組比較，白芥子+Ad-NC組小鼠移植瘤中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，白芥子+Ad-ERK1/2組小鼠移植瘤中p-ERK1/2的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，p-p38、p-JNK的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 4組小鼠移植瘤中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK的表達(dá)水平

表2 4組小鼠移植瘤中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK表達(dá)水平比較

2.4 4組小鼠移植瘤中ERK1/2下游增殖相關(guān)基因表達(dá) 與對(duì)照組比較，白芥子組小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與白芥子組比較，白芥子+Ad-NC組小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，白芥子+Ad-ERK1/2組小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 4組小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表達(dá)水平

表3 4組小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc表達(dá)水平比較

2.5 4組小鼠移植瘤中ERK1/2下游侵襲相關(guān)基因表達(dá) 見(jiàn)圖4、表4。

圖4 4組小鼠移植瘤中波形蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平

表4 4組小鼠移植瘤中波形蛋白、E-鈣黏蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

白芥子是十字花科植物白芥的干燥成熟種子，新近的研究證實(shí)該藥物在多種肝臟疾病的治療中發(fā)揮一定作用。根據(jù)Cao S及陳濤的研究，白芥子能夠抑制肝纖維化[6，7]；根據(jù)吳圣曦等[2]的研究，白芥子揮發(fā)油能夠抑制肝癌H22移植瘤的生長(zhǎng)，但白芥子揮發(fā)油在發(fā)揮抗肝癌作用的同時(shí)也存在明顯的毒副作用，移植瘤小鼠在治療過(guò)程中出現(xiàn)了脫毛、嘔吐、體重減輕、免疫抑制等情況。以上結(jié)果提示，白芥子可能在肝癌的治療中具有一定價(jià)值，但白芥子揮發(fā)油腹腔注射給藥的方式會(huì)產(chǎn)生較大的毒副作用，需要尋找其他給藥途徑。

穴位貼敷是臨床上常用的中醫(yī)治療手段，肝癌發(fā)病的中醫(yī)病機(jī)包括瘀、毒、虛3個(gè)方面[8]，貼敷時(shí)，可選擇肝俞、靈臺(tái)、中都3個(gè)穴位。肝俞穴是五臟六腑之精氣輸注在體表的部位；靈臺(tái)穴是足厥陰肝經(jīng)郄穴，能疏肝理氣；中都穴是督脈經(jīng)穴，能清熱解毒[9，10]。本實(shí)驗(yàn)將白芥子穴位貼敷用于肝癌H22移植瘤小鼠的治療，參照吳金苗等的研究選擇了肝俞、靈臺(tái)、中都3個(gè)穴位進(jìn)行貼敷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白芥子組小鼠的移植瘤重量明顯減輕，表明白芥子穴位貼敷能夠顯著抑制肝癌H22移植瘤的生長(zhǎng)。

在初步明確白芥子穴位貼敷能夠抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)的作用后，本研究還對(duì)介導(dǎo)這一作用的分子機(jī)制進(jìn)行了探究。多項(xiàng)肝癌相關(guān)的研究表明，MAPK途徑中的ERK1/2、p38、JNK均肝癌組織中異常表達(dá)，多種抗癌藥通過(guò)調(diào)控MAPK途徑抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[11，12]。白芥子穴位貼敷能夠激活MAPK途徑中的ERK1/2和p38兩條通路[3]。白芥子組小鼠移植瘤中p-ERK1/2的表達(dá)明顯降低，p-p38、p-JNK的表達(dá)無(wú)明顯變化，表明白芥子穴位貼敷能夠抑制肝癌移植瘤中ERK1/2的激活，這可能是其抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)的相關(guān)機(jī)制。

ERK1/2通路激活后，能夠調(diào)控下游多種增殖、侵襲基因的表達(dá)。CyclinD1和c-myc是受到ERK1/2通路調(diào)控的增殖基因，兩者均能加速細(xì)胞周期及細(xì)胞有絲分裂，對(duì)細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用[13，14]；波形蛋白和E-鈣黏蛋白是受到ERK1/2通路調(diào)控的侵襲基因，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，前者起促進(jìn)作用、有利于細(xì)胞侵襲，后者起抑制作用、阻礙細(xì)胞侵襲[15]。本實(shí)驗(yàn)觀察到移植瘤中cyclinD1、c-myc、波形蛋白的表達(dá)降低，E-鈣黏蛋白的表達(dá)增加，與ERK1/2激活受抑制的結(jié)果吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了白芥子穴位貼敷具有抑制ERK1/2通路激活的作用。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)還設(shè)計(jì)了過(guò)表達(dá)ERK1/2的腺病毒，注射腺病毒以增加ERK1/2的表達(dá)、對(duì)抗白芥子穴位貼敷抑制ERK1/2激活的作用，結(jié)果觀察到ERK1/2腺病毒削弱了白芥子穴位貼敷抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的作用，由此證實(shí)抑制ERK1/2激活是白芥子穴位貼敷抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)的相關(guān)分子機(jī)制。