兩個Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病家系的臨床表現(xiàn)及其與NF2基因突變的關(guān)系

曲喆，王興杰，王玉芝

(聊城市第二人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，山東 聊城 252600)

Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 2,NF2)是由位于22號常染色體上的NF2基因突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳的腫瘤易感綜合征，發(fā)病率是1∶25 000[1]。NF2以神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、皮膚腫瘤、晶體損害為臨床特征。雙側(cè)聽神經(jīng)瘤為患者的特征性表現(xiàn)，見于90%的患者，患者會表現(xiàn)出耳鳴、聽力下降、平衡功能異常等癥狀，顱內(nèi)腦膜瘤、脊髓腫瘤、周圍神經(jīng)腫瘤和白內(nèi)障亦常見[2-3]。近年來NF2的早期診斷越來越受重視，本病的早期診斷很大程度上依賴于基因診斷。

本實驗對所掌握的兩個NF2家系，收集家族成員的血液標(biāo)本及臨床資料，提取先證者的血液DNA，對NF2基因的15個外顯子(從外顯子1到15)及鄰近的內(nèi)含子序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，發(fā)現(xiàn)2個突變位點，對家族其他成員進(jìn)行篩查，同期選取100名無血緣關(guān)系的健康者的血液DNA作為對照，從而確定突變基因攜帶者，對其進(jìn)行監(jiān)管。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 家系1 前往先證者居住地進(jìn)行家系調(diào)查，對其家族成員進(jìn)行現(xiàn)場體格檢查和家系調(diào)查，繪制系譜圖見圖1。先證者為49歲女性，41歲時出現(xiàn)右耳耳鳴伴聽力下降，43歲時出現(xiàn)左耳耳鳴伴聽力下降，45歲時出現(xiàn)右側(cè)頭部鈍痛伴走路不穩(wěn)感。查體：營養(yǎng)中等，體表未見牛奶咖啡斑，閉眼露白，呲牙不可，鼓腮漏氣，抬眉不能，H-B評級III級。2007年患者于北京同仁醫(yī)院行中顱窩入路右側(cè)聽神經(jīng)瘤切除術(shù)，2009年于解放軍四六三醫(yī)院行左側(cè)聽神經(jīng)瘤伽馬刀治療。內(nèi)聽道核磁檢查見圖2，示雙側(cè)聽神經(jīng)瘤，符合NF2臨床表現(xiàn)。家族中其他成員的臨床表現(xiàn)見表1。

圖1 家系1系譜圖 ■和●分別代表家系男、女患者；□和○分別代表家系健康男性、女性；箭頭指示為先證者，斜杠代表死亡者

圖2 家系1先證者內(nèi)聽道MRI 2a：冠狀位T2WI顯示雙側(cè)內(nèi)聽道及橋腦小腦角區(qū)內(nèi)不均勻等信號腫塊影； 2b：水平位增強后T1WI顯示雙側(cè)內(nèi)聽道及橋腦小腦角區(qū)內(nèi)腫塊明顯不均勻強化

1.1.2 家系2 前往先證者居住地進(jìn)行家系調(diào)查，對其家族成員出進(jìn)行現(xiàn)場體格檢查和家系調(diào)查，繪制系譜圖見圖3。

表1 家系中其他患者的臨床表現(xiàn)

圖3 家系2系譜圖 ■和●分別代表家系男、女患者；□和○分別代表家系健康男性、女性；箭頭指示為先證者，斜杠代表死亡者

先證者于北京同仁醫(yī)院2000年行經(jīng)迷路進(jìn)路左側(cè)聽神經(jīng)瘤切除術(shù)，2001年行擴大經(jīng)迷路進(jìn)路右側(cè)聽神經(jīng)瘤切除術(shù)，第1次術(shù)后預(yù)后良好，第2次術(shù)后死亡，未獲得先證者血液標(biāo)本。

Ⅲ4為21歲男性青年，于17歲時出現(xiàn)左耳聽力下降、耳鳴、聲音嘶啞，2008年行內(nèi)耳MRI檢查示雙內(nèi)聽道、橋腦小腦角區(qū)、三叉神經(jīng)走形區(qū)、海綿竇內(nèi)、延髓兩側(cè)迷走神經(jīng)、副神經(jīng)、舌下神經(jīng)走形區(qū)及頸椎椎管內(nèi)占位性病變，腦干及小腦受壓變形，影像見圖4。

圖4 家系2Ⅲ4內(nèi)耳MRI 4a：水平位增強后T1WI顯示雙側(cè)內(nèi)聽道及橋腦小腦角區(qū)腫塊不均勻強化； 4b：冠狀位T2WI顯示雙側(cè)內(nèi)聽道及橋腦小腦角區(qū)內(nèi)不均勻高信號腫塊影(箭頭所示)

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 5 mL靜脈血加K2EDTA抗凝，使用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒(非離心柱型)提取DNA。經(jīng)紫外光光度計進(jìn)行純度測定 OD260/ODC280為1.8-2.0。

1.2.2 PCR擴增反應(yīng) PCR反應(yīng)體系25 μL，含模板DNA2.0 μL，正反引物各1.5 μL，PCRMIX12.5 μL，過濾水7.5 μL，在PCR儀上擴增30個循環(huán)，變性溫度94℃ 3 min，退火溫度(45～60)℃30 s，延伸溫度72℃ 1 min，最后一次反應(yīng)結(jié)束后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。15對引物使用Primer 5.0軟件設(shè)計，擴增片段包括每個外顯子及兩端部分內(nèi)含子。引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 DNA序列分析 將合格的PCR擴增產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 家系1

對先證者的NF2基因的1-15外顯子及臨近內(nèi)含子做直接測序，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子2剪接供體位點g>t雜合性堿基點突變。對外顯子2的突變?yōu)榉聪驕y序，因此直接測序圖上可見c>a突變(圖5)家系中患病的Ⅲ6、Ⅲ10、Ⅳ9、Ⅳ11、Ⅲ1、Ⅲ3及尚未發(fā)病Ⅳ2、Ⅳ5、Ⅳ6均發(fā)現(xiàn)與先證者相同突變，家系中的其他成員及100名無血緣關(guān)系健康對照者均未發(fā)現(xiàn)此突變，與臨床診斷一致。

圖5 家系1 NF2基因測序結(jié)果反向測序可見c>a突變，箭頭指向點突變

2.2 家系2

對先證者之子Ⅲ4的NF2基因的1-15外顯子及臨近內(nèi)含子做直接測序，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子7剪接受體位點a>g的雜合性堿基點突變。對外顯子8的直接測序為正向測序，因此直接測序圖譜上可見a>g突變及反向t>c突變(圖6)。先證者之女Ⅲ3未攜帶此突變。

圖6 家系2 NF2基因測序結(jié)果 a:直接測序圖譜上可見a>g突變，箭頭指向點突變； b:反向測序圖譜上可見t>c突變，箭頭指向點突變

3 討論

NF2基因為腫瘤抑制基因，在1993年被定為在染色體22q12上[4-5]，長度大約110 Kb，包括17個編碼外顯子。與Alfred Knudson’s的腫瘤形成2次打擊學(xué)說相一致，即2個等位基因均失活才引發(fā)腫瘤[6-7]。第1次突變源自遺傳或源自胚胎期新發(fā)生的突變，第2次突變發(fā)生在敏感靶器官細(xì)胞中另一個等位基因突變失活，繼而腫瘤發(fā)生。NF2基因編碼含有595個氨基酸的Merlin蛋白，被認(rèn)為是一種肌動蛋白相關(guān)蛋白，在細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜之間起連接作用，merlin蛋白存在2種亞基，但只有亞基1能夠形成腫瘤抑制作用的折疊蛋白[8]。NF2基因在胚胎和成人的Schwann 細(xì)胞、腦脊膜的細(xì)胞、晶體和神經(jīng)中高水平表達(dá)。因此突變時以神經(jīng)系統(tǒng)、晶體損害和皮膚腫瘤為特征。神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤主要表現(xiàn)為雙側(cè)聽神經(jīng)瘤，其他為腦神經(jīng)的神經(jīng)鞘瘤、腦脊膜瘤、脊髓的髓內(nèi)髓外腫瘤、周圍神經(jīng)病變等。眼睛的損害以白內(nèi)障、視網(wǎng)膜錯構(gòu)瘤為主要表現(xiàn)。皮膚的主要表現(xiàn)為皮膚神經(jīng)纖維瘤、皮膚咖啡斑。

NF2基因突變的位點和方式，與NF2患者的臨床癥狀、疾病嚴(yán)重程度關(guān)系密切。同一家族的患者之間，臨床表現(xiàn)存在一定的相似性，但不同家族之間的患者臨床表現(xiàn)存在較大差異[9]。當(dāng)NF2基因出現(xiàn)錯義突變、框架內(nèi)缺失突變或大片段缺失時，會造成Merlin 蛋白功能部分缺失，臨床癥狀相對較輕；而當(dāng)NF2基因發(fā)生無義突變或移碼突變時，會導(dǎo)致Merlin蛋白功能完全喪失，使患者出現(xiàn)更加嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)[10]。此外，1-5號外顯子區(qū)域突變比11-15號外顯子突變的患者發(fā)病更嚴(yán)重，但不同區(qū)域剪接位點突變的病情輕重不一[11-12]。

本研究對NF2基因的編碼區(qū)及其鄰近內(nèi)含子序列進(jìn)行了PCR擴增和DNA測序，在兩個家系中發(fā)現(xiàn)了兩個突變位點，分為內(nèi)含子2剪接供體位點g>t的突變和內(nèi)含子7剪接受體位點a>g的突變。該突變在國內(nèi)外均未見報道，屬于新的突變位點，進(jìn)一步顯示NF2基因突變譜的多樣性。在家系內(nèi)突變與表型存在一一對應(yīng)關(guān)系，即與疾病表現(xiàn)型共分離現(xiàn)象。對100名無血緣關(guān)系的健康對照者的內(nèi)含子2剪接供體和內(nèi)含子7剪接受體處進(jìn)行測序，未發(fā)現(xiàn)該突變，使得檢查結(jié)果的可靠性、可信度增加，并且排除了該基因位點多態(tài)性的可能。外顯子和內(nèi)含子的相鄰序列很保守，外顯子3’端與內(nèi)含子5’端交界處，內(nèi)含子的兩個堿基通常為GT，為剪接供體位點；外顯子5’與內(nèi)含子3’端交界處，內(nèi)含子的兩個堿基通暢為AG，為剪接受體位點。成熟的mRNA需經(jīng)過剪接、拼接等步驟除去基因中的內(nèi)含子成分，保留有編碼功能的序列。Ahronowitz等[13]將發(fā)生在-2到-1和+1到+5位點的突變歸為剪接位點突變。大多數(shù)(91/99)的突變落在上述的GT-AG序列中，86%的剪接位點的改變位于內(nèi)含子序列，相反只有14%位于外顯子。內(nèi)含子內(nèi)的突變，通常被歸為有未知作用的突變，除非有明確的RNA證據(jù)來證明。目前cDNA分析的缺乏可能會使得發(fā)生在GT-AG序列外的剪接位點突變被低估。

通過此實驗，發(fā)現(xiàn)NF2基因的致病突變必然引起NF2的發(fā)生，同一家族發(fā)病年齡接近。對于此研究中的兩個家系，找到了NF2基因的突變位點，針對此突變對家族內(nèi)成員進(jìn)行篩查，分出了突變攜帶者和未攜帶者。對突變未攜帶者，排除了其患病可能，解除其沉重的精神負(fù)擔(dān)及進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢查的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對未發(fā)病的攜帶者，每年定期MRI及聽力學(xué)檢查，使其早期診斷，得到及時正確的治療，改善疾病預(yù)后。另外，分子遺傳學(xué)診斷的另一個重要意義就是將來對家系中有需求的患者進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以避免相同疾病的再發(fā)。