使用多重PCR檢測(cè)奶牛乳房炎乳汁中的病原菌

張玉龍 ， 左之才 ， 王 宇 ， 崔耀成 ， 李志強(qiáng) ， 姚彩霞 ， 黃贊恒 ， 才冬杰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 四川 雅安 625014)

奶牛乳房炎是世界上公認(rèn)的尚未完全解決的奶牛疾病難題之一，是奶牛中最普遍且治療費(fèi)用昂貴的疾病之一[1-2]。奶牛乳房炎難以根治的原因是該病病情易反復(fù)[3]，其病因受多因素影響，如物理性損傷、化學(xué)性刺激、機(jī)體應(yīng)激性和外界病原微生物感染等[4]，而病原微生物感染而引發(fā)奶牛乳房炎占主導(dǎo)因素，其中重要的病原菌有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,S.agalactiae)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)等[5-7]。

近年來(lái)，不同地域養(yǎng)殖場(chǎng)乳房炎的主要致病菌有所差異，且臨床型乳房炎、隱性乳房炎發(fā)病率也有差異性[8-10]。李利山等通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法對(duì)天津部分地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的奶牛隱性乳房炎進(jìn)行細(xì)菌學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，臨床型乳房炎乳樣中S.aureus檢出率為40.60%，S.agalactiae為3.10%；亞臨床乳房炎乳樣品中，S.aureus檢出率為44.19%[11]。張明國(guó)等對(duì)四川省攀西地區(qū)進(jìn)行了奶牛乳房炎病原菌區(qū)系調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae在攀西地區(qū)已成為主流病原菌[12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)奶牛乳房炎病原菌的診斷進(jìn)行了大量的研究，可以用多重PCR快速診斷引起奶牛乳房炎的病原體的種類、區(qū)系分布以及血清型[13-14]。本試驗(yàn)選擇傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法和本實(shí)驗(yàn)室已建立的多重PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)3個(gè)大型奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae病原菌檢測(cè)，通過(guò)對(duì)比2種方法檢測(cè)病原菌的檢出率和吻合率，更好地探究乳房炎奶樣中P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae的感染情況。

1 材料與方法

1.1 菌株 金黃色葡萄球菌(CMCCB26001)、無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)和綠膿桿菌(CMCC10104)等菌種，均購(gòu)自于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 送檢樣本 2018—2019年間，四川洪雅A場(chǎng)(1 000頭規(guī)模)、四川邛崍A場(chǎng)(600頭規(guī)模)、四川普州A場(chǎng)(1 000頭規(guī)模)3個(gè)奶牛場(chǎng)出現(xiàn)奶牛乳房炎，牛場(chǎng)工作人員采集奶樣(以每頭牛的患病乳區(qū)為單位)經(jīng)加州乳房炎檢測(cè)法(CMT)檢測(cè)鑒定奶樣感染類型。經(jīng)判定臨床型111份、隱性型64份、健康奶樣16份，由本實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)法與多重PCR檢測(cè)法進(jìn)行病原菌檢測(cè)。

1.3 試劑與儀器 DL2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix(Blue)、滅菌雙蒸水，均購(gòu)自成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司。大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯(HBI)、卵黃甘露醇高鹽培養(yǎng)基、綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，均購(gòu)自成都浩博優(yōu)有限公司。PCR儀(Thermo Fisher，SimpliAmpTM)，電泳儀(北京六一生物科技有限公司，DYY-6D)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，GelDoc公司)。

1.4 方法

1.4.1 傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法

1.4.1.1 樣本處理 奶樣先3 000 g離心10 min，棄去上清液，用接種環(huán)挑取沉淀物，在綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，置37 ℃恒溫箱培育24 h，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)。再取不同形態(tài)的菌落接種在麥康凱瓊脂、KF鏈球菌瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂選擇培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌革蘭染色，顯微鏡檢查等。

1.4.1.2 生化試驗(yàn) 用接種環(huán)將細(xì)菌接種指定的生化培養(yǎng)基，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，經(jīng)24 h培養(yǎng)后判定結(jié)果，將各項(xiàng)生化反應(yīng)的結(jié)果與伯杰細(xì)菌手冊(cè)[15]進(jìn)行對(duì)比。主要生化特性指標(biāo)有麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、F-發(fā)酵、明膠液化、觸酶、V-P、葡萄球菌凝固酶、覃糖、環(huán)腺苷酸(CAMP)。

1.4.1.3 16S rRNA的測(cè)序 挑選每批樣品中部分菌落形態(tài)、染色鏡檢和生化結(jié)果一致的疑似菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析，將測(cè)序序列在NCBI上比對(duì)結(jié)果，并記錄好細(xì)菌種屬情況。

1.4.2 多重PCR檢測(cè)方法

1.4.2.1 奶樣的處理 奶樣先進(jìn)行混勻處理，取2 mL樣品3 000 g離心10 min，倒掉上清液并無(wú)菌挑取管底沉淀物接種到腦心浸液肉湯，置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。

1.4.2.2 PCR模板的制備 先將過(guò)夜培養(yǎng)的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基12 000 g離心2 min，棄去上清液，用雙蒸水將菌體沉淀混勻制成模板。

1.4.2.3 多重PCR反應(yīng)條件 反應(yīng)體系和條件參考文獻(xiàn)[16]，將制備好的模板進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。

1.4.3 吻合率計(jì)算 檢測(cè)吻合率/%=(2種檢測(cè)方法檢測(cè)的相同陽(yáng)性個(gè)數(shù)+相同陰性個(gè)數(shù))/被檢測(cè)的樣本量總數(shù)×100%。用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用x2檢驗(yàn)對(duì)檢出率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05為顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法的分離鑒定

2.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及鏡檢 甘露醇高鹽培養(yǎng)基上疑似S.aureus菌株生長(zhǎng)呈金黃色菌落且菌落周圍會(huì)形成1個(gè)黃色的暈環(huán)，革蘭染色鏡檢為可見(jiàn)菌落染色呈陽(yáng)性，形態(tài)是呈橢圓形，單個(gè)、成對(duì)或葡萄串狀排列。綿羊鮮血培養(yǎng)基上疑似S.agalactiae菌株生長(zhǎng)呈β溶血的濕潤(rùn)、乳白色菌落，染色鏡檢呈陽(yáng)性，形態(tài)是呈成對(duì)、成鏈排列。普通瓊脂培養(yǎng)基上疑似P.aeruginosa菌株呈光滑、微隆起、邊緣整齊波狀，并且普通瓊脂培養(yǎng)基表面呈黃綠色，染色鏡檢為陰性菌，形狀是呈成對(duì)或偶爾成短鏈排列。

2.1.2 細(xì)菌的生化試驗(yàn) 經(jīng)24 h培養(yǎng)后，根據(jù)伯杰細(xì)菌手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)株的生化特性進(jìn)行細(xì)菌分類。在細(xì)菌形態(tài)、染色鏡檢歸類的基礎(chǔ)上，通過(guò)細(xì)菌的生化結(jié)果判定樣品中S.aureus35株、S.agalactiae48株、P.aeruginosa16株。

2.1.3 16S rRNA測(cè)序 挑選每批樣品中部分細(xì)菌形態(tài)、染色鏡檢和生化結(jié)果一致的疑似菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳試驗(yàn)，通過(guò)全功能成像儀觀察凝膠電泳結(jié)果，見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification resultsM：DL2 000 DNA marker； 1:陰性對(duì)照； 2～8：陽(yáng)性樣品M:DL2 000 DNA marker; 1:Negative control; 2-8:Positive samples

將跑出目的條帶的陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI上對(duì)得到的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，疑似S.aureus菌株與GenBank中已有S.aureus序列的相似性均高于99.79%，疑似S.agalactiae菌株與GenBank中已有S.agalactiae序列的相似性均高于99.77%，疑似P.aeruginosa菌株與GenBank中已有P.aeruginosa序列的相似性均高于99.86%。

2.1.4 傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法的檢出率 在傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法鑒定中，單獨(dú)檢出9份S.aureus陽(yáng)性奶樣，單獨(dú)檢出26份S.agalactiae陽(yáng)性奶樣，單獨(dú)檢出2份P.aeruginosa陽(yáng)性奶樣。檢出13份S.aureus+S.agalactiae陽(yáng)性且P.aeruginosa陰性的奶樣，檢出5份S.aureus+P.aeruginosa陽(yáng)性且S.agalactiae陰性的奶樣，檢出1份S.agalactiae+P.aeruginosa陽(yáng)性且S.aureus陰性的奶樣，同時(shí)檢出3種菌陽(yáng)性的有8份奶樣。

2.2 多重PCR檢測(cè)方法

2.2.1 多重PCR檢測(cè)方法的檢出率 多重PCR檢測(cè)法中，用多重PCR的條件與體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2、圖3)。結(jié)果顯示，單獨(dú)檢出10份S.aureus陽(yáng)性奶樣，單獨(dú)檢出30份S.agalactiae陽(yáng)性奶樣，單獨(dú)檢出6份P.aeruginosa陽(yáng)性奶樣。檢出16份S.aureus+S.agalactiae陽(yáng)性且P.aeruginosa陰性的奶樣，檢出10份S.aureus+P.aeruginosa陽(yáng)性且S.agalactiae陰性的奶樣，檢出5份S.agalactiae+P.aeruginosa陽(yáng)性且S.aureus陰性的奶樣，同時(shí)檢出3種細(xì)菌陽(yáng)性的有9份奶樣。

圖2 部分樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of some samplesM:DL2 000 marker； 1～12、14、15:隱性乳房炎樣品； 13:正常奶樣； 16：陰性對(duì)照M:DL2 000 marker; 1-12,14,15:Subclinical mastitis sample; 13:Normal milk sample; 16:Negative control

圖3 部分樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of some samplesM:DL2 000 marker; 1～6：臨床型乳房炎樣品； 7：陰性對(duì)照M:DL2 000 marker; 1-6:Clinical mastitis milk sample; 7:Negative control

2.3 2種方法的細(xì)菌檢出率與吻合率 通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)法與多重PCR檢測(cè)法2種方法對(duì)111份臨床乳房炎奶樣、64份隱性乳房炎奶樣、16份正常奶樣中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa進(jìn)行檢測(cè)，并用卡方檢驗(yàn)對(duì)不同感染類型進(jìn)行分析，檢出份數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)吻合率公式進(jìn)行2種檢測(cè)方法吻合率比較，在111份臨床型乳房炎奶樣中，2種方法關(guān)于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出吻合率分別為92.8%、96.4%和90.1%。在64份隱性乳房炎奶樣中，2種方法關(guān)于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出吻合率分別為96.9%、89.1%和96.9%。在16份正常奶樣中，2種方法關(guān)于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出吻合率分別為100%、93.8%和93.8%。2種方法關(guān)于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的總體檢出吻合率分別為94.8%、93.7%和92.7%。在S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的單一感染和復(fù)合感染的檢測(cè)中，無(wú)論是臨床型乳房炎奶樣還是隱性乳房炎奶樣其檢出吻合率均在92%以上。

表1 乳樣中細(xì)菌檢出的結(jié)果Table 1 Results of total bacterial detection in milk samples

運(yùn)用2種方法檢測(cè)111份臨床乳房炎樣品中的病原菌，多重PCR檢測(cè)法檢出74株致病菌，檢出率為66.7%，傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法檢出51株致病菌，檢出率為45.9%，通過(guò)卡方檢驗(yàn)得出多重PCR檢測(cè)方法與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法差異顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明多重PCR檢測(cè)法可以在臨床乳房炎奶樣中進(jìn)行致病菌的檢測(cè)，臨床應(yīng)用效果比較好，并且多重PCR檢測(cè)法在綠膿桿菌檢測(cè)中敏感性比較高(表2)。

表2 2種方法對(duì)臨床乳房炎中致病菌的檢出率比較Table 2 Comparison of detection rates of pathogenic bacteria in clinical mastitis by two methods

運(yùn)用2種方法檢測(cè)了64份隱性乳房炎樣品中的病原菌，多重PCR檢測(cè)法檢測(cè)出56株致病菌，檢出率為87.5%，傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法檢測(cè)出45株致病菌，檢出率為70.3%。通過(guò)卡方檢驗(yàn)得出多重PCR檢測(cè)方法與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法差異顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明多重PCR檢測(cè)法可以運(yùn)用于隱性乳房炎奶樣致病菌的檢測(cè)，臨床應(yīng)用效果比較好(表3)。同時(shí)，在16份正常奶樣中，通過(guò)卡方檢驗(yàn)得出多重PCR檢測(cè)方法與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法差異不顯著，可能與正常乳樣的污染程度小，細(xì)菌檢出率低等相關(guān)。

表3 2種方法對(duì)隱性乳房炎中致病菌的檢出率比較Table 3 Comparison of detection rates of pathogenic bacteria in subclinical mastitis by two methods

2.4 總樣品檢出率的比較 用2種方法對(duì)191份牛奶樣本進(jìn)行檢查，對(duì)不同的感染類型進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，具體結(jié)果見(jiàn)表4。191份臨床樣品中,多重PCR檢測(cè)方法檢測(cè)出135株致病菌,檢出率為70.7%,傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法檢測(cè)出99株致病菌,檢出率為51.8%,通過(guò)卡方檢驗(yàn)得出多重PCR檢測(cè)方法與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法差異極顯著(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明多重PCR檢測(cè)法可以應(yīng)用于奶樣中混合致病菌的檢測(cè)，臨床應(yīng)用效果比較好。

表4 2種方法對(duì)不同類型致病菌的檢出率比較Table 4 Comparison of detection rates of different types of pathogenic bacteria by two methods

3 討論

3.1S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的檢出率情況 據(jù)報(bào)道S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa等病原菌感染是引起奶牛乳房炎的主要病原菌[17-19]。2005年，劉文進(jìn)等[20]對(duì)新疆墾區(qū)的7個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，S.aureus已經(jīng)取代鏈球菌成為最主要致病菌，并且P.aeruginosa的檢出率明顯增加。在本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)患有乳房炎臨床樣品檢測(cè)，結(jié)果與羅金印等[21]報(bào)道結(jié)果基本一致，但與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道結(jié)果不一致[22-25]，這說(shuō)明細(xì)菌感染率與地理位置和養(yǎng)殖環(huán)境相關(guān)。同時(shí)，丁天翊等[26]報(bào)道，奶牛乳房炎中S.agalactiae的檢出率比較高，并且混合菌株感染比單一菌株感染率高。聶培[27]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳房炎病原菌分離中S.aureus檢出率為14.7%，混合感染率達(dá)77.4%。本試驗(yàn)采用2種不同的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)3個(gè)奶牛場(chǎng)的S.agalactiae感染比較嚴(yán)重，重點(diǎn)加強(qiáng)無(wú)乳鏈球菌的預(yù)防和治療，混合感染率高于單菌株感染率。結(jié)果顯示，3個(gè)奶牛場(chǎng)的隱性乳房炎感染情況比較嚴(yán)重，加強(qiáng)隱性乳房炎的預(yù)防和治療。

3.2 傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法與多重PCR檢測(cè)方法的比較 目前已有研究者建立了S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa等細(xì)菌的多重PCR檢測(cè)方法，多重PCR檢測(cè)相較于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法具有靈敏度高、可信度強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[28-29]。前期建立的用于奶牛乳房炎的多重PCR檢測(cè)方法，沒(méi)有涉及P.aeruginosa細(xì)菌。目前，P.aeruginosa引起奶牛乳房炎的發(fā)生及檢出率增加，應(yīng)開(kāi)展針對(duì)P.aeruginosa及乳房炎相關(guān)病原菌如S.aureus、S.agalactiae等的檢測(cè)方法研究，本試驗(yàn)建立的多重PCR檢測(cè)方法可同時(shí)檢出S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)111份臨床型乳房炎奶樣并統(tǒng)計(jì)檢出S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa陽(yáng)性數(shù)據(jù)可知，傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法分別為19份、20份、12份；多重PCR方法分別為27份、24份、23份，可推測(cè)多重PCR檢測(cè)法在臨床型乳房炎奶樣檢出能力強(qiáng)于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法。結(jié)合2種方法在64份隱性乳房炎樣品及16份正常奶樣中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa陽(yáng)性奶樣的檢出率與吻合率，結(jié)果顯示多重PCR檢測(cè)法的檢測(cè)效果與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法效果吻合度均在92%以上。同時(shí)，通過(guò)卡方檢驗(yàn)對(duì)臨床乳房炎樣品、隱性乳房炎樣品及正常奶樣品的2種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，得出臨床乳房炎樣品及隱性乳房炎樣品中多重PCR檢測(cè)方法與傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法差異顯著(P<0.05)。本試驗(yàn)建立的多重PCR檢測(cè)方法可用于生產(chǎn)實(shí)踐中，在臨床乳房炎樣品中檢測(cè)S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa三種細(xì)菌的結(jié)果準(zhǔn)確可信，有利于降低檢測(cè)成本和節(jié)省確定病原菌時(shí)間[30-31]。