糖尿病斑馬魚(yú)模型研究進(jìn)展

朱 妍 綜述 秦衛(wèi)松 審校

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)最新統(tǒng)計(jì)，2019年全球有4.63億成人患有糖尿病，成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。

為深入探究糖尿病及其并發(fā)癥，動(dòng)物模型應(yīng)用越來(lái)越廣泛。糖尿病研究最常使用小型哺乳動(dòng)物模型，普遍存在成本高、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。快速、高效和低成本的斑馬魚(yú)動(dòng)物模型已成為糖尿病研究的重要手段。

斑馬魚(yú)模型的特點(diǎn)與評(píng)價(jià)

生物學(xué)特點(diǎn)斑馬魚(yú)胰腺起源于兩個(gè)芽基，背芽形成于腹芽，背芽形成于胚胎受精后24h(hours post fertilization，hpf)，主要發(fā)育為胰內(nèi)分泌腺，即初級(jí)胰島；34hpf后，腹芽形成，逐漸與背芽融合成胰腺，腹芽可分化為胰內(nèi)分泌腺和胰外分泌腺。斑馬魚(yú)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌胰腺發(fā)育的重要基因和信號(hào)通路與其他脊椎動(dòng)物同源保守[2]。受精5d后，斑馬魚(yú)胰腺的基本結(jié)構(gòu)和功能與成年哺乳動(dòng)物胰腺高度相似[3]。對(duì)胰島素敏感、參與血糖調(diào)節(jié)的其他組織器官(肝臟、肌肉、脂肪組織等)，以及一些糖代謝調(diào)控相關(guān)的分子機(jī)制，與哺乳動(dòng)物在進(jìn)化上也具有保守性[4-5]。

CRISPR/Cas9是近幾年發(fā)展具有革命性的基因編輯技術(shù)，在斑馬魚(yú)研究中的應(yīng)用已非常成熟。應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在單細(xì)胞胚胎階段注射導(dǎo)向RNA(gRNA)和Cas9 mRNA，可快速獲得基因敲除斑馬魚(yú)[6]，為研究胰腺疾病和葡萄糖代謝提供理想模型。

評(píng)價(jià)指標(biāo)血糖水平是反映胰腺β細(xì)胞功能和診斷糖尿病的常用檢測(cè)指。Jurczyk等[4]采用熒光素酶分析法檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎裂解物中葡萄糖的絕對(duì)含量，證實(shí)斑馬魚(yú)關(guān)鍵的葡萄糖調(diào)節(jié)機(jī)制在進(jìn)化上具有保守性。對(duì)于成年斑馬魚(yú)，Eames等[7]通過(guò)斷頭術(shù)取血，用血糖儀和試紙測(cè)量斑馬魚(yú)空腹和餐后血糖，并進(jìn)行腹膜內(nèi)葡萄糖耐量檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)斑馬魚(yú)血糖的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。Zang等[8]開(kāi)發(fā)出在同一斑馬魚(yú)個(gè)體重復(fù)采血的方式，可有效避免斑馬魚(yú)的死亡。近年新型的熒光葡萄糖類(lèi)似物，例如葡萄糖攝取熒光探針(2-NBDG)、Cy3標(biāo)記的葡萄糖生物探針(GB2-Cy3)等，可作為體內(nèi)葡萄糖生物探針，監(jiān)測(cè)斑馬魚(yú)細(xì)胞葡萄糖攝取水平[9]。利用斑馬魚(yú)胚胎透明的特點(diǎn)，Huang等10]構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因品系Tg(ins:GFP)，insulin啟動(dòng)子介導(dǎo)綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，顯微鏡下即可觀(guān)察斑馬魚(yú)胰腺β細(xì)胞的數(shù)量和范圍。另外，胰島素和胰高血糖素的mRNA水平可通過(guò)qPCR測(cè)定[11]。AKT磷酸化可以衡量胰島素受體活性，當(dāng)AKT磷酸化的水平降低，表明胰島素信號(hào)通路受損，可作為斑馬魚(yú)胰島素抵抗的指標(biāo)[5]。

1型糖尿病模型

1型糖尿病(T1DM)是由于免疫介導(dǎo)或特發(fā)性胰島β細(xì)胞破壞，導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏。根據(jù)誘導(dǎo)β細(xì)胞減少的模式不同，可分為藥物誘導(dǎo)性和基因修飾誘導(dǎo)性T1DM模型。

藥物誘導(dǎo)性模型早期利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(-1.0ins: eGFP)可在熒光顯微鏡下觀(guān)察的特點(diǎn)，手術(shù)切除表達(dá)熒光蛋白的胰島組織以誘發(fā)高血糖[12]。但此方法創(chuàng)傷大、成功率低，逐漸被藥物誘導(dǎo)刪減β細(xì)胞取代。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan)可誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞凋亡，已應(yīng)用于多種糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。腹膜內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)T1DM的成年斑馬魚(yú)模型，不僅表現(xiàn)出空腹血糖增高和血清胰島素水平下降，而且出現(xiàn)視網(wǎng)膜、腎臟損傷，傷口愈合不良和尾鰭再生受損[13-14]。腹膜內(nèi)注射四氧嘧啶也可導(dǎo)致β細(xì)胞壞死，但具有高致死率[12]。Benchoula等[15]提出了四氧嘧啶誘導(dǎo)模型的優(yōu)化方案，即單次腹腔注射300 mg/kg的四氧嘧啶是誘導(dǎo)斑馬魚(yú)高血糖的最佳劑量。此方法降低四氧嘧啶的毒副作用，延長(zhǎng)了高血糖癥維持時(shí)間。

基因修飾誘導(dǎo)性模型隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，可在一定條件下靶向編輯基因，使斑馬魚(yú)達(dá)到高血糖狀態(tài)。Li等[16]構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因品系Tg(1.2ins:htBidTE-ON;LR)，利用四環(huán)素和蛻皮素雙重作用于TetOn系統(tǒng)，特異性刪除β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏。另一種轉(zhuǎn)基因品系Tg(1.2ins:Kir6.2CA-GFPTE-ON; LR)，Kir6.2編碼β細(xì)胞膜上ATP依賴(lài)的K+通道的主要亞基，通過(guò)四環(huán)素誘導(dǎo)鉀離子持續(xù)流出，細(xì)胞膜超極化，使胰島素分泌減少，β細(xì)胞代償性分化減少。在轉(zhuǎn)基因魚(yú)Tg(ins：Cre)介導(dǎo)下，Tg(ins:loxp:BFPloxp:DTA)的β細(xì)胞特異性表達(dá)致死性白喉毒素α，可致細(xì)胞完全消除。β細(xì)胞缺失的斑馬魚(yú)幼魚(yú)表現(xiàn)出更高的游離葡萄糖水平，且存在顯著的發(fā)育遲緩[17]。

Pisharath等利用大腸桿菌的硝基還原酶基因(nitroreductase，NTR)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(T2Kins:nfsB-mCherry)，該斑馬魚(yú)胰腺β細(xì)胞表達(dá)NTR和mCherry的融合熒光蛋白，用甲硝唑(metronidazole，MTZ)處理轉(zhuǎn)基因魚(yú)，無(wú)毒性的MTZ被NTR還原為細(xì)胞毒性的代謝產(chǎn)物，特異性致死胰腺β細(xì)胞，最終引起血糖升高[18]。

2型糖尿病(T2DM)模型

T2DM的主要特點(diǎn)是胰島素抵抗和β細(xì)胞胰島素分泌缺陷。T2DM斑馬魚(yú)模型可分為誘發(fā)性模型和自發(fā)性模型。

誘發(fā)性模型成年斑馬魚(yú)的平均空腹血糖水平74±8.5 mg/dl，高于三倍正常值被認(rèn)為是高血糖(>200 mg/dl)。Gleeson等[19]用2%和0%的葡萄糖溶液交替浸泡28天，通過(guò)高糖暴露法建立斑馬魚(yú)糖尿病模型。最終斑馬魚(yú)血糖呈波動(dòng)性升高，合并視網(wǎng)膜病變[19]。此外，用高糖溶液連續(xù)浸泡斑馬魚(yú)14天，觀(guān)察到斑馬魚(yú)血糖持續(xù)升高，對(duì)外源性胰島素反應(yīng)減弱，肌肉胰島素受體mRNA水平降低，格列美脲和二甲雙胍治療后改善高糖代謝[20]。

肥胖是哺乳動(dòng)物T2DM的誘因之一，Zang等[21]通過(guò)飲食誘發(fā)肥胖，建立T2DM模型。將4～6個(gè)月健康成年斑馬魚(yú)分成正常喂養(yǎng)和六倍食量喂養(yǎng)，三個(gè)月后，過(guò)度喂養(yǎng)的斑馬魚(yú)空腹血糖水平顯著升高。腹膜內(nèi)葡萄糖耐量和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)表明，過(guò)度喂養(yǎng)導(dǎo)致葡萄糖耐量受損，降糖藥物治療后顯著緩解高血糖，與2型糖尿病胰島素抵抗表型相似。甲基乙二醛是終末糖基化產(chǎn)物(AGEs)的主要前體，短暫敲低乙二醛酶1可導(dǎo)致內(nèi)源性甲基乙二醛水平升高和血管改變，而永久敲除乙二醛酶1建立glo1-/-斑馬魚(yú)突變體，自發(fā)出現(xiàn)餐后血糖升高，葡萄糖耐量受損，進(jìn)一步飲食誘導(dǎo)肥胖，成年斑馬魚(yú)表現(xiàn)出空腹血糖升高和視網(wǎng)膜血管改變，提示高營(yíng)養(yǎng)攝入增加了乙二醛酶1缺乏對(duì)2型糖尿病的遺傳易感性[22]。

自發(fā)性模型Maddison等[5]利用顯性負(fù)性作用(dominant negative effect)，構(gòu)建胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin like growth factor 1 receptor，IGF-1R)的顯性負(fù)性突變體。利用α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，建立骨骼肌胰島素抵抗的斑馬魚(yú)模型Tg(acta1:dnIGF1R-EGFP) 。該模型最初表現(xiàn)為胰腺β細(xì)胞代償性增加和正常的葡萄糖耐量。隨著年齡增長(zhǎng)和飲食攝入，逐漸出現(xiàn)空腹血糖增高，β細(xì)胞數(shù)量減少和胰島素抵抗等。

瘦素(Leptin，LP)是由哺乳動(dòng)物脂肪組織產(chǎn)生的一種脂肪抑制因子，瘦素/瘦素受體缺乏的小鼠和人表現(xiàn)出食欲亢進(jìn)、肥胖、糖尿病和不育癥。研究表明，盡管缺乏瘦素受體的成年斑馬魚(yú)不表現(xiàn)出食欲增加或肥胖，但瘦素受體突變的幼魚(yú)胰島β細(xì)胞數(shù)量增加，胰島素mRNA水平升高，葡萄糖穩(wěn)態(tài)受到影響[11]。

白介素1β(IL-1β)在胰島炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)核因子κB(NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等途徑可介導(dǎo)β細(xì)胞凋亡。Luis等開(kāi)發(fā)出IL-1β介導(dǎo)胰島炎癥的斑馬魚(yú)模型 Tg(ins:il1b)，預(yù)先刪除IL-1β部分氨基酸，模擬被caspase-1切割后的活化形式，隨后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)特異性損傷β細(xì)胞的功能和特性，表現(xiàn)出葡萄糖刺激后的鈣內(nèi)流顯著減少，β細(xì)胞成熟和功能相關(guān)的基因表達(dá)下降，如轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)基因kcnj11等，出現(xiàn)葡萄糖耐量受損和高血糖癥。由于該模型直接在β細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IL-1β，與糖尿病病理生理模式存在一定差異[23]。Yin等[24]利用Cas9和多個(gè)sgRNA表達(dá)，建立了多重條件的誘變系統(tǒng)。條件性CRISPR誘導(dǎo)表達(dá)可以在時(shí)間和空間上控制Cas9表達(dá)，并且能同時(shí)靶向多個(gè)基因，提高效率，達(dá)到消除冗余或分析基因-基因互作的目的。以此構(gòu)建的肝臟胰島素抵抗斑馬魚(yú)Tg(fabp10:Cas9;CG);(U6x:sgRNA(insra/b);LC)，肝臟特異性啟動(dòng)子fabp表達(dá)Cas9，胰島素受體基因insra、insrb同時(shí)表達(dá)gRNA，造成肝臟葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致空腹低血糖和餐后顯著高血糖。

特殊類(lèi)型糖尿病模型

青年人中的成年發(fā)病型糖尿病(maturity-onset diabetes melitus，MODY),是由單基因突變的胰島β細(xì)胞功能遺傳缺陷所致的糖尿病，具有發(fā)病年齡早、常染色體顯性遺傳的特點(diǎn)。

變異的肝細(xì)胞核因子1(variant hepatocyte nuclear factor 1，vHnf1)的同源突變與MODY5有關(guān)，vHnf1斑馬魚(yú)突變體的表現(xiàn)出胰腺和肝臟發(fā)育不全、腎囊腫，但vHnf1功能?chē)?yán)重喪失的突變體，前腸局部缺陷和胰腺發(fā)育不全限制其作為研究胰腺功能模型的實(shí)用性[25]。在新型hnf1ba斑馬魚(yú)突變體中，hnf1ba功能部分喪失，導(dǎo)致MODY5樣胰腺發(fā)育不全、β細(xì)胞數(shù)量減少，且不表現(xiàn)出明顯的前腸內(nèi)胚層區(qū)域性缺陷[26]。

妊娠糖尿病模型

妊娠糖尿病對(duì)胎兒的發(fā)育具有深遠(yuǎn)的影響，Singh等[27]用脈沖式高糖暴露法，將野生型斑馬魚(yú)胚胎每間隔24h暴露于高糖環(huán)境，模擬妊娠糖尿病母體子宮內(nèi)血糖水平的變化。與對(duì)照組相比，高糖組斑馬魚(yú)胚胎總游離葡萄糖水平呈劑量依賴(lài)性波動(dòng)，平均游離葡萄糖水平顯著增高，值得注意的是，高糖幼魚(yú)同時(shí)具有明顯的視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷，視網(wǎng)膜細(xì)胞層厚度改變， Müeller膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量減少。

糖尿病并發(fā)癥模型

長(zhǎng)期高血糖以及代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害，導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官慢性進(jìn)行性病變、功能減退及衰竭。斑馬魚(yú)模型廣泛用于糖尿病并發(fā)癥的研究。

微血管并發(fā)癥糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見(jiàn)的微血管病變，是失明的主要原因之一。暴露于高糖溶液的斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜內(nèi)網(wǎng)層(inner plexiform layer,IPL)和內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)均比正常組減少，IPL顯著變薄，與其他糖尿病動(dòng)物模型和糖尿病患者表型相似[19]。Jung等[28]用高糖處理斑馬魚(yú)胚胎，第六天觀(guān)察到玻璃體-視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張伴形態(tài)學(xué)損傷，緊密連接蛋白破壞，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) mRNA和NO增多，這種短期糖尿病視網(wǎng)膜病變的模型將是用于篩選DR的潛在治療藥物的有效工具。最近，Wiggenhauser等[29]通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除轉(zhuǎn)錄因子Pdx1，pdx1-/-突變體表現(xiàn)出胰腺發(fā)育障礙和高血糖癥，并且幼魚(yú)血管擴(kuò)張，通透性增加。高血糖誘發(fā)的早期血管表型可持續(xù)到成年期，視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)中血管改變加劇，導(dǎo)致血管超支化。VEGF和NO抑制劑和降糖藥物可緩解高血糖引起的血管改變，但pdx1-/-突變體較高的死亡率限制其成年期應(yīng)用。

表1 不同基因修飾的糖尿病斑馬魚(yú)模型

腎臟并發(fā)癥糖尿病腎病是糖尿病所致的慢性疾病，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病斑馬魚(yú)，在第3周時(shí)顯示腎小球基膜(GBM)增厚[14]。Sharma等[30]發(fā)現(xiàn)利用反義嗎啉環(huán)寡核苷酸(morpholino，MO)技術(shù)敲降Pdx1誘導(dǎo)出斑馬魚(yú)高血糖，導(dǎo)致了前腎腎小球擴(kuò)張，濾過(guò)屏障高度萎縮。在敲降Pdx1的高血糖斑馬魚(yú)模型基礎(chǔ)上，同時(shí)敲降促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin， EPO)，可見(jiàn)腎臟損傷加重，腎小球長(zhǎng)度進(jìn)一步增加，前腎頸部顯著縮短，揭示了EPO在糖尿病腎病中的保護(hù)機(jī)制[31]。

神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥Dorsemans等[32]建立急性高血糖的新模型，以探究急性和慢性高血糖對(duì)腦穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)再生的影響。研究表明，急性高血糖會(huì)增加大腦促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，而慢性高血糖癥減少了腦細(xì)胞增殖和血腦屏障形成有關(guān)的基因表達(dá)。此外，高血糖會(huì)調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)乙酰膽堿酯酶功能和基因表達(dá)，使膽堿功能障礙，最終導(dǎo)致記憶力減退，加蘭他敏能夠逆轉(zhuǎn)由高血糖引起的記憶缺陷[33]。Rocker等通過(guò)NTR/MTZ介導(dǎo)的β細(xì)胞消除，高血糖幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元減少，緊密連接破壞，Schwann細(xì)胞數(shù)量改變，驗(yàn)證高血糖對(duì)斑馬魚(yú)周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的影響[34]。

心血管并發(fā)癥高血糖是心臟損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致糖尿病性心肌病。Sun等[35]成功建立糖尿病心肌病的成年斑馬魚(yú)模型。高糖處理的斑馬魚(yú)逐漸出現(xiàn)心肌肥大、細(xì)胞凋亡和心律失常。超聲心動(dòng)圖顯示心臟早期舒張功能障礙和晚期收縮功能障礙，與糖尿病患者的觀(guān)察結(jié)果一致，證實(shí)高血糖會(huì)誘導(dǎo)成年斑馬魚(yú)的心臟重塑和功能障礙。

小結(jié):斑馬魚(yú)具有嚙齒類(lèi)動(dòng)物不具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，易于轉(zhuǎn)基因操作，構(gòu)建動(dòng)物模型快速、高效，可以從分子水平精準(zhǔn)分析疾病致病機(jī)制，有效彌補(bǔ)了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和傳統(tǒng)嚙齒類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)斷層。斑馬魚(yú)胰腺的結(jié)構(gòu)、功能和糖代謝調(diào)控等與哺乳動(dòng)物高度保守，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于胰腺發(fā)育生物學(xué)研究、不同類(lèi)型糖尿病及其并發(fā)癥研究，以及糖尿病新藥篩選、藥物毒性等領(lǐng)域。多樣化的糖尿病斑馬魚(yú)模型仍在不斷構(gòu)建中，將在糖尿病疾病研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。