高效液相色譜法檢測羊奶中阿維菌素類藥物殘留

李 曼，李宏娟，馬珊珊，楊趙偉

（秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心 066000）

阿維菌素類藥物（Avermectins, AVMs）是由鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素， 是目前獸醫(yī)臨床上用量最大的抗寄生蟲藥，被廣泛應用于牛、羊等動物,在動物體內(nèi)殘留時間長[1-2]。 其作用機理是干擾害蟲神經(jīng)生理活動，致使害蟲出現(xiàn)麻痹而中毒死亡[3]。 阿維菌素類藥物對哺乳動物的毒性很低，但是長期食用含有此類藥物的奶產(chǎn)品會對人類健康產(chǎn)生潛在威脅,應對奶產(chǎn)品中阿維菌素類藥物含量進行監(jiān)測[4]。

GB/T 29696-2013 《牛奶中阿維菌素類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》 適用于牛奶中阿維菌素類藥物殘留檢測的制樣和高效液相色譜測定方法， 該方法檢測靈敏度高且不需要昂貴的儀器，普及性強[5-6]。 本文通過對該方法中的前處理方法和儀器檢測條件進行改進， 使該方法適用于羊奶中阿維菌素類藥物的檢測，對有效監(jiān)控該藥在羊的養(yǎng)殖中的應用、評價羊奶食用的安全性具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號為U3000），購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；熒光檢測器（型號為FLD-3100），購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；漩渦振蕩器（型號為MS 3），購自IKA 公司；智能高速冷凍離心機（型號為3H20RI），購自湖南赫西儀器裝備有限公司； 固相萃取濃縮裝置（型號為USE-24S），購自北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；氮吹儀（型號為TTL-Ⅱ），購自北京斯珀特科技有限公司； 電子天平（型號為XA205），購自梅特勒-托利多國際貿(mào)易 （上海） 有限公司； 電子天平 （型號為HZFA200），購自福州華志科學儀器有限公司。

1.2 試劑

阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素標準品（純度均≥94%），購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司，?，斁貥藴势罚?00μg/mL）購自天津阿爾塔科技有限公司；甲醇（色譜純）購自德國CNW 公司；乙腈（色譜純）購自德國CNW 公司；冰乙酸（色譜純）購自沈陽市試劑五廠；三氟乙酸酐（化學純）購自南京化學試劑股份有限公司；三乙胺（分析純）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；異辛烷（色譜純）購自德國CNW 公司；N-甲基咪唑（色譜純）購自西亞試劑；C18 固相萃取柱（500mg/6mL），購自沃特世科技（上海）有限公司。

洗滌液：取乙腈30mL、去離子水70mL 和三乙胺20μL，混勻；

衍生化試劑A 液：取N-甲基咪唑1mL、乙腈1mL，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

衍生化試劑B 液：取三氟乙酸酐1mL、乙腈2mL，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方法

2.1 標準溶液的配制

阿維菌素類標準儲備液： 分別精密稱取阿維菌素、 多拉菌素、伊維菌素標準品25mg, 用乙腈溶解并定容至25mL，配制成濃度為1mg/mL 的阿維菌素類標準儲備液，于2℃～8℃保存。

?，斁貥藴蕛湟海喝?mL 埃瑪菌素標準品，用乙腈稀釋定容至10mL，配制成濃度為10μg/mL 的標準儲備液，于2℃～8℃保存。

混合標準工作液：分別精密吸取阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素標準儲備液100μL（儲備液由乙腈稀釋至濃度為100μg/mL),?，斁貥藴蕛湟?mL，置于10mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得混合標準中間溶液，阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素、?，斁貪舛染鶠?μg/mL。

2.2 樣品的制備及處理

2.2.1 樣品的提取

稱取羊奶試樣2.00g±0.05g（精確到0.01g）于50mL 具塞離心管中，加乙腈4mL，渦動1min，5000r/min 離心10min，取上清液；殘渣中加乙腈4mL，重復提取一次，合并兩次上清液，加去離子水10mL,、三乙胺25μL，混勻，備用。

2.2.2 樣品的凈化

C18 柱依次用乙腈5mL 和洗滌液5mL 活化， 取備用液過柱，自然流干，抽干5min，加異辛烷3mL 洗滌，抽干5min，乙腈5mL 洗脫，收集洗脫液于10mL 試管中，于55℃水浴吹干，備用。

2.2.3 樣品的衍生化

于備用試管中依次加入衍生化試劑A 液100μL、衍生化試劑B 液150μL，密閉，渦動10s,依次加入冰乙酸50μL 和三乙胺50μL，渦動10s,于室溫下密閉反應30min,加甲醇650μL 混勻，過0.22μm 濾膜，供高效液相色譜法測定。

2.3 色譜條件確定

使 用 液 相 色 譜 柱 （型 號 為Accucore C18，150×4.6mm；2.6μm），進樣量20μL，激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長475nm，確定最佳的流動相（甲醇和去離子水）組成，流速和柱溫。

2.4 標準曲線的繪制

精密量取1μg/mL 阿維菌素類混合標準工作液適量， 用乙腈稀釋，配制成濃度為5、10、20、50、100、200μg/L 的系列標準溶液，各取1.0mL 于10mL 試管中，于55℃水浴吹干，依次加入衍生化試劑A 液100μL、衍生化試劑B 液150μL，密閉，渦動10s,依次加入冰乙酸50μL 和三乙胺50μL，渦動10s，于室溫下密閉反應30min,加甲醇650μL 混勻，供高效液相色譜測定，以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.5 方法檢出限

按照上述2.2 方法進行樣品處理， 根據(jù)樣品進行標準物質(zhì)添加回收率實驗， 以3 倍信噪比可測得的最低質(zhì)量濃度確定方法的檢出限[7]。

2.6 準確度和精確度

采用標準添加法， 在空白組織中添加3 個不同濃度（25μg/kg、50μg/kg 和100μg /kg）的阿維菌素類標準溶液進行回收率測定，每個濃度設定6 個平行樣品，同時進行空白試驗，重復3 次，計算該方法的準確度和精確度。

3 結果與討論

3.1 確定色譜條件

在選定液相色譜和色譜柱的條件下，阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素、?，斁鼐玫胶芎玫姆蛛x，標準品依次在8.321min（阿維菌素）、11.113min （多拉菌素）、14.011min （伊維菌素）、16.164min（埃瑪菌素）出峰時，此時流動相組成為甲醇+去離子水=92+8，流速1.0mL/min，柱溫25℃。準確吸取50μg/L 標準品溶液20μL， 重復進樣10 次， 在相同色譜條件下對峰面積進行分析，結果表明，峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.33%，表明該色譜條件性能穩(wěn)定。

3.2 標準曲線及線性范圍

將系列標準工作溶液，依次從低濃度到高濃度進行分析。按峰面積與對應的對照溶液的濃度做標準曲線。 其濃度在2～200μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性回歸方程及相關系數(shù)見表1，100μg /L 阿維菌素類藥物標準溶液色譜圖見圖1。

3.3 方法檢出限

羊奶空白樣品的色譜圖及羊奶空白樣品中添加50μg/kg阿維菌素類藥物的色譜圖，見圖2～3，結果顯示空白試料對所測分析物無干擾，各待測物的檢出限分別為阿維菌素1.2μg/kg、多拉菌素2.0μg/kg、伊維菌素2.3μg/kg、?，斁?.5μg/kg。

表1 阿維菌素類藥物線性方程及相關系數(shù)

圖1 阿維菌素類藥物標準溶液色譜圖（100μg /L）

圖2 羊奶空白樣品色譜圖

圖3 羊奶加標樣品色譜圖（50μg /kg）

3.4 準確度和精密度

羊奶中添加不同水平阿維菌素類藥物回收率見表2。 如表所示，四種藥物回收率達到66.7%～104%，相對標準偏差（RSD）為1.8%～5.4%。

表2 羊奶中阿維菌素類藥物添加回收率試驗結果

4 結論

羊奶中的阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素、?，斁氐人幬?，用乙腈和去離子水提取，C18 固相萃取小柱凈化，三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化，高效液相色譜-熒光法測定，回收率范圍為66.7%～104%， 相對標準偏差為1.8%～5.4%， 該方法的檢出限為1.2μg/kg～2.5μg/kg。 該方法穩(wěn)定性好，回收率高，檢測限低，具有良好的可操作性和重現(xiàn)性， 方法準確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求，適用于羊奶中阿維菌素類藥物殘留分析。