不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮含量及抗氧化活性研究

陳振興，周鳳玲，張仲敏

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

酸藤子Embelia laeta（L.）Mez為紫金?？扑崽僮訉僦参?，收載于《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第一卷），以根入藥，是瑤族經(jīng)典藥“老班藥”“七十二風(fēng)”中的風(fēng)藥之一，主要用于慢性腸炎、月經(jīng)不調(diào)、血崩、風(fēng)濕痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病［1］。研究發(fā)現(xiàn)酸藤子中含有豐富的黃酮類化合物［2］，馮旭等［3］在酸藤子中分離得到蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、金圣草黃素等黃酮類化合物。黃酮類化合物具有廣泛的藥理作用，但鮮見(jiàn)對(duì)酸藤子黃酮類成分進(jìn)行藥理研究。在廣西、廣東兩地，酸藤子資源較為豐富，民間應(yīng)用廣泛并且具有較好的臨床效果［4-5］，研究潛力巨大。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)酸藤子研究報(bào)道較少，限制了對(duì)此藥的深入研究及資源開(kāi)發(fā)。本文在前人的研究基礎(chǔ)上［6-8］，對(duì)11種不同產(chǎn)地酸藤子根的總黃酮進(jìn)行了提取和測(cè)定，并初步觀察了不同產(chǎn)地酸藤子根提取物的抗氧化作用，為酸藤子的藥物開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥 酸藤子藥材分別采自廣西壯族自治區(qū)（欽州市靈山縣、欽州市浦北縣、貴港市平南縣、玉林市容縣、柳州市鹿寨縣、南寧市青秀區(qū)、來(lái)賓市金秀縣）和廣東?。ǔ敝菔叙埰娇h、江門鶴山市、茂名市電白區(qū)、汕尾陸豐市），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室蔡毅教授鑒定為酸藤子Embelia laeta（L.）Mez。

1.2 儀器 UV-1100型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；梅特勒XS105 DualRange十萬(wàn)分之一電子分析天平［梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司］；優(yōu)普純水制造系統(tǒng)（廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司）。

1.3 試劑 總抗氧化能力測(cè)定使用試劑盒（購(gòu)于南京建成生物科技公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，純度≥98%）、水溶性維生素E類似物Trolox（純度≥98%），均購(gòu)于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；蘆?。ㄅ?hào)：wkq20030203，純度＞98%），購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；水為超純水；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取2 mg干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品，置于10 ml的容量瓶中，加70%乙醇溶解，搖勻，定容至刻度，即得0.2 mg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精確稱取11種不同產(chǎn)地酸藤子根粗粉各2 g，按料液比1∶20（g/ml）加入70%乙醇40 ml，在超聲功率300 W的條件下超聲提取40 min，抽濾，重復(fù)提取3次，濾液合并，減壓濃縮后用70%乙醇定容至100 ml，備用。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)［9-12］方法，精確吸取0.4 ml、0.8 ml、1.2 ml、1.6 ml、2.0 ml、3.2 ml對(duì)照品溶液，分別置于10 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，放置5 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，放置5 min，加4%氫氧化鈉溶液4 ml，再用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以乙醇作空白，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。以蘆丁對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（C），吸光度為縱坐標(biāo)（A），求出回歸方程：A=12.993C-0.004，r2=0.999；表明蘆丁質(zhì)量濃度在0.008～0.064 mg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精確吸取蘆丁對(duì)照品溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，按照2.2.1項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，顯色后平行測(cè)定吸光度6次，結(jié)果RSD為1.46%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精確吸取蘆丁對(duì)照品溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，按照2.2.1項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，顯色后于0 min、15 min、30 min、45 min、60 min時(shí)測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為2.44%（n=5），表明總黃酮溶液在顯色后60 min內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精確稱取汕尾陸豐市酸藤子根粉末6份，各2 g，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，取1 ml該溶液，置于10 ml容量瓶中，按照2.2.1項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，顯色后測(cè)定各溶液的吸光度，結(jié)果RSD為1.68%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精確稱取汕尾陸豐市酸藤子根粉末2 g，加入一定量的蘆丁對(duì)照品，按2.1.2項(xiàng)方法制備樣品溶液6份，取1 ml該溶液，置于10 ml容量瓶中，按2.2.1項(xiàng)方法顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算出平均加樣回收率為99.68%，RSD為2.05%（n=6），表明該方法適合酸藤子根總黃酮含量的檢測(cè)。

2.2.6 樣品測(cè)定 按2.1.2項(xiàng)方法制備11種不同地區(qū)酸藤子根的提取液，精確吸取1 ml置于10 ml容量瓶中，按2.2.1項(xiàng)方法顯色后測(cè)定吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 11個(gè)產(chǎn)地酸藤子根中總黃酮的含量（n=3）

2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定［13-15］依照測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)定，并按下列公式計(jì)算總抗氧化能力?？偪寡趸芰Γ║/ml）=（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）/0.01×30×（反應(yīng)液總量/取樣量）。式中：測(cè)定OD值為測(cè)定管吸光值，對(duì)照OD值為對(duì)照管吸光值，反應(yīng)液總量為液體總體積，取樣量為0.1 ml。計(jì)算出11種不同產(chǎn)地酸藤子根溶液濃度為20 mg/ml時(shí)的總抗氧化能力，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 11個(gè)產(chǎn)地酸藤子根溶液總抗氧化能力（n=3）

2.3.2 清除DPPH自由基能力的測(cè)定［16-17］取2.1.2項(xiàng)方法下制備的11種不同產(chǎn)地酸藤子根溶液適量，稀釋至各濃度（0.02 mg/ml、0.04 mg/ml、0.08 mg/ml、0.12 mg/ml、0.20 mg/ml），分別精密量取2 ml，與2 ml的0.1 mmol/L DPPH溶液混合搖勻，暗處?kù)o置30 min，以70%乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光度A1?？瞻讓?duì)照：取2 ml 70%乙醇與2 ml不同濃度的酸藤子根提取液混勻，暗處?kù)o置30 min，以70%乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光度A2。陰性對(duì)照：將2 ml的0.1 mmol/L DPPH與2 ml 70%乙醇混勻，暗處?kù)o置30 min，以70%乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光度A0。按公式計(jì)算出各濃度的酸藤子根提取液DPPH清除率，DPPH清除率（%）＝［1-（A1-A2）/A0］×100%，結(jié)果見(jiàn)圖1。并按上述方法測(cè)定Trolox陽(yáng)性對(duì)照物濃度分別為0.005 mg/ml、0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.04 mg/ml、0.05 mg/ml時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率，計(jì)算出Trolox溶液對(duì)DPPH的清除能力。清除能力用IC50值表示，IC50值越小說(shuō)明清除自由基的能力越強(qiáng)。不同地區(qū)酸藤子根提取液和Trolox溶液對(duì)DPPH自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 不同產(chǎn)地酸藤子根提取液對(duì)DPPH自由基清除率

表3 11種不同產(chǎn)地酸藤子根提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力 （n=3）

2.4 總黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性分析 采用Pearson相關(guān)性分析不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 總黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性結(jié)果

2.5 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行Probit回歸分析，計(jì)算DPPH自由基的半數(shù)清除濃度IC50值，并使用Pearson相關(guān)性分析酸藤子根總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性。

3 討 論

11種不同產(chǎn)地酸藤子根的總黃酮含量范圍為：11.06～29.80 mg/g。其中，南寧市青秀區(qū)酸藤子根的總黃酮含量（11.06 mg/g）最低，潮州市饒平縣酸藤子根的總黃酮含量（29.80 mg/g）最高，兩者相差3倍左右。不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮含量有所不同，可能是由于采收時(shí)間、野生環(huán)境和地理位置等因素的影響，其具體原因需要進(jìn)一步的探討。

酸藤子根中總黃酮含量較多，黃酮類成分已被證實(shí)具有一定的抗氧化作用［18］，體外抗氧化活性的測(cè)定方法有多種，所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)原理各不同，具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)［19-20］，本實(shí)驗(yàn)選用總抗氧化能力和清除DPPH自由基能力對(duì)酸藤子根總黃酮溶液的氧化活性進(jìn)行初步測(cè)定和評(píng)價(jià)?？偪寡趸芰Γ═-AOC）測(cè)定法的原理是將Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過(guò)比色法可測(cè)出其還原能力，良好的還原能力對(duì)應(yīng)著良好的抗氧化能力。11種不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮溶液的總抗氧化能力較強(qiáng)，最強(qiáng)的是汕尾陸豐市的酸藤子，最弱的是南寧市青秀區(qū)的酸藤子。其中，有8個(gè)產(chǎn)地的總抗氧化能力都在70 U/ml以上。DPPH法是篩選天然抗氧化劑、評(píng)價(jià)化合物抗氧化能力的最常用方法之一，DPPH自由基是一種人工合成的、穩(wěn)定的有機(jī)自由基，當(dāng)向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑，孤對(duì)電子被配對(duì)，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，DPPH法已在全世界范圍內(nèi)被廣泛用于自由基清除能力的定量分析［21］。本研究中，11種不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮溶液對(duì)DPPH自由基均有較好的清除能力，在0.02～0.20 mg/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，DPPH自由基清除效果增強(qiáng)，當(dāng)清除率達(dá)到80%以上后，隨著濃度的增加，清除率呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)。其中，對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)的是潮州市饒平縣的酸藤子，最弱的是南寧市青秀區(qū)的酸藤子。

不同產(chǎn)地酸藤子根所表現(xiàn)的抗氧化活性有明顯差異，通過(guò)相關(guān)性分析可知，不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮含量與總抗氧化能力相關(guān)系數(shù)為0.446（P=0.169），沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能是在總抗氧化能力評(píng)價(jià)中，發(fā)揮抗氧化作用的成分并非僅僅是黃酮類，可能還有其他化學(xué)成分，如皂苷類、酚酸類和蒽醌類成分等［2，22-23］；不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮含量與清除DPPH自由基能力相關(guān)系數(shù)為-0.646（P=0.032），分析結(jié)果表明兩者具有明顯的負(fù)相關(guān)性，即總黃酮含量越高，其半數(shù)清除濃度越低。說(shuō)明酸藤子根總黃酮含量與其清除DPPH自由基能力密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究測(cè)定了不同產(chǎn)地酸藤子根總黃酮含量，并初步分析其抗氧化作用，為今后深入研究及酸藤子資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供了有力的理論依據(jù)。