瑤族復(fù)方山茶油對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠的作用及機(jī)制研究

馮秋瑜，黎敏航，胡宇婷，黃慧學(xué)，3，梁秋云

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199；3.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200）

新生兒尿布疹，是由于被大小便浸污的尿布未及時(shí)更換或細(xì)菌感染等造成新生兒的尿布包裹區(qū)域出現(xiàn)紅腫、水皰、膿皰，甚至出現(xiàn)潰爛等皮膚炎癥反應(yīng)，屬于變應(yīng)性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）的范疇［1-2］。病灶部位的皮膚再次或反復(fù)接觸過(guò)敏原，特異性T細(xì)胞大量聚集于接觸部位，分泌過(guò)量的細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)［3］。目前，尿布疹發(fā)生率高達(dá)43.8%，由于過(guò)敏原排查難度大，臨床用藥存在很大的隨意性和盲目性［4］。本課題組在前期調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，瑤族民間常用山茶油混合扛板歸、火炭藤、黃連、黃柏等藥材涂抹于尿布疹部位，效果顯著。本研究通過(guò)2，4-二硝基氯苯（DNCB）誘導(dǎo)的小鼠ACD模型，探討瑤族復(fù)方山茶油的作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 BALB/c小鼠，雄性，3周齡，體質(zhì)量14～16 g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2014-0003。小鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 試藥 ①瑤族復(fù)方山茶油（SCY）：將蛇不過(guò)、火炭藤、黃連、黃柏、石韋等藥材搗爛，加山茶油適量，浸泡48 h，用80目篩濾過(guò)除去藥渣，得到高劑量瑤族復(fù)方山茶油（SCY-H，0.50 g生藥/ml），取SCY-H適量，用山茶油稀釋得中劑量瑤族復(fù)方山茶油（SCY-M，0.25 g生藥/ml）、低劑量瑤族復(fù)方山茶油（SCY-L，0.125 g生藥/ml），備用。上述藥材由廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定：山茶油為山茶科植物油茶（Camellia oleiferaAbel）的種子經(jīng)壓榨而得的植物油；扛板歸為蓼科植物扛板歸Polygonum perfoliatumL.的莖葉；火炭藤為蓼科植物火炭母Polygonum chinenseL.的全草；黃連為毛茛科植物短萼黃連Coptis chinensisFranch.var.brevisepalaW.T.Wang et Hsiao的根莖；黃柏為蕓香科植物禿葉黃皮樹(shù)Phellodendron chinense var.glabriuscu?lumSchneid.的樹(shù)皮；石韋為水龍骨科植物廬山石韋Pyrrosia sheareri（Bak.）Ching的全草。②尤卓爾丁酸氫化可的松乳膏：每1 g含丁酸氫化可的松1.0 mg，天津金耀藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：17100301。用時(shí)稀釋至1 mg/ml的濃度。③2，4-二硝基氯苯（DNCB）：美國(guó)Sigma-Aldrich產(chǎn)品。

1.3 試劑 IgE、INF-γ、IL-4等ELISA試劑盒：美國(guó)BD Biosciences產(chǎn)品。

2 方 法

2.1 造模及藥物干預(yù) 取BALB/c小鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常對(duì)照組、模型組、SCY-H組、SCY-M組、SCY-L組和氫化可的松組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余小鼠于實(shí)驗(yàn)前1 d腹部刮毛，面積約3 cm×3 cm，以5% DNCB丙酮-橄欖油（4∶1）溶液致敏，每只涂予25μl。致敏后5 d，于小鼠右耳以0.25%DNCB丙酮-橄欖油（4∶1）溶液20μl激發(fā)，左耳涂等量丙酮-橄欖油（4∶1）作對(duì)照［5］。各實(shí)驗(yàn)組于DNCB激發(fā)后1 h開(kāi)始給藥，每隔1 h給藥1次，連續(xù)給藥7次。氫化可的松組和SCY各劑量組涂以相應(yīng)藥物，每次25μl，正常對(duì)照組和模型組以蒸餾水替代。

2.2 觀察指標(biāo)與方法

2.2.1 耳腫脹度及耳腫脹抑制率的測(cè)定 DNCB激發(fā)后24 h，脫頸處死小鼠，剪下雙耳，用6 mm打孔器取雙耳片，稱(chēng)重，計(jì)算耳腫脹度和耳腫脹度抑制率。公式如下：耳腫脹度（mg）=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量；耳腫脹抑制率（%）=（模型組右耳質(zhì)量平均值-實(shí)驗(yàn)組右耳質(zhì)量）/模型組右耳質(zhì)量平均值×100%。

2.2.2 血清中IgE含量的測(cè)定 小鼠處死前5 min行眼球采血，4℃、3 500 r/min離心15 min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中IgE的含量。

2.2.3 耳勻漿中INF-γ和IL-4含量的測(cè)定 取稱(chēng)重后的右耳，用預(yù)冷的PBS研磨制成2.0%的勻漿，4℃、3 500 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定勻漿液中INF-γ和IL-4的含量，計(jì)算INF-γ/IL-4比值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較選用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 SCY對(duì)ACD小鼠耳腫脹的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠耳腫脹明顯（P＜0.01）；與模型組比較，氫化可的松組和SCY各劑量組對(duì)小鼠耳腫脹均有明顯抑制作用（P＜0.01），且SCY對(duì)小鼠耳腫脹抑制率與劑量呈正相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 SCY對(duì)ACD小鼠耳腫脹的影響（n=10，x±s）

3.2 SCY對(duì)ACD小鼠血清中IgE和耳勻漿中INF-γ、IL-4含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IgE和耳勻漿中INF-γ、INF-γ/IL-4比值明顯升高（P＜0.01），而耳勻漿中IL-4水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，SCY高劑量組能降低血清中IgE水平（P＜0.01）；SCY各劑量組還能抑制耳勻漿中的INF-γ上升，恢復(fù)INF-γ/IL-4比值的平衡（P＜0.05或P＜0.01），但對(duì)IL-4水平未見(jiàn)明顯影響（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 SCY對(duì)ACD小鼠血清中IgE和耳勻漿中INF-γ、IL-4含量的影響 （n=10，x±s）

4 討 論

目前，隨著嬰幼兒護(hù)理技術(shù)和方法的不斷提高，以大面積糜爛、潰瘍的Ⅲ度尿布疹已少見(jiàn)，多為肛周與臀部皮膚紅腫，或有少量潰爛、滲出的Ⅰ、Ⅱ度尿布疹［6］。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠右耳接受抗原DNCB刺激后，再次接觸DNCB而表現(xiàn)出的紅斑、水腫及易有滲出液的ACD特征，與臨床Ⅰ、Ⅱ度尿布疹病理學(xué)特征相似。依據(jù)首都醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科推薦的尿布疹療效診斷標(biāo)準(zhǔn)，用藥24～48 h后臀部紅斑、丘疹等消退為顯效；用藥72 h后潰瘍消失，局部丘疹、水腫基本消退為有效［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用1 d內(nèi)多次給藥、觀察瑤族復(fù)方山茶油給藥后24 h的療效。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠耳腫脹明顯，血清中IgE水平顯著上升，符合ACD病理過(guò)程。SCY在24 h內(nèi)能明顯抑制小鼠耳腫脹，且存在劑量依賴(lài)性；SCY高劑量組還能顯著降低血清中IgE水平，提示SCY對(duì)ACD的改善作用與其降低機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)。

瑤藥的組方配伍主要為主藥、配藥和引路藥。瑤醫(yī)認(rèn)為［8］，尿布疹發(fā)病原因主要是由于新生兒胎中蘊(yùn)毒未清，或因其后天喂養(yǎng)不當(dāng)，飲食失調(diào)，脾胃受損，濕熱之邪浸淫血脈，郁于肌腠?；純函彾荆ㄌザ荆┗驖駸嶂斑^(guò)盛為盈，機(jī)體脾胃受損為虧，盈虧失衡，發(fā)為本病。治則為風(fēng)虧打盈，打其毒邪之盈，健其脾胃；治法為清熱燥濕、散瘀消腫、祛風(fēng)止癢、健胃利水?，幾鍙?fù)方山茶油中的山茶油，味苦，性平，具有行氣除滯、消腫止痛、清熱解毒、殺蟲(chóng)止癢之功效，屬于打藥；扛板歸與火炭母能清熱解毒、收斂止癢、利水消腫，皆為打藥，能助山茶油清熱止癢、消腫止痛；黃連與黃柏能清熱燥濕、解毒療瘡，為風(fēng)打相兼藥，助主藥加強(qiáng)涼血解毒、療瘡止癢之功；石韋清熱解毒、利水通淋，為風(fēng)藥，用之作引路藥，引瘡毒和濕邪下行；以上風(fēng)虧打盈配伍，能起到清熱燥濕、散瘀消腫、祛風(fēng)止癢的功效。因本復(fù)方為外用藥，故在治標(biāo)之際，仍需在患兒日常喂養(yǎng)時(shí)注意調(diào)養(yǎng)其脾胃，最終達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。

研究表明，ACD主要是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)、Th2細(xì)胞和多種細(xì)胞因子參與的Ⅳ型超敏反應(yīng)，其中Th1/Th2比值的失調(diào)是重要環(huán)節(jié)［9］。Th1細(xì)胞能活化巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2則輔助B細(xì)胞活化，發(fā)揮體液免疫的功能。INF-γ和IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞分泌的代表性細(xì)胞因子，二者之間存在交互調(diào)節(jié)、相互拮抗的作用，維持著免疫平衡的作用［10］。當(dāng)INF-γ和/或IL-4水平異?？梢l(fā)Th1/Th2比值改變，導(dǎo)致ACD的發(fā)生［11］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠耳勻漿中INF-γ水平明顯升高，而IL-4則顯著降低，導(dǎo)致INFγ/IL-4比值增大；通過(guò)SCY的治療，雖然IL-4水平上升水平不顯著（P＞0.05），但能下調(diào)INF-γ水平，恢復(fù)INF-γ/IL-4比值的平衡，提示SCY對(duì)ACD的作用機(jī)制與下調(diào)炎癥部位INF-γ水平及調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡有關(guān)。