不同年份普洱生茶體外抗氧化活性與生化成分相關性分析

楊雪梅，趙建銳，劉瑩亮，李家華*

（1.滇西應用技術大學普洱茶學院，云南普洱665000；2.云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南昆明650201）

普洱生茶是在普洱茶地理標志規(guī)定范圍內以云南大葉種茶鮮葉為原料，經(jīng)殺青、揉捻、日光干燥、蒸壓成型等工藝制成的緊壓茶，其品質特征為：外形色澤墨綠、香氣清純持久、滋味濃厚回甘、湯色綠黃清亮，葉底肥厚黃綠[1]。大量研究證實普洱生茶具有多種保健功能，如降血脂、預防心血管疾病、抗癌抗突變、抗氧化、增強機體免疫力、改善動脈粥樣硬化等[2-3]。普洱生茶與其它茶類相比，具有耐儲存特點，且隨著儲存時間的推移，其主要生化成分發(fā)生轉化而使其品質得到提高，從而使普洱生茶具備較高的品飲價值[4]。普洱生茶的儲存年限是品質好壞的一個重要指標，也是普洱生茶研究領域的一個難點[5]。經(jīng)過長時間的儲存（10 年或者10 年以上），其滋味和香氣可達最佳[6-7]。在自然儲存過程中，生茶中內含成分含量會發(fā)生變化，此外，由于茶葉的自動氧化作用，導致生茶主要生化成分的變化趨勢和熟茶的后發(fā)酵過程中成分變化走向較相似。

相關研究證實普洱茶具有顯著的降脂減肥、抗脂質過氧化、抗衰老等生理功能[8-10]。近年來，隨著對普洱茶生物活性以及功效研究的不斷深入，世界各國已經(jīng)認識到普洱茶的多重功效，其中抗氧化性是多種保健作用的基礎。但是目前學者主要展開的研究是針對不同類型茶葉抗氧化功能的比較分析[11-13]。在普洱茶的研究領域中，主要開展的是對不同發(fā)酵程度普洱熟茶抗氧化活性的測定[14-16]。本文對不同儲存年份的普洱生茶體外抗氧化活性與生化成分的相關性進行研究。旨在為普洱茶生產(chǎn)企業(yè)和普洱茶愛好者正確儲存或收藏普洱茶提供數(shù)據(jù)支撐，為消費者合理、正確選擇普洱茶產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樣：云南雙江勐庫茶葉有限責任公司，相同等級標準、相同存放地、不同儲存年份（2006 年～2015 年）的普洱生茶標準樣品為試驗茶樣，規(guī)格為357 g。

（+）-兒茶素[（+）-catechin，C]、表兒茶素[epicatechin，EC]、表沒食子兒茶素[epigallocatechin，EGC]、表兒茶素沒食子酸酯[epicatechin gallate，ECG]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[epigallocatechin gallate，EGCG]：維克奇生物科技有限公司；VC：德國DRE 公司；DPPH：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒、羥基自由基清除能力測試試劑盒：南京建成生物工程研究所。以上試劑均為分析純。甲醇、乙腈（色譜純）：美國安捷倫有限公司。

1.2 儀器與設備

X-5 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；12C00 型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；HHS 型恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；BS110 s 電子分析天平：德國Sartorius 儀器公司；ZMQS5001 型純水儀：美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 不同年份普洱生茶水提物的制備

準確稱取磨碎試樣3 g；加450 mL 沸水，在沸水浴中浸提45 min，每一個樣品設立3 個平行，每隔10 min搖瓶一次，過濾。洗滌殘渣，濾液合并于500 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，備用。

1.3.2 水提物生化成分測定

茶多酚的測定方法：采用GB/T 8313—2002《茶茶多酚的測定》中的酒石酸亞鐵比色法測定。

游離氨基酸的測定方法：采用GB/T 8314—2002《茶游離氨基酸總量測定》中的茚三酮比色法測定。

兒茶素、咖啡堿的測定方法：高效液相色譜法[17]。

含水量的測定方法：快速法[18]。

水浸出物的測定方法：采用GB/T 8305—2002《茶水浸出物測定》中的沸水萃取法測定。

1.3.3 體外抗氧化活性測定

將不同儲存年份的普洱生茶水提物稀釋為（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg 干茶/mL），待用。

稱取0.1 g VC用超純水溶于100 mL 容量瓶中，定容搖勻后稀釋VC溶液到不同濃度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），待用。

1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力測定

取一定量（4.0 mg）的DPPH，用無水乙醇（100 mL）配制成0.04 mg/mL 的DPPH 溶液。分別取2 mL 不同濃度梯度的茶湯待測液，再加入2 mL 的DPPH 溶液混合均勻，暗反應15 min。用VC作為陽性對照，無水乙醇作空白對照，取上清液于517 nm 處測吸光值。DPPH自由基清除率/%=[1-（A樣品-A空白）/A對照]×100

1.3.3.2 總抗氧化能力測定（T-AOC）

按照T-AOC 試劑盒加樣表嚴格加樣，以VC為陽性對照，取樣量為1 mL。

總抗氧化能力/（U/mg）=[（測定OD 值-對照OD 值）÷0.01]÷30×（反應液總量÷取樣量）÷待測樣本濃度

1.3.3.3 羥基自由基清除率的測定

按照羥基自由基清除能力測試試劑盒加樣表嚴格加樣。以VC為陽性對照，取樣量為0.2 mL。

羥基自由基清除能力/（U/mg）=[（對照管OD 值-測定OD 值）÷（標準管OD 值-空白管OD 值）]×標準樣品濃度÷（待測樣本濃度×取樣量）

1.3.3.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定

1）取5 mL Tris-HCl 加入0.5 mL 樣本溶液，混合均勻后25 ℃下預熱20 min；然后加入鄰苯三酚0.5 mL，在25 ℃下繼續(xù)保持4 min，加0.5 mL 濃鹽酸終止反應。在325 nm 波長處測吸光值為Ai。

2）用0.5 mL 的去離子水代替1）中的0.5 mL 鄰苯三酚，其余操作同上，測其吸光值為Aj。

3）空白管：用0.5 mL 去離子水代替1）中的0.5 mL樣品溶液，吸光值為A0。

超氧陰離子自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）÷A0]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Excel 2016 和SPSS 64.0 軟件進行處理；選擇Duncan’s 檢驗在p＜0.05 檢驗水平上對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。選擇Pearson 相關系數(shù)在p＜0.01 和p＜0.05 檢驗水平上對數(shù)據(jù)進行相關分析。所有數(shù)據(jù)均是3 次測試的平均值。

2 結果與分析

2.1 不同儲存年份普洱生茶主要生化成分含量分析

不同儲存年份普洱生茶主要生化成分含量見表1。

由表1 可知，供試樣隨著儲存時間的增加含水量呈整體上增加的趨勢，茶多酚、氨基酸均隨儲存時間的增加呈整體下降趨勢。但供試樣水浸出物、咖啡堿含量變化與儲存年份的變化無規(guī)律可循。

不同儲存年份普洱生茶兒茶素各組分含量見表2。由表2 可知，不同儲存年份普洱生茶5 種主要兒茶素組分含量無變化規(guī)律。其中，EGCG 含量變幅為4.86%～7.12%，ECG 含量變幅為4.86%～6.34%，EGC 含量變幅為1.86%～2.98%，EC 含量變幅為1.22%～1.68%，C 含量變幅為0.58%～0.82%。與戚康標等研究結果相一致[19]。造成這一現(xiàn)象的原因可能是供試樣在存放過程中，酯型兒茶素發(fā)生降解轉化成為簡單兒茶素，同時酯型兒茶素也會發(fā)生自動氧化，轉化為其它物質，從而導致酯型兒茶素含量在兒茶素總量中的比例呈下降趨勢。

表1 不同儲存年份普洱生茶的主要生化成分含量Table 1 The contents of major biochemical components in nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years %

表2 不同儲存年份普洱生茶兒茶素各組分含量比較Table 2 Determination of catechins in nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years %

2.2 不同儲存年份普洱生茶體外抗氧化活性測定

2.2.1 DPPH 自由基的清除能力

研究以VC為陽性對照，測定了VC和不同儲存年份普洱生茶在不同濃度下對DPPH 自由基的清除能力，回歸方程和IC50值結果見表3。

表3 不同年份普洱生茶對DPPH 自由基的清除率Table 3 The clearance rate of DPPH radical of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years

從表3 可知，VC和不同儲存年份的普洱生茶水提物對DPPH 自由基均表現(xiàn)出顯著的清除效果，且量效呈線性關系，線性相關系數(shù)R2值均大于0.95。根據(jù)標準曲線可知，VC的IC50為0.135 mg/mL，10 個不同儲存年份普洱生茶的IC50值范圍為：0.515 mg/mL～1.243 mg/mL。即DPPH 自由基的清除能力強弱順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.2 超氧陰離子自由基的清除能力

圖1 是10 個不同儲存年份普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時對超氧陰離子自由基的清除率。

圖1 相同濃度不同儲存年份生茶對超氧陰離子自由基清除率Fig.1 The scavenging ratio of superoxidefree radical of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years in the same concentration

從圖1 可知，不同儲存年份的普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時，其對超氧陰離子自由基的清除率的變化范圍是：17.01%～69.60%，且隨儲存時間的增加而降低。根據(jù)標準曲線可知，當VC清除率為17.01%和69.60%時，濃度分別為0.026 mg/mL 和0.23 mg/mL。即對超氧陰離子自由基的清除能力順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.3 羥基自由基的清除能力

圖2 是10 個不同儲存年份普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時對羥基自由基清除能力。

圖2 相同濃度不同儲存年份生茶對羥基自由基清除能力Fig.2 The scavenging activity of hydroxylfree radicals of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years in the same concentration

從圖2 可知，不同儲存年份的普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時，其對羥基自由基清除能力的變化范圍是：39.41 U/mg～48.15 U/mg，且隨儲存時間的增加而降低。即對羥基自由基清除能力順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.4 總抗氧化能力

圖3 是10 個不同儲存年份普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時的總抗氧化能力。

從圖3 可知，不同儲存年份的普洱生茶水提物濃度為1.0 mg 干茶/mL 時，其總抗氧化能力的變化范圍是：3.19 U/mg～7.88 U/mg，且隨儲存時間的增加而降低。即總抗氧化能力的強弱順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011 年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007 年生茶＞2006 年生茶。

圖3 相同濃度不同儲存年份生茶的總抗氧化能力Fig.3 The total antioxidant capacity of of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years

不同儲存年份普洱生茶DPPH 自由基清除能力、超氧陰離子自由基的清除能力、羥基自由基清除能力、總抗氧化能力均隨儲存時間的延長而降低，其中超氧陰離子自由基的清除能力下降幅度最大，降幅達到75.61%；其次是總抗氧化能力，降幅達到59.52%。這與趙熙等研究結果相一致[20]。

2.3 體外抗氧化活性與生化成分的相關性分析

表4 是普洱生茶的體外抗氧化活性與對應生化成分的相關性分析。

表4 體外抗氧化活性與生化成分的相關性分析Table 4 Correlation analysis of antioxidant activity and biochemical components in vitro

從表4 中可以看出，普洱生茶的體外抗氧化活性和生化成分都呈現(xiàn)正相關。其中抗氧化活性與茶多酚和氨基酸有極顯著相關性（p＜0.01），與兒茶素總量有顯著相關性（p＜0.05），其次是咖啡堿和水浸出物。這與馬慧等研究結果相一致[21]。其原因可能是：隨著儲存時間的增加，普洱生茶在多酚氧化酶的作用下，兒茶素類會發(fā)生氧化反應和氧化偶聯(lián)反應等生成了鄰苯酚醌及鄰醌類物質。在此過程中，多酚羥基的數(shù)量會減少，所以抗氧化能力也就相應降低。氨基酸具有一定的抗氧化活性，但是相比于一些酚類、黃酮類、維生素類強抗氧化劑，氨基酸的抗氧化活性相對較小。由于氨基酸和其它抗氧化劑的還原電位不同決定了二者之間發(fā)生修復再生作用，即協(xié)同抗氧化能力，所以，氨基酸發(fā)揮其抗氧化活性的作用機理之一便是與其它抗氧化劑發(fā)揮協(xié)同抗氧化的作用[22]。隨著儲存時間的增加，氨基酸會發(fā)生降解，也會與多酚類反應生成了不同分子量的聚合物，所以氨基酸含量會降低，導致抗氧化能力也就相應降低?？Х葔A化學性質不活潑，是一種嘌呤堿雜環(huán)化合物，難以參與氧化降解反應，但咖啡堿和多酚類會因修復再生的關系發(fā)揮協(xié)同抗氧化的作用[23]。茶葉水浸出物中含有多酚類（包括水溶性色素）、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水溶維生素、水溶果膠、水溶蛋白、無機鹽等，因而茶葉中的水溶性成分抗氧化性有一定的復雜性[23]。

3 結論

本試驗將茶葉水提物與VC的抗氧化能力進行比較，結果發(fā)現(xiàn)普洱生茶水提物有較高的體外抗氧化活性。且體外抗氧化活性和生化成分都呈現(xiàn)正相關性，其中與茶多酚和氨基酸含量呈極顯著正相關，表明茶葉中茶多酚具有良好的抗氧化性能，為茶多酚作為抗氧化劑應用到食品加工中提供了一定的依據(jù)。