應(yīng)用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發(fā)酵薄荷抗氧化功能研究

劉賀，彭聲靜，張瑜瑜，尹利方，賈巧莉

（1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650214；2.云南省曲靖市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南曲靖655000）

薄荷作為最受歡迎的藥用植物之一，廣泛用于家庭、調(diào)味品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)，其抗氧化性可預(yù)防白內(nèi)障及其它與衰老有關(guān)的疾病，薄荷提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有抑制作用[1]。此外，其風(fēng)味在世界范圍內(nèi)均廣為人知，是全世界第三大受歡迎風(fēng)味。

近年來，由于消費(fèi)趨勢(shì)向健康食品發(fā)展，一些涼茶即草本植物混合飲料因其獨(dú)特風(fēng)味及潛在的功能特性受到歡迎。其加工方法為熱水提取草本植物的葉子、種子、根或樹皮等，其中薄荷茶是受歡迎的涼茶之一。然而目前草本茶在茶加工過程中其功能性物質(zhì)常常遭到破壞，降低其本身營養(yǎng)價(jià)值[2]。近年來研究表明，發(fā)酵食品可有助于促進(jìn)胃腸道健康，用合適的菌種發(fā)酵是解決各種果蔬生產(chǎn)過剩和促進(jìn)加工利用的最佳途徑[3]，且通過發(fā)酵，果蔬汁的抗氧化性均有所提升，Ryu 等[4]用植物乳桿菌CK10 發(fā)酵奇異果果汁發(fā)現(xiàn)發(fā)酵處理可提高奇異果果汁的DPPH 自由基及ABTS自由基清除能力；Hashemi 等[5]用植物乳桿菌LS5 發(fā)酵檸檬汁發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后，檸檬汁的抗氧化性增加；李敏杰等[6]也發(fā)現(xiàn)，用紅茶菌發(fā)酵芒果果汁制酒，總酚含量、DPPH 自由基和羥自由基清除率均會(huì)上升，發(fā)酵第8 天達(dá)到峰值。然而目前有關(guān)發(fā)酵增強(qiáng)抗氧化性的研究大部分集中在果汁上，對(duì)草本植物發(fā)酵方面研究較少[2]。因此為促進(jìn)薄荷加工，保留和提高其抗氧化等功能性，本研究開發(fā)了一種薄荷的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發(fā)酵工藝。嗜酸乳桿菌可定殖于人體腸道而改善機(jī)體健康，且可產(chǎn)生全新風(fēng)味[7]。研究發(fā)現(xiàn)，這種加工方法薄荷的抗氧化性得以保存及增強(qiáng)，因此，薄荷具有進(jìn)一步開發(fā)成為一種新型功能性食品的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

留蘭香薄荷：市售；甲醇、無水碳酸鈉、三氯化鋁、亞硝酸鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；蘆丁、沒食子酸、DPPH 自由基、過氧化物酶（4.4 μ/mL）、2，2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azi nobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）-diammonium salt，ABTS]：美國Sigma 公司；過氧化氫：德國默克公司；嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus：科漢森（菌株型號(hào)FD-DVS LA-5）；瓊脂：美國BD Difco 公司。

AL204 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHJ-A 恒溫振蕩儀：金壇市華峰儀器有限公司；SP-2100UV 紫外/可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.2 薄荷材料及菌株準(zhǔn)備

將購于市場(chǎng)的薄荷株進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)其根、莖、葉進(jìn)行分離和洗滌，將500 mL 去離子水分別加入到100 g根、莖、葉中，在室溫25 ℃下用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)，薄荷汁用于后續(xù)接種使用。

在嗜酸乳桿菌接種前，將其分別在MRS 瓊脂平板和MRS 肉湯上繼代培養(yǎng)兩次。

1.3 活菌計(jì)數(shù)、可溶性固形物含量及pH 值測(cè)定

用平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）測(cè)定活菌數(shù)（viable bacterial count，VBC）、以手動(dòng)折光儀測(cè)定可溶性固形物總量（total soluble solids，TSS），結(jié)果以°Brix表示，pH 值以手持pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 薄荷發(fā)酵樣品制備

將5 mL 乳酸菌發(fā)酵劑（5×106CFU/mL）接種到100 mL 薄荷根、莖、葉汁中，于37 ℃下發(fā)酵60 h。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵樣品進(jìn)行凍干，然后將凍干樣品進(jìn)行研磨后備用。

1.5 薄荷新鮮樣品制備

分別取薄荷根、莖、葉5 g，以甲醇溶液300 mL 分次于80 ℃水浴中浸提30 min，提取液過濾后，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL 左右自然揮干溶劑，稱量粗提物質(zhì)量，并將其以去離子水定容至10 mL，待測(cè)。

1.6 總抗氧化活性測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[8-9]。將過氧化物酶、50 μmol/L 過氧化氫、100 μmol/L ABTS 與1 mL 去離子水混合，于25 ℃置于黑暗環(huán)境中反應(yīng)。接著添加1 mL 薄荷發(fā)酵液，并在734 nm 下測(cè)定吸光度。使用下式計(jì)算抗氧化能力。

1.7 還原力測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[10]。將1 mL 薄荷發(fā)酵液、磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6，0.5 mL）和鐵氰化鉀溶液（1%，2.5 mL）混合并在50 ℃下加熱20 min。冷卻至25 ℃后，添加0.5mL 10%三氯乙酸。在5 000 r/min 下離心10 min后，取1 mL 上清液與1 mL 去離子水和0.1 mL 0.1%氯化鐵混合后保持反應(yīng)10 min。測(cè)定反應(yīng)混合物700 nm下吸光度，吸光度高則表明還原能力較高。

1.8 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[11]。0.1 mL 薄荷發(fā)酵液加入到3.9 mL 的125 μmol/L DPPH·甲醇溶液中，振蕩后于25 ℃避光穩(wěn)定30 min，在517 nm 下以甲醇為參比測(cè)定吸光度。對(duì)照液為0.1 mL 甲醇加入到3.9 mL 的125 μmol/L DPPH·甲醇溶液中。樣品的自由基清除率可根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算。

1.9 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[12]。將120 μmol/L 的吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、936 μmol/L 的α-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（α-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase，α-NADH）和300 μmol/L的硝基藍(lán)四氮唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）溶液與50 μL 的薄荷發(fā)酵液混合反應(yīng)5 min，記錄560 nm下吸光度。自由基清除能力按下式計(jì)算。

1.10 總酚及總黃酮含量測(cè)定

總酚含量測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[11，13]。取待測(cè)液0.2 mL 加去離子水至總體積5 mL，加入5 mL 福林酚試劑（使用前以去離子水稀釋兩倍）及5 mL 10%Na2CO3溶液，振蕩試管，25 ℃下保溫1 h，725 nm 下測(cè)定吸光度。總酚含量通過沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算，多酚含量表示為mg 沒食子酸/g 干物質(zhì)量。測(cè)定3次，取平均值。

總黃酮含量測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[14]。取待測(cè)液1mL，加入5%亞硝酸鈉1 mL，靜置6 min 后再加入10%三氯化鋁1 mL，搖勻，放置6 min 后加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，以30%乙醇溶液定容至50 mL，在波長510 nm下測(cè)定吸光度?？傸S酮含量通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算，總黃酮含量表示為mg 蘆丁/g 干物質(zhì)量。測(cè)定3次，取平均值。

1.11 感官品評(píng)

選取品評(píng)員30 名（男12，女18，平均年齡20.8歲），發(fā)酵薄荷汁以0∶1、1∶1、1∶0 體積比與新鮮果汁混合。要求品評(píng)員對(duì)產(chǎn)品的顏色、香氣、甜度、澀度及整體可接受度以0～10 分進(jìn)行打分，其中0 分為接受度最低，10 分為接受度最高。

1.12 數(shù)據(jù)分析及處理

所有的試驗(yàn)重復(fù)至少3 次，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，以方差分析ANOVA 來檢測(cè)平均值之間的顯著性差異，P＜0.05。用OriginPro 8.0 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

薄荷直接榨汁測(cè)得總固形物含量（TSS）為6.7°Brix，pH 5.5，這些值與通常用作發(fā)酵的水果如蘋果（TSS：20.5°Brix）有很大不同。這可能也導(dǎo)致了薄荷發(fā)酵時(shí)間（40 h 左右）遠(yuǎn)低于蘋果發(fā)酵時(shí)間（60 h）。將薄荷的不同部位即根、莖、葉作為發(fā)酵底物，發(fā)酵時(shí)間為32 h時(shí)測(cè)得基質(zhì)pH 值最低，為3.5，且均在此之后pH 值有所上升。對(duì)薄荷不同部位發(fā)酵液的總抗氧化性、還原力、自由基清除能力、抗氧化相關(guān)成分含量進(jìn)行分析，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官分析，以期為薄荷的發(fā)酵產(chǎn)品加工提供參考。

2.1 不同部位薄荷液發(fā)酵前后總抗氧化能力、還原力研究

物質(zhì)總的抗氧化能力是物質(zhì)清除不同自由基或者是物質(zhì)的不同活性成分清除不同的自由基的有效和，鑒于物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)起作用的正是其總的抗氧化能力，因此用總的抗氧化能力來評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力是很有必要的。根莖葉對(duì)照、發(fā)酵液總抗氧化能力及還原力見表1。

表1 根莖葉對(duì)照、發(fā)酵液總抗氧化能力及還原力Table 1 Total antioxidant capacity and reducing power of control and fermentation broth from roots，stems and leaves

ABTS 法被廣泛用于果蔬等物質(zhì)的抗氧化能力的測(cè)定[15]。結(jié)果如表1 第一列數(shù)據(jù)所示，薄荷不同部位未發(fā)酵對(duì)照及發(fā)酵液的總抗氧化能力范圍在54.2%～74.9%之間，與未發(fā)酵的對(duì)照相比，薄荷根、莖、葉發(fā)酵液的總抗氧化能力均有所提高，且差異具有顯著性。其中根部發(fā)酵液的總抗氧化能力要高于其它部位發(fā)酵產(chǎn)品，且差異呈現(xiàn)顯著性（P＜0.05）。

還原力也是綜合評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)之一，大量研究證明還原力與抗氧化活性之間存在正相關(guān)，一般還原力即OD700值越大，其抗氧化效果越強(qiáng)，因而通過還原力的數(shù)值可以綜合評(píng)價(jià)一種物質(zhì)的抗氧化效果強(qiáng)弱[16]。如表1 第二列數(shù)據(jù)所示，莖葉未發(fā)酵對(duì)照及發(fā)酵液的還原力間雖存在差距，但差異不具顯著性（P＞0.05），而根部發(fā)酵液的還原力高于其未發(fā)酵對(duì)照溶液，且差異具有顯著性。本研究中薄荷莖葉發(fā)酵前后還原力變化趨勢(shì)雖與總抗氧化能力相同，但差異不具顯著性，而根部發(fā)酵后與其它處理相比無論總抗氧化能力還是還原力均顯著提高，且差異具有顯著性。

2.2 不同部位薄荷液發(fā)酵前后自由基清除能力研究

氧化物質(zhì)進(jìn)入人體后一般會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，該階段稱為自由基形成階段。超氧陰離子自由基短時(shí)間內(nèi)就會(huì)引起連鎖反應(yīng)，這個(gè)階段稱為連鎖起始反應(yīng)階段。衡量抗氧化劑是否能夠在連鎖起始反應(yīng)階段起抑制作用，可通過測(cè)定樣品清除DPPH 自由基和清除超氧陰離子自由基的方法來確定[17]。根莖葉對(duì)照、發(fā)酵液DPPH 自由基、超氧陰離子自由基清除率見表2。

表2 根莖葉對(duì)照、發(fā)酵液DPPH 自由基、超氧陰離子自由基清除率Table 2 The scavenging capacities of DPPH·and superoxide anion radicals of control and fermentation broth from roots，stems and leaves

如表2 所示，根莖葉未發(fā)酵的DPPH·清除率在55.0%～64.8%之間，而經(jīng)過發(fā)酵后，不同部位DPPH·清除率均有所增強(qiáng)，在67.7%～70.9%之間，這與Chen 等[18]的研究結(jié)果相似，對(duì)兩種姜屬植物（萬壽菊和紅葉姜）進(jìn)行發(fā)酵，生姜的抗氧化活性和DPPH·清除率平均為70%。與相應(yīng)未發(fā)酵薄荷液相比差異均具有顯著性（P＜0.05），但不同部位發(fā)酵液間的DPPH·清除率比較接近，差異不具顯著性（P＞0.05）。

此外，對(duì)超氧陰離子的清除率也是同樣情況，3 個(gè)部位發(fā)酵液的超氧陰離子自由基清除率相似（29.9%～30.4%之間），與DPPH·清除率相比此值偏低，與DPPH·清除率不同的是，根部發(fā)酵液超氧陰離子自由基清除率高于未發(fā)酵根部薄荷液，且差異具有顯著性（P＜0.05），而莖葉薄荷液發(fā)酵前后對(duì)該自由基清除率間差距較低，且差異均不具顯著性（P＞0.05）。

2.3 不同部位薄荷液發(fā)酵前后總酚、總黃酮含量研究

從2.1 與2.2 研究結(jié)果可看出，薄荷根莖葉發(fā)酵前后均具有一定抗氧化能力，可在氧化反應(yīng)發(fā)生的連鎖起始反應(yīng)階段清除DPPH·及超氧陰離子自由基。乳酸菌在食物發(fā)酵中被廣泛應(yīng)用，其中一個(gè)眾所周知的功能特性如抗氧化性被廣泛研究和討論[19-20]。

為探究起到抗氧化活性的物質(zhì)，本研究測(cè)定了總酚、總黃酮等抗氧化物質(zhì)的含量，根莖葉對(duì)照、發(fā)酵液總酚及總黃酮含量見表3。

由表3 所示，薄荷各個(gè)部位發(fā)酵后，總酚與總黃酮含量均有不同程度提升。其中莖葉發(fā)酵后總酚含量與發(fā)酵前相比均提高，且差異具有顯著性（P＜0.05），但根部總酚含量發(fā)酵前后差異不具顯著性，需要注意的是，發(fā)酵前根部總酚含量要高于莖葉部分，且差異具有顯著性（P＜0.05），但發(fā)酵后根莖葉的總酚含量差異不具顯著性（P＞0.05）。Ng 等[2]研究也發(fā)現(xiàn)金線蓮發(fā)酵前后根莖葉部分的總酚含量也有與薄荷相似的變化趨勢(shì)，但與其研究不同的是，本研究并未在薄荷發(fā)酵液中檢出β-胡蘿卜素。與總酚含量變化不同的是，根莖葉總黃酮含量在發(fā)酵前后均保持相似含量，雖發(fā)酵后各部分總黃酮含量均略有提升，但差異不具顯著性（P＞0.05）。

表3 根莖葉對(duì)照、發(fā)酵液總酚及總黃酮含量Table 3 Contents of total phenolics and total flavonoids of control and fermentation broth from roots，stems and leaves

有研究表明，總酚含量與薄荷提取液抗氧化活性呈正相關(guān)[21]，因此，前面結(jié)論中發(fā)酵對(duì)照組根部抗氧化性高于莖部、葉部提取液，而發(fā)酵組則抗氧化活性相似可能是因?yàn)榭偡雍孔兓鶎?dǎo)致。

通常，薄荷的消費(fèi)以莖部及葉部食用為主，部分消費(fèi)者甚至只食用葉部。根據(jù)本研究結(jié)論，薄荷根部的高抗氧化活性也應(yīng)進(jìn)一步加以利用。

2.4 不同部位薄荷發(fā)酵液感官品評(píng)

薄荷一般作為新鮮蔬菜用于調(diào)味，附加值較低，開發(fā)了薄荷的新型利用方法，通過發(fā)酵可提高其抗氧化性，將其用作抗氧化劑或開發(fā)新型飲料。對(duì)薄荷不同部位發(fā)酵液進(jìn)行消費(fèi)者感官品評(píng)，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 薄荷發(fā)酵液感官評(píng)分雷達(dá)圖Fig.1 Sensory score radar chart of mint fermentation broth

產(chǎn)品消費(fèi)者接受實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根、莖、葉的發(fā)酵汁的總體接受度分別為4.9±0.57、5.3±0.82、6.5±0.85，差異不具顯著性（P>0.05）。具體來說，各部分甜度、酸度差異較少，且不具顯著性（P>0.05），在發(fā)酵液顏色方面，根莖差異不具顯著性，但葉部發(fā)酵液顏色評(píng)分較高，且差異具顯著性（P＜0.05），即葉部發(fā)酵液顏色接受度較高，呈現(xiàn)比較接近薄荷汁的綠色。香氣方面，雖可看到葉部香氣評(píng)分較高，但差異不具顯著性（P>0.05）。

總體來說，與未經(jīng)發(fā)酵薄荷汁相比，各部分發(fā)酵液香氣有所下降，但更為緩和，沖擊力較低，消費(fèi)者接受度更高，且甜味均較為明顯。許多研究利用水果或蔬菜作為發(fā)酵底物，而以傳統(tǒng)草本植物作為發(fā)酵底物研究較為少見。這種新型利用方式不僅解決了薄荷大量生產(chǎn)且附加值較低的情況，也為草本植物的利用提供了新思路。

3 結(jié)論

本研究以薄荷為原料以嗜酸乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵前后總抗氧化性、清除自由基能力，抗氧化物質(zhì)含量進(jìn)行分析，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行感官品評(píng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后根莖葉發(fā)酵液總抗氧化性、清除DPPH·及超氧陰離子自由基的能力均上升，且與發(fā)酵前差異具有顯著性（P＜0.05），而對(duì)發(fā)酵前后總酚、總黃酮等抗氧化物質(zhì)含量分析發(fā)現(xiàn)，根莖葉總酚總黃酮含量在發(fā)酵后均上升，且莖葉與發(fā)酵前相比差異呈現(xiàn)顯著性（P＜0.05）。最終發(fā)酵產(chǎn)品，只葉部顏色與根、莖差異呈現(xiàn)顯著性，其他指標(biāo)差異均不具顯著性（P>0.05）。

薄荷根部的發(fā)酵后的抗氧化活性、清除自由基能力應(yīng)引起重視，在產(chǎn)品加工中加以利用。此外，嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus 對(duì)胃腸道消化有良好的作用，增加了其作為發(fā)酵接種物的價(jià)值。本研究提出一種新的利用傳統(tǒng)草本植物薄荷的方法，將有助于亞洲地區(qū)的醫(yī)療價(jià)值的商業(yè)化和推廣。