轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析刺參波里氏囊腔與體腔中體腔細(xì)胞對(duì)吐臟脅迫的響應(yīng)差異

史偉卜，王軼南，王浩文，任媛，王慶奎，李強(qiáng)*

(1.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；2.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；3.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

1 引言

刺參（Apostichopus japonicus）隸屬棘皮動(dòng)物門(mén)海參綱，處于從無(wú)脊椎向脊椎動(dòng)物分化的獨(dú)特進(jìn)化階段，也是國(guó)內(nèi)外重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種[1]。刺參具有獨(dú)特的水管系統(tǒng)，該系統(tǒng)是一個(gè)由體腔產(chǎn)生的充滿液體的復(fù)雜管道網(wǎng)絡(luò)，包括石管、環(huán)狀水管與輻水管等構(gòu)造。石管嵌在背懸腸膜內(nèi)，其末端為篩板，生在體腔內(nèi)，因而水管內(nèi)的液體來(lái)自于體腔液。波里氏囊作為刺參水管系統(tǒng)的附屬物懸掛于體腔中，具有調(diào)節(jié)水管系統(tǒng)內(nèi)壓力的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)水管系統(tǒng)內(nèi)的體腔液流進(jìn)或流出管足而支配其運(yùn)動(dòng)[2]。此外，近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，刺參波里氏囊可以生成體腔細(xì)胞，是刺參的“造血組織”之一[3]。

刺參的體腔細(xì)胞大量存在于體腔內(nèi)，同時(shí)還隨著水管系統(tǒng)的延伸遍布于刺參的體壁、管足，廣泛參與著機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)輸送、代謝以及免疫等多種機(jī)能[2]。目前，刺參體腔細(xì)胞的相關(guān)研究多集中于體腔內(nèi)游離的體腔細(xì)胞，對(duì)組織器官及水管系統(tǒng)內(nèi)的體腔細(xì)胞了解較少。初步研究顯示[4]，刺參體腔中體腔細(xì)胞密度約為波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞密度的2 倍；波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞與體腔中體腔細(xì)胞種類(lèi)相似，但亞型組成存在差異，囊腔內(nèi)以帶偽足的球形細(xì)胞為主，淋巴細(xì)胞次之；體腔內(nèi)則以淋巴細(xì)胞為主，帶偽足的球形細(xì)胞次之。波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞與體腔中體腔細(xì)胞組成上的差異，提示其可能具有特殊的功能[5]。

刺參具有吐臟與再生的特殊機(jī)制，當(dāng)刺參遇到強(qiáng)烈的刺激或因水質(zhì)過(guò)于混濁、溫度變化過(guò)大等不良環(huán)境時(shí)，刺參會(huì)將消化道、呼吸樹(shù)、性腺等內(nèi)臟器官排出體外，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，又可再生出功能完善的內(nèi)臟器官，屬于一種自我保護(hù)措施[6]。目前，有關(guān)刺參吐臟后再生的研究多集中于腸道的再生過(guò)程。已有研究表明[7?8]，刺參吐臟時(shí)，腸道與胃部、肛門(mén)以及腸系膜的連接部位分別出現(xiàn)斷裂，從而使得腸道從體腔中脫離下來(lái)并經(jīng)由泄殖孔排出體外。這些斷裂的部位形成了新生腸道發(fā)生的原基，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、去分化、組織增生等過(guò)程才逐漸形成完整的消化系統(tǒng)。其中，刺參腸系膜以及腸道外層存在的體腔上皮細(xì)胞被認(rèn)為具有干細(xì)胞的功能作用，是消化道組織再生的重要來(lái)源，刺參吐臟時(shí)，體腔中體腔液和體腔細(xì)胞會(huì)隨內(nèi)臟一起被排出。已有研究表明[9]，刺參體腔液容積在吐臟后2 h 即可恢復(fù)至吐臟前水平，體腔細(xì)胞數(shù)量在吐臟后快速增加，吐臟后6 h 時(shí)與吐臟前已無(wú)顯著差異。波里氏囊在刺參吐臟時(shí)不會(huì)和其他內(nèi)臟一起排出體外，為刺參吐臟后僅存的內(nèi)臟器官，我們先前研究發(fā)現(xiàn)，波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞數(shù)量也在刺參吐臟后6 h 快速增加（數(shù)據(jù)尚未公開(kāi)），表現(xiàn)出積極的響應(yīng)。

本文應(yīng)用RNA-Seq 測(cè)序技術(shù)對(duì)刺參吐臟后6 h與吐臟前波里氏囊腔和體腔中體腔細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別比較波里氏囊腔和體腔中體腔細(xì)胞在吐臟脅迫下的基因表達(dá)變化，以期深入了解體腔細(xì)胞在刺參吐臟后所發(fā)揮的生物學(xué)作用，進(jìn)一步闡明刺參波里氏囊腔和體腔中體腔細(xì)胞在功能方面的差異，并為解析刺參吐臟與再生這一特殊生存機(jī)制提供資料。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用刺參購(gòu)于山東省青島市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，體重為（50.2±4.6）g，于鹽城工學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物免疫與病害實(shí)驗(yàn)室的塑料水槽(70 cm×50 cm×46 cm)中充氣暫養(yǎng)，海水溫度為17～19℃，鹽度為30，每?jī)商焱段购蛽Q水1 次，于18:00 進(jìn)行投喂，次日早上08:00 進(jìn)行換水，1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 樣品準(zhǔn)備

將健康刺參隨機(jī)分為對(duì)照組和吐臟組，每組設(shè)置3 個(gè)平行，每個(gè)平行組放養(yǎng)3 頭刺參，每頭刺參注射1.2 mL 0.35 mol/L 的氯化鉀誘導(dǎo)吐臟，待吐臟后6 h 取樣，對(duì)照組不做處理。使用無(wú)菌手術(shù)剪沿泄殖腔一端剪開(kāi)刺參腹部，將體腔中體腔液收集至一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中，另用1 mL 無(wú)菌注射器抽取波里氏囊腔內(nèi)體腔液，每3 頭刺參樣品混合作為1 個(gè)平行，每組3 個(gè)平行。各組分別標(biāo)記如下：波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞對(duì)照組（PC0 h）、波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞吐臟組（PC6 h）、體腔中體腔細(xì)胞對(duì)照組（CC0 h）和體腔中體腔細(xì)胞吐臟組（CC6 h）。各組取2.5 mL 體腔液樣品經(jīng)4℃，3 000 r/min 離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀立即置于液氮中速凍，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 RNA 提取及質(zhì)量檢測(cè)

按照常規(guī)的Trizol 法提取上述制備的體腔細(xì)胞樣品總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的質(zhì)量，分析樣品RNA 完整性及是否存在DNA 污染，利用NanoDrop 微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。

2.4 文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序

RNA-Seq 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建由北京諾禾致源科技股份有限公司提供技術(shù)服務(wù)，首先通過(guò)Oligo（dT）磁珠富集帶有polyA 尾的mRNA，隨后將得到的mRNA 隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA 為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物，合成cDNA 第一條鏈，隨后用RNaseH 降解RNA 鏈，并在DNA polymerase I 體系下，以dNTPs 為原料合成cDNA 第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA 經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A 尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads 篩選200 bp 左右的cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads 純化PCR 產(chǎn)物，最終獲得文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，分別使用Agilent 2100 和qRTPCR 對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和定量，檢測(cè)合格后使用Illumina NovaSeq 6000 進(jìn)行測(cè)序，并產(chǎn)生150 bp 配對(duì)末端讀數(shù)。

2.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)中包含少量帶有測(cè)序接頭或測(cè)序質(zhì)量較低的基因片段。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾。從原始數(shù)據(jù)中去除帶接頭、含N（N 表示無(wú)法確定堿基信息）和低質(zhì)量（Qphred≤20 的堿基數(shù)所占比例超過(guò)50%）的基因片段，從而獲得過(guò)濾后數(shù)據(jù)。同時(shí)，對(duì)過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行Q20、Q30 和GC 含量計(jì)算。后續(xù)所有分析均是基于過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行的高質(zhì)量分析。

2.6 測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)

刺參參考基因組和基因模型注釋文件從基因組網(wǎng)站下載（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/754/855/GCA_002754855.1_ASM275485v1/GCA_00275 4855.1_ASM275485v1_genomic.fna.gz）。使 用HISAT2 v2.0.5 構(gòu)建參考基因組的索引，并使用HISAT2 v2.0.5將配對(duì)末端過(guò)濾后數(shù)據(jù)與參照基因組比對(duì)。

2.7 差異表達(dá)基因的篩選和富集分析

使用FPKM（expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced）法估算樣本的基因表達(dá)水平。隨后用DESeq2軟件（版本1.16.1）對(duì)兩組間的差異表達(dá)進(jìn)行分析。利用Benjamini-Hochberg 方法調(diào)整所得p值（padj）以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。padj＜0.05 以及|log2（Fold change）|＞1作為顯著差異表達(dá)的閾值。通過(guò)clusterProfiler R 軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的基因本體（Gene Ontology,GO）和KEGG 富集分析，將padj＜0.05 作為顯著性富集的閾值。

2.8 qRT-PCR 驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA 測(cè)序結(jié)果，針對(duì)兩組樣品各選擇5 個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。其中波里氏囊腔中體腔細(xì)胞檢測(cè)金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白基元-9（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 9,ADAMTS9）、基質(zhì)金屬蛋白酶-16（matrix metalloproteinase-16,MMP16）、維甲酸受體-β（retinoic acid receptor beta,RARB）、鈉依賴(lài)性脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium-dependent proline transporter,SLC6A7）、磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶-1（phosphoserine aminotransferase-1,PSAT1）等基因，體腔中體腔細(xì)胞檢測(cè)ADAMTS9、MMP16、RARB、SLC6A7、IgG-Fc 片段結(jié)合蛋白（IgGFc-binding protein,FCGBP）等基因。利用SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR。驗(yàn)證基因的引物通過(guò)Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)，基因引物序列見(jiàn)表1。以β-actin 作為內(nèi)參基因，各樣品每個(gè)基因設(shè)置3 次重復(fù)，用2?△△CT法算出每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)序結(jié)果概述

通過(guò)Illumina 測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)吐臟前后共6 個(gè)波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞樣品與6 個(gè)體腔中體腔細(xì)胞樣品文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序原始數(shù)據(jù)已經(jīng)提交至NCBI（登錄號(hào)為SRP262929，SRP261739）。波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞樣本獲得的原始數(shù)據(jù)區(qū)間為48 395 496～58 695 018，去除低質(zhì)量序列后，共獲得308 646 822 個(gè)過(guò)濾后數(shù)據(jù)；體腔中體腔細(xì)胞樣本獲得的原始數(shù)據(jù)區(qū)間為41 285 400～60 069 216，去除低質(zhì)量序列后，共獲得271 994 432 個(gè)過(guò)濾后數(shù)據(jù)。兩組樣本與刺參參考基因組的比對(duì)率區(qū)間分別為66.06%～68.25%和61.10%～64.88%。堿基質(zhì)量及組成分析顯示，各樣品的Q20值（%）均不小于94.87%（表2）。

3.2 差異表達(dá)分析

將過(guò)濾后數(shù)據(jù)比對(duì)到刺參的參考基因組上，PC0 h組和PC6 h 組的比較組合共獲得25 049 個(gè)差異基因，其中1 254 個(gè)基因在PC0 h 組中特異表達(dá)，1 538 個(gè)基因在PC6 h 組中特異表達(dá)，兩組共表達(dá)基因22 257個(gè)。CC0 h 組和CC6 h 組的比較組合共獲得25 682 個(gè)差異基因，其中1 433 個(gè)基因在CC0 h 組中特異表達(dá)，2 793 個(gè)基因在CC6 h 組中特異表達(dá)，兩組共表達(dá)基因21 456 個(gè)。本研究中，將|log2(Fold change)|＞1 和padj＜0.05 定義為顯著差異基因，PC6 h 組和PC0 h 組相比，共篩選出267 個(gè)顯著差異基因，其中上調(diào)基因200個(gè)，下調(diào)基因67 個(gè)。CC6 h 組和CC0 h 組相比，共篩選出922 個(gè)顯著差異基因，其中上調(diào)基因803 個(gè)，下調(diào)基因119 個(gè)（圖1）。

3.3 GO 富集分析

對(duì)PC6 h 組和PC0 h 組間的267 個(gè)顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能富集分析，這些差異表達(dá)基因被富集到223 個(gè)GO 亞類(lèi)中，包括110 個(gè)生物過(guò)程亞類(lèi)，22 個(gè)細(xì)胞組分亞類(lèi)，91 個(gè)分子功能亞類(lèi)，其中分子功能類(lèi)別中富集最為顯著。在分子功能類(lèi)別中，分子功能調(diào)節(jié)、肽酶抑制活性、肽酶調(diào)節(jié)活性、酶抑制活性、酶調(diào)節(jié)活性中的差異表達(dá)基因較多。

表1 用qRT-PCR 驗(yàn)證所用引物序列Table 1 The sequence of primers used for qRT-PCR validation

表2 12 個(gè)文庫(kù)的基本信息Table 2 The basic characteristic of reads in the 12 libraries

圖1 PC6 h 組與PC0 h 組（a）及CC6 h 組與CC0 h 組（b）的顯著差異基因分布火山圖Fig.1 Volcano plot significantly differential expression genes distribution between PC6 h and PC0 h (a) and between CC6 h and CC0 h (b)

對(duì)CC6 h 組和CC0 h 組間的922 個(gè)顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，這些差異表達(dá)基因被富集到385 個(gè)GO 亞類(lèi)中，其中生物過(guò)程亞類(lèi)202 個(gè)，細(xì)胞組分亞類(lèi)27 個(gè)，分子功能亞類(lèi)156 個(gè)。生物過(guò)程類(lèi)別中，蛋白質(zhì)水解、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、單一生物轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞黏附、生物黏附中的差異表達(dá)基因較多。細(xì)胞組分類(lèi)別中，細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)中的差異表達(dá)基因較多。分子功能類(lèi)別中，分子功能調(diào)節(jié)、肽鏈內(nèi)切酶活性、肽鏈內(nèi)切酶抑制活性、肽鏈內(nèi)切酶調(diào)節(jié)活性、肽酶調(diào)節(jié)活性、肽酶抑制活性、酶調(diào)節(jié)活性、酶抑制活性中的差異表達(dá)基因較多。圖2 列出了生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3 個(gè)類(lèi)別中差異基因顯著富集的前30 個(gè)亞類(lèi)。

3.4 KEGG 富集分析

通過(guò)KEGG 富集分析結(jié)果顯示，PC6 h 組和PC0 h組間顯著差異基因共富集到15 條通路上，如甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、氨基酸生物合成、FoxO 信號(hào)通路、吞噬體等，其中顯著富集的通路是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路（圖3a）；CC6 h 組和CC0 h 組間顯著差異基因共富集到35 條通路上，其中顯著富集的通路包括細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、吞噬體、AGERAGE 信號(hào)通路（圖3b）。表3 列出了顯著富集通路中的差異表達(dá)基因。

3.5 qRT-PCR 驗(yàn)證

qRT-PCR 結(jié)果顯示，刺參吐臟后，波里氏囊腔中體腔細(xì)胞的ADAMTS9、MMP16、RARB、SLC6A7、PSAT1 等基因及體腔中體腔細(xì)胞的ADAMTS9、MMP16、RARB、SLC6A7、FCGBP 等基因的表達(dá)量高于對(duì)照，基因表達(dá)量的差異倍數(shù)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果大致相同。結(jié)果表明，qRT-PCR 結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，證明了RNA-Seq 結(jié)果的可靠性（圖4）。

4 討論

刺參吐臟后，體腔中體腔細(xì)胞近乎排盡，隨后迅速恢復(fù)，有研究表明[9]，體腔中體腔細(xì)胞數(shù)量在吐臟后6 h 時(shí)與吐臟前已無(wú)顯著差異。此外，我們先前研究發(fā)現(xiàn)，刺參波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞數(shù)量在吐臟后也快速增加，吐臟后6 h 達(dá)到峰值，之后緩慢下降（數(shù)據(jù)尚未公開(kāi)）。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇吐臟后6 h 對(duì)刺參波里氏囊腔和體腔中體腔細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)與正常刺參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，分別篩選波里氏囊腔和體腔中體腔細(xì)胞在吐臟脅迫下的差異表達(dá)基因，比較波里氏囊腔和體腔中體腔細(xì)胞對(duì)吐臟脅迫的響應(yīng)差異，探討體腔細(xì)胞在刺參吐臟后的生物學(xué)作用。

相對(duì)于體腔中體腔細(xì)胞在刺參吐臟前后的表達(dá)變化，波里氏囊腔中體腔細(xì)胞基因表達(dá)變化較小，共獲得267 個(gè)顯著差異基因。差異基因偏少的原因可能與刺參吐臟時(shí)波里氏囊及囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞不被排出體外，吐臟刺激對(duì)囊腔中體腔細(xì)胞的基因表達(dá)水平影響較小有關(guān)。然而，通過(guò)對(duì)差異基因的功能富集分析發(fā)現(xiàn)，囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞的差異基因所富集的功能和通路非常集中，差異基因大量富集至GO 功能注釋的酶催化活性亞類(lèi)。差異基因通路富集分析表明，僅有1 條代謝通路（甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路）被顯著富集，其中PSAT1、甘氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（glycine N-methyltransferase,GNMT）、肌氨酸脫氫酶（sarcosine dehydrogenase,mitochondrial,SARDH）、甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（betaine-homocysteine Smethyltransferase,BHMT）基因均顯著上調(diào)表達(dá)。已有研究表明[10?11]，絲氨酸和甘氨酸的代謝在細(xì)胞增殖過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，PSAT1 被認(rèn)為是連接代謝途徑（糖酵解）和氨基酸（絲氨酸）的生物合成途徑中起著重要作用的轉(zhuǎn)氨酶，PSAT1 已被證明在體外能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，刺參波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞在吐臟脅迫下，差異基因顯著富集到甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路，可能與波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞數(shù)量在吐臟后早期快速增加有關(guān)。

吐臟前后刺參體腔中體腔細(xì)胞共篩選出922 個(gè)顯著差異基因，基因表達(dá)變化非常明顯，這與刺參吐臟時(shí)幾乎排盡體腔中原有體腔細(xì)胞有關(guān)。吐臟后體腔中的體腔細(xì)胞包括由造血組織新生成的細(xì)胞以及由其他組織部位（如水管系統(tǒng)）遷移而來(lái)的體腔細(xì)胞，這些細(xì)胞在基因表達(dá)上可能不同于原有細(xì)胞，另一方面在吐臟脅迫下，體腔細(xì)胞亦可發(fā)生相應(yīng)的表達(dá)變化?？傊屡K后體腔中體腔細(xì)胞與正常刺參體腔中體腔細(xì)胞存在極大的表達(dá)差異。在GO 富集分析生物學(xué)過(guò)程分類(lèi)中，體腔中體腔細(xì)胞差異基因在細(xì)胞黏附、生物黏附等亞類(lèi)富集最顯著，在KEGG 通路中，顯著富集到細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路、FoxO 等信號(hào)通路，這與波里氏囊腔內(nèi)體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組所得結(jié)果存在很大差異。

細(xì)胞外基質(zhì)是存在于所有組織和器官中的非細(xì)胞成分，它不僅為細(xì)胞成分提供了必要的物理支持，而且還與組織的形態(tài)發(fā)生、分化和內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)，在創(chuàng)面愈合和組織重建等方面發(fā)揮著重要作用[12?13]。有研究表明[14?15]，細(xì)胞外基質(zhì)重建與海參吐臟后腸道再生過(guò)程中的傷口愈合和組織恢復(fù)有關(guān)，海參腸系膜的愈合和局部生長(zhǎng)大部分是因?yàn)槟c系膜邊緣的組織重組，而不是來(lái)自于有絲分裂。此外，García-Arrarás 等[15]通過(guò)光鏡和免疫組化研究顯示，海參腸道再生過(guò)程中，腸系膜結(jié)締組織與新生消化道的結(jié)締組織相連處出現(xiàn)了正在遷移的變形細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和桑椹胚細(xì)胞。孫麗娜[16]研究發(fā)現(xiàn)，刺參新生腸壁的內(nèi)部結(jié)締組織大約有4 種類(lèi)型細(xì)胞：未分化細(xì)胞、變形細(xì)胞、桑椹胚細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，4 種細(xì)胞的數(shù)目在再生過(guò)程中都表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，最終恢復(fù)到正常水平。本研究中，體腔中體腔細(xì)胞差異表達(dá)基因被顯著富集到細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路，其中軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）、膠原蛋白Ⅳ型α5 鏈（collagen alpha-5(IV) chain,COL4A5）、膠原蛋白Ⅸ型α2 鏈（collagen alpha-2(IX) chain,COL9A2）、血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin-1,THBS-1）和基底膜特異性硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白（basement membrane-specific heparan sulfate,HSPG2）等基因均顯著上調(diào)。因此，我們推測(cè)刺參吐臟后再生早期，體腔中體腔細(xì)胞可能通過(guò)自身的遷移黏附和大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，參與刺參內(nèi)臟器官的再生過(guò)程。

圖2 GO 富集分析中顯著差異基因的功能分類(lèi)Fig.2 Functional categorization of significantly differential expression genes in Gene Ontology

圖3 顯著差異基因的KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment of significantly differential expression genes

表3 顯著富集通路中的差異表達(dá)基因Table 3 The differential expression genes in significant enrichment pathways

續(xù)表3

圖4 qRT-PCR 驗(yàn) 證RNA-Seq 結(jié)果Fig.4 Verification of the RNA-Seq results using the qRT-PCR method

關(guān)于海參體腔細(xì)胞的來(lái)源，目前研究還沒(méi)有確切結(jié)論，不過(guò)普遍認(rèn)為是由“造血組織”產(chǎn)生一種類(lèi)似于造血干細(xì)胞的祖原細(xì)胞，在體腔中再分化形成其他類(lèi)型的體腔細(xì)胞[3,17?18]。本研究中，刺參吐臟后體腔中體腔細(xì)胞差異基因顯著富集到FoxO 信號(hào)通路，細(xì)胞周期蛋白B（Cyclin B）和POLO 樣蛋白激酶（polo-like kinase,Plk）基因顯著下調(diào)。Cyclin B 是細(xì)胞周期前期/中期轉(zhuǎn)變的重要調(diào)控因子，它通過(guò)激活cdc28 蛋白激酶和相應(yīng)底物的磷酸化來(lái)促進(jìn)多種生物進(jìn)入有絲分裂[19?20]。Plk 是細(xì)胞分裂的重要正向調(diào)節(jié)因子，在有絲分裂、雙極紡錘體形成、染色體分離和胞質(zhì)分裂等過(guò)程中起關(guān)鍵作用[21?22]。因此，本實(shí)驗(yàn)中Cyclin B 和Plk基因的下調(diào)表達(dá)，提示刺參吐臟后再生早期，體腔中體腔細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)減弱。我們先前研究發(fā)現(xiàn)，刺參吐臟后體腔中體腔細(xì)胞近乎排盡，而在吐臟后6 h細(xì)胞數(shù)量快速增加，與吐臟前已無(wú)顯著差異。綜合轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析認(rèn)為，刺參吐臟后再生早期體腔中體腔細(xì)胞數(shù)量快速增加的原因，并不是由造血組織快速增殖產(chǎn)生，而主要是由其他組織部位（如水管系統(tǒng)）遷移而來(lái)。

TGF-β 信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移和凋亡等過(guò)程，在組織與器官的發(fā)生和形成、機(jī)體的免疫反應(yīng)等生物過(guò)程發(fā)揮重要的功能[23]。本研究中，體腔中體腔細(xì)胞差異表達(dá)基因被顯著富集到TGF-β 信號(hào)通路，其中骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、THBS-1 等基因顯著上調(diào)。已有研究證實(shí)，作為T(mén)GF-β 超家族成員，BMP 的功能不僅在骨骼，而且在胚胎早期形成以及許多器官和組織的發(fā)育和分化過(guò)程中都發(fā)揮重要作用[24]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注該基因家族與再生的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們參與誘導(dǎo)動(dòng)物再生，如蠑螈晶狀體再生[25]、海參消化道再生[26]、大鼠的指尖再生[27]、非洲爪蟾幼體的尾部和肢體再生[28]等。本研究中，刺參吐臟后體腔中體腔細(xì)胞BMP 和THBS-1 基因上調(diào)表達(dá)，提示刺參吐臟后體腔中體腔細(xì)胞可能通過(guò)分泌釋放生長(zhǎng)因子，進(jìn)而參與內(nèi)臟器官的再生過(guò)程。

綜上，本文分別對(duì)刺參吐臟后6 h 與吐臟前波里氏囊腔和體腔中體腔細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較了波里氏囊腔與體腔中體腔細(xì)胞在吐臟脅迫下的基因表達(dá)變化。研究結(jié)果表明，刺參波里氏囊腔與體腔中體腔細(xì)胞對(duì)吐臟脅迫的響應(yīng)存在明顯差異，這對(duì)進(jìn)一步研究刺參體腔細(xì)胞的功能及揭示刺參吐臟后的再生機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。