百里香酚對(duì)肉兔生長性能、小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫器官的影響

黃崇波，郭志強(qiáng)，刁 慧，周夢(mèng)佳，鄺聲耀，李書偉

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066）

近年來，抗生素在畜禽生產(chǎn)中濫用造成致病菌耐藥性、環(huán)境污染、抗生素殘留等問題，許多國家都對(duì)抗生素的使用作出了限制措施。2019 年，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194 號(hào)公告，宣布退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，這標(biāo)志著我國畜牧行業(yè)正式步入飼料“無抗”時(shí)代。因此，尋找具有安全高效、環(huán)保、無殘留等特點(diǎn)的抗生素替代品，成為了當(dāng)下行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

百里香酚是一種單萜酚類化合物，有特殊香味，主要存在于百里香、牛至、冬香薄荷等植物提取的精油中。研究證明，百里香酚在抗真菌[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]和抑菌[3]等方面作用明顯。百里香酚在家兔中的應(yīng)用報(bào)道主要集中于牛至油和百里香精油，單獨(dú)的百里香酚研究較少[4-5]。本試驗(yàn)旨在研究百里香酚對(duì)肉兔生長性能、小腸黏膜結(jié)構(gòu)和免疫器官指數(shù)的影響，考察百里香酚在肉兔生產(chǎn)中替代抗生素的潛力，為其在肉兔中的合理利用提供指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 百里香酚由山東騰望化工有限公司提供，經(jīng)四川威爾測(cè)試技術(shù)股份有限公司測(cè)試為98.4%。恩拉霉素由山東勝利生物工程有限公司提供（批號(hào)：ENP 81901024），含量≥4%。試驗(yàn)兔和場(chǎng)地由四川省畜牧科學(xué)院養(yǎng)兔研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)將288 只35 日齡斷奶伊拉肉兔按照公母各半、體重接近原則分為6 個(gè)處理組，每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8 只兔。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；恩拉霉素組在基礎(chǔ)飼糧中添加10 mg/kg恩拉霉素；試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加50、100、150、200 mg/kg 百里香酚。

1.3 試驗(yàn)日糧和飼養(yǎng)管理 參照NRC（1977）肉兔營養(yǎng)需要和布拉斯[6]的生長兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合伊拉肉兔生長發(fā)育特點(diǎn)，以及本地區(qū)飼料資源狀況來設(shè)計(jì)基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

試驗(yàn)前對(duì)肉兔兔舍進(jìn)行徹底沖洗和嚴(yán)格消毒。預(yù)試期7 d，正試期42 d。試驗(yàn)期間日喂食2 次（08:00 和18:00）。飼養(yǎng)管理和免疫程序采用常規(guī)方法，自然采光、通風(fēng)。自由采食，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 生長性能 于試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，將所有兔稱重，記錄試驗(yàn)期各重復(fù)耗料量，以單只兔為單位計(jì)算日增重、日采食量和耗料增重比。

日增重（g/d）=[試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重-試驗(yàn)開始時(shí)體重]/試驗(yàn)天數(shù)

日采食量（g/d）=[ 投料量-剩料量]/（試驗(yàn)天數(shù)×每個(gè)重復(fù)兔只數(shù)）

耗料增重比=日采食量/日增重

1.4.2 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫器官指數(shù) 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選擇1 只體重接近的兔子（每組6 只，確保每組雌雄各3 只）進(jìn)行屠宰，分別截取十二指腸、空腸、回腸中部各2 cm，用生理鹽水沖洗干凈內(nèi)容物后，放在10%福爾馬林中固定8～24 h。采用常規(guī)石蠟切片制作方法，將置于10% 中性福爾馬林固定液中的十二指腸、空腸和回腸組織經(jīng)常規(guī)酒精脫水，石蠟切片包埋，切片厚度6 μm，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，每組內(nèi)每張切片挑選3 個(gè)100 倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件以右下角100 倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片選取5 根完整的絨毛，分別測(cè)量絨毛高度和隱窩深度，以其平均數(shù)為測(cè)定數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度值（V/C）。

屠宰后取脾臟和圓小囊，稱重計(jì)算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官重量/屠宰前活重1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD 方法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 百里香酚對(duì)肉兔生長性能的影響 由表2 可知，各試驗(yàn)組的平均日增重與對(duì)照組相比差異不顯著。5 個(gè)試驗(yàn)組間，200 mg/kg 百里香酚組的平均日增重顯著低于恩拉霉素組和50 mg/kg 百里香酚組，其他各組間差異不顯著。200 mg/kg 百里香酚組的平均日采食量顯著低于對(duì)照組和恩拉霉素組，其他各組間差異不顯著。與對(duì)照組相比，添加100、150、200 mg/kg 百里香酚顯著降低耗料增重比，恩拉霉素組和50 mg/kg 百里香酚組與對(duì)照組差異不顯著。

2.2 百里香酚對(duì)肉兔小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 由表3 可知，與對(duì)照組比，恩拉霉素組回腸絨毛高度提高了29.67%（P＜0.05）；50mg/kg 百里香酚組十二指腸、空腸和回腸絨毛高度分別提高38.83%、23.28%和18.85%（P＜0.05），100 mg/kg 百里香酚組十二指腸和空腸絨毛高度分別提高40.72%和18.35%（P＜0.05）；150、200 mg/kg 百里香酚組十二指腸絨毛高度分別提高21.69% 和20.37%（P＜0.05）。與恩拉霉素組相比，50、100、150、200 mg/kg 百里香酚組十二指腸絨毛高度分別提高38.51%、40.39%、21.41% 和20.09%（P＜0.05）；50 mg/kg 百里香酚組空腸絨毛高度提高了18.03%（P＜0.05）；200 mg/kg 百里香酚組回腸絨毛高度降低了15.41%（P＜0.05）。各百里香酚組間，50、100 mg/kg 百里香酚組十二指腸絨毛高度顯著高于其他劑量的百里香酚組；50 mg/kg 百里香酚組空腸絨毛高度顯著高于150、200 mg/kg 百里香酚組。

與對(duì)照組相比，恩拉霉素組十二指腸和空腸的隱窩深度分別降低了18.41%和18.24%（P＜0.05）。與恩拉霉素組相比，100、150、200 mg/kg 百里香酚組十二指腸的隱窩深度分別提高21.28%、32.54% 和33.75%（P＜0.05）；50、150、200 mg/kg 百里香酚組空腸的隱窩深度分別提高17.52%、26.23%和22.68%（P＜0.05）。各百里香酚組間，150、200 mg/kg 百里香酚組十二指腸的隱窩深度顯著高于50 mg/kg 百里香酚組。

與對(duì)照組相比，50、100 mg/kg 百里香酚組和恩拉霉素組的十二指腸、空腸V/C 值顯著提高；恩拉霉素組和100 mg/kg 百里香酚組回腸V/C 值分別提高31.01%和19.13%（P＜0.05）。與恩拉霉素組相比，50、100 mg/kg百里香酚組十二指腸V/C 值分別提高21.78%和15.43%；150、200 mg/kg 百里香酚組空腸和回腸V/C 值顯著降低。各百里香酚組間，150、200 mg/kg 百里香酚組十二指腸和空腸V/C 值顯著低于50、100 mg/kg 百里香酚組。

2.3 百里香酚對(duì)肉兔免疫器官指數(shù)的影響 由表4 可知，抗生素和百里香酚對(duì)肉兔圓小囊和脾臟重量及圓小囊指數(shù)無顯著性影響，但50 mg/kg 百里香酚組脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組和恩拉霉素組。

3 討 論

3.1 百里香酚對(duì)肉兔生長性能的影響 研究發(fā)現(xiàn)，添加100、150 mg/kg 牛至油可顯著提高新西蘭肉兔的日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率[7]。孫海濤等[8]報(bào)道，添加500 mg/kg牛至油顯著提高了肉兔的日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率。Abdel-Wareth 等[5]研究表明，在高溫環(huán)境下，與1.50 g/kg橄欖油聯(lián)用，百里香精油能顯著改善兔的日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率。朱曉磊等[9]研究顯示，添加百里香精油可顯著提高22～42 日齡麻花雞的平均日增重并降低耗料增重比。馬玉芳等[10]在仔豬上的研究表明，日糧中添加牛至油能顯著提高日增重和采食量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加100～200 mg/kg 的百里香酚，能顯著提高肉兔的飼料轉(zhuǎn)化效率但對(duì)日增重?zé)o影響。當(dāng)百里香酚劑量達(dá)到200 mg/kg，采食量顯著低于對(duì)照組，這與上述報(bào)道不完全一致，可能是由于本試驗(yàn)單獨(dú)使用百里香酚所致。不同于牛至油，百里香酚具有苦味并伴有輕微灼燒感，這可能刺激動(dòng)物消化道，引起進(jìn)食厭惡，進(jìn)而降低采食量。Abdel-Wareth 等[11]研究顯示，百里香和牛至的植物粉均能提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率，但僅觀察到牛至提高了采食量。Naghmeh 等[12]對(duì)日本鵪鶉的研究表明，添加400 mg/kg 百里香精油時(shí)的飼料轉(zhuǎn)化效率效果最佳，但顯著降低了采食量，Trevisi 等[13]在仔豬方面的研究也得出了相似結(jié)果。百里香酚在降低采食量的同時(shí)能提高飼料轉(zhuǎn)化效率，這一方面可能是百里香酚通過促進(jìn)動(dòng)物腸道發(fā)育，增強(qiáng)腸道抗氧化能力，從而保障腸道完整性，激活消化酶活性，最終提高消化吸收能力；另一方面可能是其具有抗菌作用，能通過改善腸道菌群平衡，保證動(dòng)物消化吸收能力的發(fā)揮。Placha 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在生長兔日糧中添加百里香精油0.5 g/kg 顯著增加了血漿中總抗氧化能力（TAS）和肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性，降低了十二指腸組織中丙二醛（MDA）濃度，并通過提高跨上皮電阻（TEER）增強(qiáng)了腸道的完整性。李方方等[15]在斷奶仔豬日糧中添加植物精油（百里香酚和香芹酚各占25%），顯著改善了粗蛋白、鈣、磷的表觀消化率。Su 等[16]研究表明，補(bǔ)充植物精油可顯著提高斷奶仔豬干物質(zhì)消化率及十二指腸蔗糖酶和空腸黏膜乳糖酶的活性，降低血清甘油三酯和膽固醇濃度。朱曉磊等[17]研究發(fā)現(xiàn)添加百里香精油能顯著降低雞腸道大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量。

表2 百里香酚對(duì)肉兔生長性能的影響

表3 百里香酚對(duì)肉兔小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

表4 百里香酚對(duì)肉兔腸免疫器官指數(shù)的影響

3.2 百里香酚對(duì)肉兔小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)作為腸道健康的重要指標(biāo)，小腸絨毛長表示成熟細(xì)胞多和吸收面積大，對(duì)養(yǎng)分吸收能力強(qiáng)；隱窩深度反映細(xì)胞生成率，隱窩變淺表明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)。王思宇等[18]研究顯示，添加化學(xué)合成的百里香酚和香芹酚混合物可顯著增強(qiáng)仔豬十二指腸的絨毛高度，降低十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度，提高十二指腸、空腸和回腸的V/C 值。刁慧[19]研究發(fā)現(xiàn)，將苯甲酸和百里香酚聯(lián)用可顯著提高斷奶仔豬空腸絨毛高度及空腸、回腸的V/C 值。Mohiti-Asli 等[20]對(duì)肉仔雞研究表明，添加300 mg/kg 牛至油可顯著增加空腸和回腸絨毛高度，降低空腸隱窩深度，提高空腸V/C 值。韓旭[21]研究表明，添加牛至油能提高蛋雞十二指腸、空腸絨毛高度，降低十二指腸和空腸隱窩深度，提高十二指腸V/C 值。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加百里香酚可顯著提高肉兔十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度和V/C值，但并未觀察到有降低隱窩深度的作用。這與前人的研究不完全一致，可能與研究動(dòng)物和采用精油成分不同相關(guān)，也可能是不同精油成分種類之間存在一定的協(xié)同作用，致使混合精油在抑菌等方面優(yōu)于單一成分精油，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.3 百里香酚對(duì)肉兔免疫器官指數(shù)的影響 脾臟和圓小囊是兔類的重要免疫器官。脾臟是機(jī)體調(diào)控細(xì)胞免疫和體液免疫的主要場(chǎng)所。圓小囊是兔特有的免疫器官，位于回腸末端，是兔重要的腸相關(guān)淋巴組織，在消化道黏膜免疫和抗感染中起著重要作用。免疫器官指數(shù)在一定意義上能反映動(dòng)物免疫能力的高低。馮志華等[22]對(duì)斷奶獺兔的研究表明，添加牛至油可顯著提高獺兔的脾臟指數(shù)。張文靜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，采用百里香酚、香芹酚和丁香酚組成的植物精油飼喂肉仔雞，可顯著提高脾臟和法氏囊指數(shù)，但對(duì)胸腺指數(shù)無影響。本試驗(yàn)也顯示，添加50 mg/kg 百里香酚組能顯著提高肉兔的脾臟指數(shù)，與上述報(bào)道基本一致。但郝丹丹等[24]研究顯示，添加牛至油未對(duì)蛋雞的免疫器官指數(shù)造成影響，這可能是由于影響免疫器官發(fā)育的因素復(fù)雜，動(dòng)物個(gè)體之間差異較大，單個(gè)試驗(yàn)尚不能完全反映實(shí)際情況。因此，百里香酚對(duì)肉兔免疫能力的影響還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在肉兔日糧中添加百里香酚可提高肉兔的生長性能，改善小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)動(dòng)物腸道發(fā)育，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力。本試驗(yàn)中，百里香酚對(duì)肉兔生長性能、小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)以及免疫器官的影響與10 mg/kg 恩拉霉素相比差異不大，具有替代抗生素的潛力。綜合考慮，建議肉兔日糧中百里香酚適宜添加量為50～100 mg/kg。