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    Cry1 基因在雄性綿羊生殖軸系的表達(dá)與定位

    2021-03-15 05:40:08王守法趙淑琴劉彩萍張彩霞祝莉萍汪瑞龍
    中國畜牧雜志 2021年3期
    關(guān)鍵詞:生物鐘軸系下丘腦

    王守法,趙淑琴,劉彩萍,張彩霞,韓 樂,祝莉萍,汪瑞龍

    (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,甘肅蘭州 730070)

    已有研究表明,Cry1 蛋白在人和小鼠的垂體、肝臟、性腺等組織中廣泛表達(dá)[8]。羅萬偉等[9]研究發(fā)現(xiàn),Cry基因在不同年齡段的綿羊垂體中均有表達(dá)。Cry1 蛋白在30 日齡牦牛睪丸中的表達(dá)量最低,隨著年齡的增長表達(dá)量逐漸增高[10-11]。研究哺乳動物生物鐘節(jié)律基因的表達(dá)對分析動物的季節(jié)性發(fā)情意義重大。但目前對Cry1 蛋白在綿羊生殖軸系中表達(dá)定位的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對發(fā)情期綿羊生殖軸系中Cry1 蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究,對Cry 蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為分析動物繁殖與生物鐘之間的聯(lián)系提供了重要的理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 樣品采自于甘肅省蘭州市小西湖屠宰場,選健康成年雄性綿羊6 頭,頸部放血致死,采集松果體、下丘腦、垂體、睪丸和附睪組織,將這些組織分成2 份,一份置于液氮中保存,另一份置于10% 的福爾馬林中保存。

    1.2 試劑與儀器

    1.2.1 試劑 免疫組化實(shí)驗(yàn)所用到的抗體:一抗rabbit anti-CRY1,二抗Affinipure goat anti-rabbit IgG、rabbit anti-β-actin、免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物公司;RNA 提取試劑盒、蛋白Marker、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司;高效RIPA 裂解液(組織/細(xì)胞)、Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶公司。

    1.2.2 儀器 AO-820 組織切片機(jī)(Reichert,美國);HI1210 攤片機(jī)(徠卡,上海);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀LightCycler96(Roche,瑞士);微型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)印槽(伯樂公司,美國);DP71 顯微鏡(Olympus,日本)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 Quantitative RT-PCR 反應(yīng) 各組織中RNA 的提取嚴(yán)格按照RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行操作,并用超微量核酸蛋白測定儀測定RNA 濃度,用0.1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作,合成cDNA 鏈,保存于-20℃冰箱備用。所用引物設(shè)計(jì)參考羅萬偉等[9],其序列號為Cry1(NM_001129735)、內(nèi)參基因GAPDH(NM_001190390)。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

    計(jì)算完畢后,比較竣工和設(shè)計(jì)標(biāo)高差異值。其中在公式(2)中的可以直接作為實(shí)際施工立模標(biāo)高。正向分析法主要是按照實(shí)際施工的步驟順序進(jìn)行橋梁施工數(shù)據(jù)的分析測算,合理解決了傳統(tǒng)的倒裝分析法不可避免的橋梁連續(xù)施工混凝土收縮不變的計(jì)算問題[3]。假設(shè)在實(shí)際計(jì)算過程中,橋梁施工單位在第一階段應(yīng)力并沒有通過,也可以及時(shí)進(jìn)行調(diào)整。此外,正向分析法可以充分考慮設(shè)計(jì)資料和相應(yīng)施工方案,對橋梁結(jié)構(gòu)工程、施工工作以及后續(xù)的工程監(jiān)管融為一體,保證監(jiān)管工作的現(xiàn)實(shí)性和針對性。

    表1 引物序列

    以cDNA 為模板,qPCR 反應(yīng)總體系為20 μL:模板1 μL,SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL,0.05 μmol/μL上下游引物各1 μL,ddH2O 7 μL。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性5 s,60℃退火延伸30 s,循環(huán)次數(shù)45 次[12-13]。所得相關(guān)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算,每個(gè)基因相對表達(dá)量均以內(nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)進(jìn)行校正。qPCR 結(jié)果用3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示(X±SEM),所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行One-way ANOVA 顯著性分析,P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著,用GraphPad Prism 5 作圖。

    1.3.2 用免疫組織化學(xué)定位方法檢測蛋白分布 參照Lincoln 等[14]的免疫組織化學(xué)法,檢測Cry1 蛋白在各組織中的表達(dá)定位,具體步驟如下:將常規(guī)石蠟切片65℃烤片1 h 后進(jìn)行脫蠟處理,之后用PBS 洗3 次,每次5 min。再將切片置于枸櫞酸緩沖液中高壓修復(fù)1 min,自然晾至室溫后用PBS 洗3 次,每次3 min。用3%H2O2濕盒孵育10 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,用PBS沖洗5 min。滴加封閉液,室溫濕盒孵育30 min,傾去。滴加anti-Cry1 一抗,稀釋比例為1:400,對照組用PBS代替。4 ℃濕盒孵育過夜。PBS 洗3 次,每次3 min。滴加二抗,不需要稀釋,室溫濕盒孵育60 min,PBS洗3 次,每次5 min。滴加1 滴DAB 工作液進(jìn)行顯色,顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,約5 min,用蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染5~8 min(時(shí)間視顯微鏡觀察結(jié)果來定),0.1% HCl 分化,自來水沖洗,切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥后二甲苯透明,中性樹膠封固,晾干后用Olympus DP71 顯微鏡觀察并照相。

    1.3.3 Western blotting 分析 將組織用液氮研磨成糊狀后,稱取20 mg 加入250 μL 蛋白裂解液,用渦旋混勻器混勻后,10 000 r/min 4℃離心15 min,取上清[15],用Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒對上清中的蛋白含量進(jìn)行檢測,具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。剩余蛋白上清分裝后凍存至-80℃冰箱中。

    Western blotting 步驟參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[16]。分離膠濃度為10%,蛋白上樣量為30 μg,相應(yīng)的一抗(按1:1 000 的比例溶解于含5%脫脂奶粉的TBST 溶液)4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記相應(yīng)的二抗(按1:8 000 的比例溶解于含5% 脫脂奶粉的TBST 溶液)室溫孵育2 h。用PBS 在搖床上洗滌2 h,中間多次更換PBS。用高靈敏度化學(xué)發(fā)光液ECL 檢測試劑盒顯影結(jié)果,用X 膠片曝光并進(jìn)行拍照。

    1.3.4 生物信息學(xué)分析 登錄表2 所列網(wǎng)址[17-19],在序列搜索欄中輸入從NCBI 獲取的Cry1 蛋白質(zhì)序列(XP_012014825.2),對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、親水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和蛋白的同源性進(jìn)化分析等作出預(yù)測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1Cry基因在雄性綿羊生殖軸系各組織的定量檢測qPCR 結(jié)果顯示,雄性綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1基因的表達(dá)。Cry基因在下丘腦中的表達(dá)最高,其次為睪丸,在垂體中表達(dá)最少。以垂體為參照,各組織中Cry1基因的相對含量與垂體相比差異顯著(圖1-a)。Western blotting 結(jié)果印證了qPCR 結(jié)果,Cry1 蛋白在整個(gè)生殖軸系均有表達(dá),在下丘腦中的表達(dá)最高(圖1-b)。

    2.2 Cry1 蛋白在雄性綿羊生殖軸系各組織中的表達(dá)HE 染色結(jié)果顯示,雄性綿羊各組織細(xì)胞形態(tài)正常,為健康動物(圖2-a1~e1)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組背景都為藍(lán)色陰性(圖2-a2~e2),anti-Cry1 實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)組織中均出現(xiàn)免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物(黃色或棕色)。在松果體中,松果體細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的90%左右,其余主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。anti-Cry1 實(shí)驗(yàn)組顯示Cry1蛋白在松果體中呈彌散性表達(dá),細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均呈陽性表達(dá),且著色較深(圖2-a3)。在下丘腦中,胞體呈不規(guī)則的圓形、卵圓形、梭形、三角形和多角形等。實(shí)驗(yàn)組免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元呈深淺不等的棕黃色,胞核、胞質(zhì)和胞膜均呈陽性反應(yīng)(圖2-b3)。在垂體結(jié)節(jié)部中,anti-Cry1 主要在縱形毛細(xì)血管及索狀縱向排列于血管間的腺細(xì)胞表達(dá)(圖2-c3)。睪丸組織切片經(jīng)免疫組化染色后,免疫陽性物質(zhì)均主要分布在睪丸的基膜和間質(zhì)細(xì)胞中(圖2-d3)。在附睪上,管腔上皮細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和腔面精子呈陽性表達(dá)(圖2-e3)。結(jié)果顯示在下丘腦-垂體-性腺軸上都有Cry1 蛋白的存在,暗示生物鐘基因在動物的繁殖發(fā)育上發(fā)揮重要作用。

    表2 生物信息學(xué)分析登錄網(wǎng)址

    圖1 Cry1 基因在雄性綿羊生殖軸系各組織的定量檢測

    圖2 Cry 蛋白的免疫組化結(jié)果

    2.3 生物信息學(xué)分析

    2.3.1 Cry1 蛋白理化性質(zhì)及親水性分析 使用Protparam在線軟件預(yù)測Cry1 蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果顯示Cry1 蛋白由587 個(gè)氨基酸組成,分子量為66.4 kDa,理論等電點(diǎn)是8.27,半衰期是30 h,消光系數(shù)(280 nm)是124 175,肽鏈N 端是蛋氨酸,為不穩(wěn)定蛋白,脂肪系數(shù)是79.78。

    使用ProtScale 在線軟件預(yù)測Cry1 蛋白的親水性,預(yù)測結(jié)果如圖3 所示,0 值以上用來表示疏水區(qū),該區(qū)段的分值越高則表示所測蛋白的疏水性越強(qiáng),0 值以下用來表示親水區(qū),該區(qū)段的分值越低,則表示所測蛋白的親水性越強(qiáng)。Cry1(-0.391)為親水性蛋白質(zhì)。

    圖3 Cry1 蛋白親水性分析

    2.3.2 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)預(yù)測 使用NetPhos 3.1在線軟件預(yù)測Cry1 蛋白磷酸化位點(diǎn),結(jié)果如圖4 所示,Cry1 蛋白的氨基酸序列上存在53 個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中位于絲氨酸(Ser)的有33 個(gè),位于蘇氨酸(Thr)的有14 個(gè),位于酪氨酸(Tyr)的有6 個(gè)。Cry1 蛋白的糖基化位點(diǎn)有23 個(gè)。

    圖4 Cry1 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

    2.3.3 蛋白質(zhì)信號肽、跨膜域及二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析 通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)Cry1 蛋白無信號肽信息,表明該蛋白不是分泌蛋白,且Cry1 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。Cry1 蛋白二級結(jié)構(gòu)元件有α螺旋229 個(gè)(39.08%)、無規(guī)卷曲258個(gè)(44.03%)、伸展鏈63 個(gè)(10.75%)、β-轉(zhuǎn)角36個(gè)(6.14%)。

    2.3.4 Cry1 蛋白的亞細(xì)胞定位及蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Cry1 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)(52.2%)、細(xì)胞核(21.7%)、分泌囊泡(4.3%)、細(xì)胞骨架(4.3%)。Cry1 蛋白含有1 個(gè)DNA 裂解酶的FAD 結(jié)構(gòu)域,存在于288~486位氨基酸;還有1 個(gè)PhrB 超家族結(jié)構(gòu)域,存在于6~491 位氨基酸(圖5)。

    圖5 Cry1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

    2.3.5 Cry1 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 Cry1 蛋白建模模板為4k0r.1.A,其相似性為95.90%,可信度為97.62%(圖6)。

    圖6 Cry1 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

    2.3.6 不同物種Cry1 蛋白的進(jìn)化分析 通過同源性比對分析發(fā)現(xiàn)(圖7),與羊的Cry1 氨基酸序列最為相近的動物是牛,同源性為99.1%,之后依次為鹿(98.6%)、豬(98.1%)、狗(98.0%)、貓(97.7%)、馬(97.2%)、鼠(95.4%)、雞(92.5%)、人(90.3%)。由圖8 可見,綿羊的Cry1 氨基酸序列與牛和鹿最為接近。

    3 討 論

    通過qPCR 和Western blotting 實(shí)驗(yàn)顯示,雄性綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1基因的表達(dá),因此暗示Cry基因通過下丘腦-垂體-性腺軸參與哺乳動物生殖調(diào)控。Cry1在下丘腦中的表達(dá)最高,但這一結(jié)果與高磊等[20]在綿羊性腺軸上Cry基因表達(dá)的結(jié)果不相符,其結(jié)果為松果體中Cry基因的表達(dá)量明顯比其他組織的表達(dá)量高。但本研究結(jié)果與生物鐘基因主要存在于下丘腦的視交叉上核的結(jié)果相印證[1]。

    圖7 Cry1 氨基酸序列的同源性比對

    圖8 Cry1 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

    通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Cry 蛋白在雄性綿羊松果體及生殖軸系中均廣泛表達(dá),與qPCR 的結(jié)果相一致。在松果體和下丘腦中,Cry 蛋白成彌散性表達(dá),胞膜、胞質(zhì)及胞核均有陽性表達(dá)。在垂體上Cry 蛋白主要位于毛細(xì)血管的管壁細(xì)胞和血管周圍的腺細(xì)胞上,這說明血液中的某些成分對Cry 蛋白有很大影響。在睪丸上,Cry 蛋白主要位于睪丸的基膜和間質(zhì)細(xì)胞。在附睪上,Cry1 蛋白在管腔上皮細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和腔面精子上呈陽性表達(dá),這說明Cry 蛋白在精子經(jīng)過附睪的過程中,對其發(fā)育成熟發(fā)揮較大作用。有研究表明,與正常小鼠相比,Cry1基因敲除小鼠的精細(xì)胞發(fā)生改變,凋亡數(shù)目明顯增加,數(shù)量明顯減少,但血清睪酮濃度改變不明顯[21]。Bur 等[22]證明了Cry1和Cry2作為晝夜節(jié)律鐘的組成部分,對于維持雌性和雄性小鼠的性別二型性是必要的,具體來說,雙突變體Cry1-/-Cry2-/-雄鼠不能按需表達(dá)雄激素,其性激素水平與雌鼠相似,同時(shí)敲除Cry1與Cry2基因小鼠的生物鐘節(jié)律則完全喪失。

    通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Cry 蛋白為堿性蛋白質(zhì),為親水性蛋白質(zhì),無信號肽信息和跨膜結(jié)構(gòu),主要的二級結(jié)構(gòu)元件是α 螺旋和無規(guī)卷曲。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Cry1 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)綿羊的Cry1 蛋白與牛、鹿的分子進(jìn)化距離最近,說明其親緣關(guān)系最為密切。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定功能[23-24]。為保證預(yù)測分析的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)采用了多種分析軟件,雖然各種軟件的原理和算法有所不同,但是結(jié)果的相似性極高,說明預(yù)測結(jié)果具有較高的可信度。

    有文獻(xiàn)報(bào)道[25],只敲除小鼠的Cry1基因,或者只敲除小鼠Cry2基因,小鼠的生物鐘節(jié)律沒有被損壞,并且小鼠的SCN 核團(tuán)依然維持著完整的轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路。敲除Cry1基因后,小鼠不論在行為水平還是在主時(shí)鐘的調(diào)控水平上表現(xiàn)出的生物鐘節(jié)律為短周期。敲除Cry2基因后,小鼠的生物鐘節(jié)律表現(xiàn)為長周期。如果同時(shí)敲除Cry1基因與Cry2基因,小鼠的生物鐘節(jié)律則完全喪失[25]。研究還發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中過表達(dá)Cry基因后,其翻譯出的Cry 蛋白增多,CLOCK 和BMAL1 異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性會被Cry 蛋白抑制[26]??梢?,Cry1基因?qū)ι镧姷姆€(wěn)定性發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)成功得出Cry1基因在雄性綿羊生殖軸各組織中均有表達(dá),在下丘腦中的表達(dá)最高,睪丸次之,在睪丸組織的基膜和間質(zhì)細(xì)胞,以及附睪管腔上皮細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和腔面精子上呈陽性表達(dá)。

    4 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1的表達(dá),下丘腦表達(dá)最多,暗示作為生物鐘基因之一的Cry1參與了哺乳動物的生殖調(diào)控,為生物鐘調(diào)控哺乳動物的季節(jié)性繁殖提供了一定的研究基礎(chǔ)。

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