RASSF1A促進(jìn)DLD-1細(xì)胞凋亡和線粒體自噬并抑制DLD-1細(xì)胞增殖和黏附

胡 斐，陳 麗，馬 萍，唐文如，盛苗苗

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球2018 年新增結(jié)直腸癌病例19 292 789 例，在所有新增腫瘤病例數(shù)中占10%，居第3 位；死亡9 958 133 例，占腫瘤所有死亡病例的9.4%，居第2 位[1]。根據(jù)中國(guó)各地區(qū)登記的惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率數(shù)據(jù)估計(jì)，2015 年中國(guó)新發(fā)結(jié)直腸癌約38.8 萬例，在全部惡性腫瘤中居第3 位，世界人口標(biāo)化發(fā)病率為17.2/10 萬；2015 年結(jié)直腸癌死亡人數(shù)為18.7 萬例，在全部惡性腫瘤中居第5 位，世界人口標(biāo)化死亡率為8.12/10 萬[2]；2013 和2014 年結(jié)直腸癌的世界人口標(biāo)化發(fā)病率分別為17.2/10萬和17.52/10 萬，世界人口標(biāo)化死亡率分別為7.76/10 萬和7.91/10 萬。由此可見，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率都呈上升趨勢(shì)[3-4]。2000—2014年，年齡＜50 歲結(jié)直腸癌患者的死亡率增加13%；但同時(shí)，由于結(jié)直腸癌早期篩查的覆蓋面較廣，因此年齡≥50 歲結(jié)直腸癌患者的死亡率下降了34%[3]。因此，早期篩查是結(jié)直腸癌防治的重要措施。

結(jié)直腸腺瘤可通過3 種分子機(jī)制發(fā)展成為結(jié)直腸癌，包括染色體不穩(wěn)定（chromosomal instability，CIN）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）和CpG 島甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP），分別占結(jié)直腸癌的65%～85%、12%～15%和10%～20%。根據(jù)CIMP，結(jié)直腸癌可分為高CIMP 和低CIMP。高CIMP 預(yù)示預(yù)后較差，但當(dāng)存在MSI 時(shí)，高CIMP 則預(yù)示著較好的預(yù)后[4]。

Ras-結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族蛋白1A（Ras-association domain family 1A，RASSF1A）是一種抑癌基因，屬于RASSF1 家族成員，參與多種生物學(xué)進(jìn)程，包括微管穩(wěn)定、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附和遷移以及細(xì)胞凋亡等。在多種腫瘤中，RASSF1A基因常因啟動(dòng)子高甲基化而沉默，而甲基化是腫瘤的高風(fēng)險(xiǎn)因素[5-6]。RASSF1A基因的甲基化率在各種腫瘤中不盡相同，在肺癌中為32%～82%，在胃癌中為4%～67%，在肝癌中為19%～100%，在乳腺癌中為49%～65%[7]。

結(jié)直腸癌中RASSF1A基因的甲基化率為12%～81%。RASSF1A 與結(jié)直腸癌相關(guān)性的Meta 分析以及腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析結(jié)果都顯 示，RASSF1A 是結(jié)直腸癌的高危因素，并且預(yù)示預(yù)后較差[8-9]。雖然RASSF1A基因甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系較為密切，但RASSF1A 在結(jié)直腸癌中的抑癌機(jī)制尚待深入研究。本研究首先篩選得到RASSF1A基因甲基化的結(jié)直腸癌DLD-1 細(xì)胞，然后恢復(fù)DLD-1 細(xì)胞中RASSF1A 的表達(dá)水平，隨后進(jìn)一步研究其對(duì)DLD-1 細(xì)胞的增殖、凋亡、線粒體膜電位以及細(xì)胞黏附的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

人結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞DLD-1 以及人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116、SW480、HT-29 和LoVo 購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)（北京總部）。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

Annexin Ⅴ-FITC/ 碘化丙 啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：556547）購(gòu)自美國(guó)BD 公司，JC-1 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：M8650）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，CCK-8 試劑盒（貨 號(hào)：40203ES76）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，DCFHDA（貨 號(hào)：D6883）和TRIzol 試 劑（貨 號(hào)：T9424）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒Roche SYBR Green Master（貨號(hào)：4913914001）購(gòu)自瑞士Roche 公司，空載體PEAK13 由本實(shí)驗(yàn)室自行保存，克隆試劑盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（貨號(hào)：C113-01）和亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）擴(kuò)增使用的Green Taq Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINETM2000（貨號(hào)：11668-019）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，亞硫酸鹽修飾試劑盒EZ DNA Methylation-Gold Kit（貨號(hào)：D5006）購(gòu)自美國(guó)Zymo Research 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑（貨號(hào)：A2801）購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。限制性核酸內(nèi)切酶NheI（貨號(hào)：1241S）購(gòu)自日本TaKaRa公司，NotI 購(gòu)自美 國(guó)New England Biolabs 公司（貨號(hào)：R3189S）。感受態(tài)細(xì)胞T1（貨號(hào)：370419）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取和PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（貨號(hào)：DP103-02 和DP204-02）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。兔抗人RASSF1A8 多克隆抗體（貨號(hào)：NHA297）購(gòu)自美國(guó)Novogene 公司，鼠抗人Bcl-2 單克隆抗體（貨號(hào)：610539）購(gòu)自美國(guó)BD 公司，鼠抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（貨號(hào)：SC-322333）和兔抗人Bcl-2 結(jié)合蛋白X（Bcl-2-associated X，Bax）多克隆抗體（貨號(hào)：SC-493）購(gòu)自美國(guó)SANTA 公司，兔抗人Yes 相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）（貨號(hào)：A1002）、磷酸化-YAP1（phospho-YAP1，p-YAP1）、p-YAP1-S397（貨號(hào)：AP0922）、絲氨酸/ 蘇氨酸-蛋白激酶1（serine/threonine-protein kinase 1，LATS1）（貨號(hào)：A7159）和p-LATS1-S909/LATS2-S872 多克隆抗體（貨號(hào)：AP0904）均購(gòu)自美國(guó)ABclonal 公司，兔抗人PRKN（parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase）多克隆抗體（貨號(hào)：WL02512）購(gòu)自美國(guó)Wanleibio 公司，兔抗人LC3 多克隆抗體（貨號(hào)：NB100-2331）購(gòu)自美國(guó)NOVUS 公司，兔抗人p62 單克隆抗體（貨號(hào)：8025s）購(gòu)自美國(guó)CST 公司，鼠抗人RAS 單克隆抗體（貨號(hào)：610002）購(gòu)自美國(guó)BD 公司，兔抗人RAF-1 多克隆抗體（貨號(hào)：SC-133）購(gòu)自美國(guó)SANTA 公司，鼠抗人絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）單克隆抗體（貨號(hào)：4694S）、兔抗人p-MEK-S217/221（貨號(hào)：0154S）、磷酸化-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phospho-extracellular signalregulated kinase，p-ERK）（貨號(hào)：3192S）和磷脂酰肌 醇3-激 酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）單克隆抗體（貨號(hào)：4249S）、兔抗人哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶體蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）多克隆抗體（貨號(hào)：2972S），兔抗人p-mTOR-S2448 單克隆抗體（貨號(hào)：2976S）、兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）單克隆抗體（貨號(hào)：3788S）、兔抗人p-AKT-T308（貨號(hào)：9275S）、4EBP1（貨號(hào)：9452S）、p-4EBP1（T37/46）（貨號(hào)：9459S）、p-4EBP1（S65）（貨號(hào)：9451S）和p-4EBP1-T70多克隆抗體（貨號(hào)：9455S）均購(gòu)自美國(guó)CST 公司，鼠抗人α-tubulin 和β-actin 單克隆抗體（貨號(hào)：sc-69971 和sc-47778）購(gòu)自美國(guó)SANTA 公司，兔抗人cofilin（貨號(hào)：A1704）和CTTN（貨號(hào)：A18038）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abclonal 公司，兔抗人黏著斑蛋白（vinculin）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，兔抗人β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體（貨號(hào)：9562S）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（貨號(hào)：111-035-003）或羊抗鼠（貨號(hào)：115-035-003）IgG 購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research 公司。

PCR 儀（型號(hào)：2720）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)7300）為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀（型號(hào)：Accuri C6）為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品。

1.2 BSP 法檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中RASSF1A 基因甲基化的情況

收集人結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞DLD-1 以及人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT116、SW480、HT-29 和LoVo（細(xì)胞數(shù)為2×106～1×107個(gè)）共5 種細(xì)胞株，采用異丙醇沉淀法抽提細(xì)胞DNA；隨后，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit 對(duì)DNA 進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，以修飾后的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。上游引物序列為5’-GGTTTTATAGT TTTTGTATTTAGGTTTTTA-3’，下游引物序列為5’-CAACTCAATAAACTCAAACTCCC-3’（Green Taq 酶為北京諾禾致源科技股份有限公司產(chǎn)品）。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃解鏈30 s，退火溫 度從72 ℃開始梯度下降，每一個(gè)循環(huán)降低2 ℃，逐步將退火溫度降至58 ℃，退火時(shí)間為45 s，72 ℃延伸1 min；以58 ℃為退火溫度再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成PCR 產(chǎn)物測(cè)序。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RASSF1A mRNA 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

收集人 結(jié)直腸 癌DLD-1、HCT116 和HT-29 細(xì)胞株（細(xì)胞數(shù)為2×106～1×107個(gè)）。采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，并且反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA 為模板（1 μL），加入5 μL 2×SYBR Green 和終濃度為0.5 μmol/L 的上下游引物，用去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體積至10 μL。用AB公司的7300 RT 機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min。RASSF1A基因上游引物序列為5’-CACCTG ACCTTTCTCAAG-3’，下游引物序列為5’-GA TGAAGCCTGTGTAAGAA-3’；內(nèi)參照GAPDH基因上游引物序列為5’-GGTGGTCTCCTC TGACTTCAACA-3’，下游引物序列為5’-GTT GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’。

1.4 構(gòu)建RASSF1A 基因過表達(dá)載體

以HT-29 細(xì)胞的cDNA（cDNA 的獲得同1.3 節(jié)）為模板，以攜帶有限制性核酸酶切NheI和NotI 序列的引物進(jìn)行RASSF1A基因擴(kuò)增。RASSF1A基因上游引物序列為5’-GAAGCTT GAATTCGCGCTAGCCATGTCGGGGGAGCC TGAG-3’，下游引物序列為5’-TGGGCTGGCT TACCTGCGGCCGCTTCACCCAAGGGGGCA GG-3’。DNA 擴(kuò)增采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的Phanta? Max Super-Fidelity 試劑盒，具體PCR 擴(kuò)增條件參閱試劑盒提供的操作說明。擴(kuò)增獲得的PCR 產(chǎn)物采用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收，然后用NheI 和NotI 雙酶切處理載體，DNA 片段不進(jìn)行酶切處理。將酶切處理后的載體和回收的PCR 產(chǎn)物用ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit 進(jìn)行連接。將連接獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)T1 細(xì)胞中，并進(jìn)行克隆篩選。具體流程：先冰上解凍50 μL T1細(xì)胞，解凍后加入5 μL 重組質(zhì)粒，冰上孵育30 min，42 ℃水浴60 s，加入500 μL 不含抗生素的LB 培養(yǎng)液，37 ℃低速振蕩孵育2 h，然后涂抹至固體LB 培養(yǎng)基上，37 ℃ 16 h；挑選陽性克隆進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增。以菌落為模板，先以5’-CA TGCTAGCCATGTCGGGGGAGCCTGAG-3’為上游引物，5’-CGCGCGGCCGCTCTCATG AATTCACCCAAGGGGGCAGG-3’為下游引物進(jìn)行第1 輪篩選，得到第1 輪陽性菌落；再?gòu)?第1 輪陽性 菌落中，以5’-GCAGTGCG CGCATTGC-3’為上游引物以及5’-CGCGCG GCCGCTCTCATGAATTCACCCAAGGGGGCA GG-3’為下游引物進(jìn)行第2 輪篩選，得到第2 輪陽性菌落。由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司對(duì)第2 輪陽性菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得到序列準(zhǔn)確的陽性克隆。挑取陽性克隆接種于LB 培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。然后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1.5 CCK-8 法檢測(cè)

采用CCK-8 法檢測(cè)RASSF1A基因過表達(dá)對(duì)DLD-1 細(xì)胞增殖的影響。先將DLD-1 細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，待12 h 細(xì)胞貼壁后用，采用LipofectAMINETM2000 進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將RASSF1A基因過表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DLD-1細(xì)胞，以細(xì)胞中只加入轉(zhuǎn)染試劑作為對(duì)照組。分別于24、48 和72 h 時(shí)加入CCK-8 試劑，37 ℃孵育30 min 后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔的D值。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

采用FCM 法檢測(cè)RASSF1A基因過表達(dá)對(duì)DLD-1 細(xì)胞凋亡的影響。將DLD-1 細(xì)胞以1.75×105個(gè)的細(xì)胞數(shù)接種于6 孔板中，待12 h 細(xì)胞貼壁后，采用LipofectAMINETM2000 進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分組同1.5 節(jié)。待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48 和72 h 后收集細(xì)胞，用Annexin V-FITC/PI 染色后檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)流程參閱說明書。

1.7 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)

DCFH-DA 用DMSO 配制成10 nmol/L 的母液。細(xì)胞的處理及分組同1.5 節(jié)。同時(shí)，設(shè)置加入H2O2處理的陽性對(duì)照組[即在細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后向陽性對(duì)照組中加入2% 的H2O2（以1 ∶1 000 的體積比進(jìn)行稀釋），37 ℃處理30 min]。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，更換為無血清培養(yǎng)液，同時(shí)以1 ∶1 000 的體積比進(jìn)行稀釋后加入DCFH-DA，37 ℃孵育30 min。用胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，再用PBS 重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS 含量。

1.8 膜電位檢測(cè)

將DLD-1 細(xì)胞（1.75×105個(gè)）接種于6 孔板中，待12 h 細(xì)胞貼壁后，用Lipofect AMINETM2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞的處理及分組同1.5 節(jié)。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，采用JC-1 試劑盒進(jìn)行膜電位檢測(cè)，檢測(cè)流程參閱說明書。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

DLD-1 細(xì)胞（1.75×105個(gè)/孔）接種于6 孔板 中，待12 h 細(xì)胞貼壁后，用Lipofect AMINETM2000 進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分別于24、48 和72 h 時(shí)收集細(xì)胞。用RIPA 蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，隨后按20 μg/孔的上樣量行SDS-PAGE 分離蛋白（分離膠濃度為4%～20%梯度），將分離后的蛋白采用濕轉(zhuǎn)法以180 mA 的電流3 h 轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫條件下封閉處理1 h；用TBST 洗膜，每次5 min 重復(fù)3次；用含2%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）的TBS 稀釋一抗（體積稀釋比例均為1 ∶1 000）后，滴加于膜上4 ℃孵育過夜。再用TBST洗膜，每次5 min 重復(fù)3 次；加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG），二抗與TBST 的體積稀釋比例均為1 ∶1 000，室溫孵育2 h；用TBST 洗膜，每次10 min 重復(fù)3 次。最后加入電化學(xué)發(fā)光試劑于膜上，采用Tanon 化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

Fig.1 The methylation of Ras-association domain family 1A (RASSF1A) promoter in DLD-1,HCT116,HT-29,LoVo and SW480 cells was detected by bisulfite sequencing PCR (BSP).圖1 BSP 法檢測(cè)5 種結(jié)直腸癌細(xì)胞株（DLD-1、HCT116、HT-29、LoVo 和SW480）中RASSF1A 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況

所用一抗為兔抗人RASSF1A8、Bax、YAP1、p-YAP1、p-YAP1-S397、LATS1、p-LATS1-S909/LATS2-S872、PRKN、LC3 和RAF-1 多克隆抗體，鼠抗人Bcl-2、RAS 和GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體，兔抗人p62 單克隆抗體，鼠抗人MEK單克隆抗體，兔抗人p-MEK-S217/221、p-ERK和p-PI3K 單克隆抗體，兔抗人mTOR 多克隆抗體、兔抗人p-mTOR-S2448 單克隆抗體、兔抗人AKT 單克隆抗體及兔抗人p-AKT-T308 多克隆抗體，兔抗人4EBP1、p-4EBP1（T37/46）、p-4EBP1（S65）和p-4EBP1-T70 多克隆抗體，鼠抗人α-tubulin 和β-actin 單克隆抗體，兔抗人cofilin、CTTN、vinculin 和β-catenin 多克隆抗體。顯影液使用Tanon（貨號(hào)：180-501）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graph Pad Prism 7 軟件對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，計(jì)量資料以表示。各組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Tukey-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLD-1 細(xì)胞中RASSF1A 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可導(dǎo)致表達(dá)沉默

首先采用BSP 方法檢測(cè)結(jié)直腸癌DLD-1、HCT116、HT-29、LoVo 和SW480 細(xì)胞中RASSF1A基因的甲基化水平。結(jié)果（圖1）顯示，只有DLD-1 細(xì)胞中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化。

為了驗(yàn)證啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)RASSF1A基因轉(zhuǎn)錄的影響，本研究檢測(cè)了DLD-1、HCT116 和HT-29 細(xì)胞中RASSF1A mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果（圖2）顯示，與HCT116 和HT-29 細(xì)胞相比，DLD-1 細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到RASSF1A mRNA的表達(dá)。

Fig.2 The expressions level of Ras-association domain family 1A (RASSF1A) mRNA in DLD-1,HCT116 and HT-29 cells was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.**P＜0.01,vs DLD-1 cells (n=3).圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)3 種結(jié)直腸癌細(xì)胞株（DLD-1、HCT116 和HT-29）中RASSF1A mRNA 的表達(dá)水平

Fig.3 The expression level of Ras-association domain family 1 A (RASSF1A) protein in DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A for 4,8,12,24 and 48 h was detected by Western blotting.DLD-1 cells were treated with only LipofectAMINETM 2000 as the control.圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)入RASSF1A 基因過表達(dá)重組質(zhì)粒（pEAK13-RASSF1A）不同時(shí)間后對(duì)DLD-1 細(xì)胞中RASSF1A 蛋白表達(dá)水平的影響

隨后構(gòu)建了RASSF1A 過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入DLD-1 細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染RASSF1A 過表達(dá)載體8 h 后，DLD-1 細(xì)胞開始表達(dá)RASSF1A 蛋白。

2.2 RASSF1A 基因過表達(dá)促進(jìn)DLD-1 細(xì)胞凋亡

為驗(yàn)證RASSF1A 是否參與了DLD-1 細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，本研究將RASSF1A 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入DLD-1 細(xì)胞中以恢復(fù)其表達(dá)。在重組質(zhì)粒PEAK13-RASSF1A 轉(zhuǎn) 染24、48 和72 h 時(shí)，采用FCM 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示（圖4）顯示，相較于對(duì)照組，RASSF1A 過表達(dá)組在24、48 和72 h 時(shí)的DLD-1 細(xì)胞凋亡率明顯提高（P均＜0.05）。

進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymeras，PARP）的表達(dá)水平。結(jié)果（圖5A）顯示，相較于對(duì)照組，24、48 和72 h時(shí)RASSF1A 過表達(dá)組中Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)（P均＜0.001），并出現(xiàn)剪切型-PARP的表達(dá)（P＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了RASSF1A 對(duì)DLD-1 細(xì)胞的促凋亡作用。

同時(shí)，本研究還進(jìn)一步檢測(cè)了與凋亡相關(guān)MST/LATS/YAP 通路。結(jié)果顯示（圖5B），72 h時(shí)LATS1（P＜0.05）和YAP1（P＜0.001）蛋白及其磷酸化p-LATS1（P＜0.001）和p-YAP1蛋白（P＜0.001）的表達(dá)水平均明顯下調(diào)。這一結(jié)果提示YAP1 功能的下調(diào)，提示RASSF1A 也可通過此通路促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

2.3 RASSF1A 過表達(dá)促進(jìn)DLD-1 細(xì)胞線粒體自噬

雖然本研究中觀察到RASSF1A 過表達(dá)可促進(jìn)DLD-1 細(xì)胞凋亡，但同時(shí)也觀察到Bax 表達(dá)水平下調(diào)（圖5A）。通過查找相關(guān)文獻(xiàn)[10]發(fā)現(xiàn)，環(huán)-環(huán)間-環(huán)PRKN 能夠使Bax 定位于線粒體膜上，并使其降解。PRKN 還可通過促進(jìn)線粒體蛋白TOMM20、RHOT1/MIRO1 和USP30 的泛素化而促進(jìn)功能失調(diào)的膜電位降低的線粒體自噬。因此，本研究使用攜帶有RASSF1A基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DLD-1 細(xì)胞48 h 后，采用DCFH-DA探針檢測(cè)DLD-1 細(xì)胞中的ROS 水平，并使用JC-1 探針檢測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位水平。

Fig.4 The effect of Ras-association domain family 1A (RASSF1A) overexpression on apoptosis of DLD-1 cells was detected by FCM method.pEAK13-RASSF1 group: DLD-1 cells were transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A;Control group: DLD-1 cells were treated with LipofectAMINETM2000 alone.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).圖4 FCM 法檢測(cè)RASSF1A 過表達(dá)對(duì)DLD-1 細(xì)胞凋亡的影響

DCFH-DA 染色法檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，在H2O2刺激下，細(xì)胞內(nèi)ROS 含量明顯增多；與對(duì)照組相比，在H2O2的刺激下，DCFH-DA 熒光帶右移（P＜0.001），但RASSF1A 過表達(dá)組未發(fā)現(xiàn)DCFH-DA 熒光帶明顯右移（P＜0.05），由此說明DLD-1 細(xì)胞中ROS 水平未發(fā)生變化。

JC-1 染色法檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，DLD-1細(xì)胞過表達(dá)RASSF1A 后，JC-1 的綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05），說明細(xì)胞的線粒體膜電位下降。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，轉(zhuǎn)入RASSF1A 48 h 時(shí)，線粒體自噬蛋白PRKN 表達(dá)水平即上調(diào)（P＜0.05）。檢測(cè)DLD-1 細(xì)胞的自噬水平，發(fā)現(xiàn)24 h 時(shí)LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05），而p62 蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01）。

2.4 RASSF1A 過表達(dá)抑制DLD-1 細(xì)胞增殖

鑒于RASSF1A 可促進(jìn)DLD-1 細(xì)胞凋亡，本研究又檢測(cè)了其對(duì)DLD-1 細(xì)胞增殖的影響。使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)RASSF1A 轉(zhuǎn)染至DLD-1 后24、48 和72 h 時(shí)的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果（圖9）顯示，從48 h 開始，RASSF1A 可明顯抑制DLD-1 細(xì)胞的增殖（P＜0.01）。

由于RASSF1A 是RAS 結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員，因此檢測(cè)RAS/RAF 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果（圖10）顯示，在轉(zhuǎn)染RASSF1A 后，RAS和RAF的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P均＜0.001）。隨后，又檢測(cè)了與增殖相關(guān)的PI3K/mTOR 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果（圖11）顯示從48 h 開始，PI3K 和p-PI3K 及其下游mTOR 和p-mTOR 的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P均＜0.01）。

Fig.5 The expression levels of apoptosis-related proteins Bcl-2,Bcl-2-associated X (Bax),poly ADPribose polymeras (PARP) and cleaved-PARP (A) as well as MST/LATS/YAP pathway-related proteins Yesassociated protein 1 (YAP1),phospho-YAP1 (p-YAP1),serine/threonine-protein kinase 1 (LATS1) and p-LATS1 (B) in DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A were detected by Western blotting.DLD-1 cells were treated with LipofectAMINETM 2000 alone as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)入RASSF1A 基因過表達(dá)重組質(zhì)粒（pEAK13-RASSF1A）不同時(shí)間后對(duì)DLD-1 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白（A）以及MST/LATS/YAP 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白（B）表達(dá)水平的影響

Fig.6 The reactive oxygen species (ROS) level in DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A was detected by DCFH-DA method.DLD-1 cells were treated with LipofectAMINETM 2000 alone as the control;DLD-1 cells were treated with H2O2 as the positive control.***P＜0.001 (n=3).圖6 采用DCFH-DA 染色法檢測(cè)RASSF1A 基因過表達(dá)對(duì)DLD-1 細(xì)胞中ROS 水平的影響

Fig.7 The mitochondrial membrane potential of DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A was detected by JC-1 method.DLD-1 cells were treated with only LipofectAMINETM 2000 as the control.*P＜0.05 (n=3).圖7 JC-1 探針法檢測(cè)RASSF1A 基因過表達(dá)對(duì)DLD-1 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Fig.8 The expression levels of autophagy-related proteins PRKN,LC3 and p62 in DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A for 24,48 and 72 h were detected by Western blotting.DLD-1 cells were treated with LipofectAMINETM 2000 alone as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,vs the control group(n=3).圖8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)入RASSF1A 基因過表達(dá)重組質(zhì)粒（pEAK13-RASSF1A）后不同時(shí)間對(duì)DLD-1 細(xì)胞線粒體膜自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Fig.9 The cell viabilities of DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A for 24,48 and 72 h were detected by CCK-8 method.DLD-1 cells were treated with LipofectAMINETM2000 alone as the control.**P＜0.01,***P＜0.01 (n=3).圖9 CCK-8 法檢測(cè)轉(zhuǎn)入RASSF1A 基因過表達(dá)重組質(zhì)粒（pEAK13-RASSF1A）不同時(shí)間后對(duì)DLD-1細(xì)胞增殖的影響

Fig.11 The expression levels of Ras/Raf pathway-related proteins phosphoinositide 3-kinase (PI3K),phospho-PI3K (p-PI3K),mammalian target of rapamycin (mTOR),p-mTOR,4EBP1,p-4EBP1,protein kinase B (PKB，also known as AKT) and p-AKT in DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A for 24,48 and 72 h were detected by Western blotting.DLD-1 cells were treated with LipofectAMINETM2000 alone as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖11 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)入RASSF1A 基因過表達(dá)重組質(zhì)粒（pEAK13-RASSF1A）不同時(shí)間后PI3K/mTOR 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.5 RASSF1A 過表達(dá)抑制DLD-1 細(xì)胞的黏附能力

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖12A）顯示，轉(zhuǎn)入pEAK13-RASSF1A 48 h 后，DLD-1 細(xì)胞中β-actin 蛋白的表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01）。通過檢索文獻(xiàn)[11]發(fā)現(xiàn)，β-actin 可能參與細(xì)胞的黏附過程。

隨后，本研究檢測(cè)了細(xì)胞黏附附相關(guān)蛋白，結(jié)果（圖12B）顯示轉(zhuǎn)入pEAK13-RASSF1A72h后，細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白β-catenin、vinculin 和CTTN 的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P均＜0.01）。這一結(jié)果表明，RASSF1A 可抑制黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)。

Fig.12 The expression levels of β-actin (A),adhesion protein cofilin,CTTN,vinculin and β-catenin (B)in DLD-1 cells transfected with recombinant plasmid pEAK13-RASSF1A for 24,48 and 72 h were detected by Western blotting.DLD-1 cells were treated with LipofectAMINETM2000 alone as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖12 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)入RASSF1A 基因過表達(dá)重組質(zhì)粒（pEAK13-RASSF1A）后不同時(shí)間對(duì)β-actin（A）和細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白（B）表達(dá)水平的影響

3 討論

本研究首先從結(jié)直腸癌細(xì)胞中篩選出RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的DLD-1 細(xì)胞，隨后將構(gòu)建的RASSF1A 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入DLD-1細(xì)胞中，使其恢復(fù)RASSF1A 的表達(dá)，并且從細(xì)胞凋亡、增殖、黏附和線粒體自噬等多個(gè)方面檢測(cè)恢復(fù)RASSF1A 表達(dá)對(duì)DLD-1 細(xì)胞的影響。研究結(jié)果顯示，RASSF1A 能夠通過抑制YAP 和Bcl-2 通路而促進(jìn)DLD-1 細(xì)胞的凋亡；同時(shí)，能夠通過上調(diào)PRKN 表達(dá)水平促進(jìn)線粒體自噬。此外，RASSF1A 還能夠抑制PI3K/mTOR 和RAS/RAF-1 通路，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1 的增殖，并且通過下調(diào)細(xì)胞黏附相關(guān)蛋白β-catenin和vinculin 等的表達(dá)而降低細(xì)胞的黏附能力。

一般認(rèn)為，RASSF1A 能夠通過磷酸化激活MST1/2，而MST1/2 磷酸后可進(jìn)一步激活LATS1/2，激活的LATS1/2 可使下游的YAP1 磷酸化，從而阻止YAP 入核行使促癌功能，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，MST/LATS/YAP 通路中YAP 及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平均有所下降，說明RASSF1A 在DLD-1 細(xì)胞中可能并非通過MST/LATS/YAP 通路來影響YAP1 的功能，而是通過其他機(jī)制抑制YAP1 的促癌功能。此外，對(duì)于YAP1 究竟發(fā)揮抑癌還是促癌作用，尚存在一定的分歧。YAP 在結(jié)直腸癌中既發(fā)揮促癌作用，又發(fā)揮抑癌作用[12]。除YAP 通路以外，本研究還從Bcl-2 和Bax 蛋白水平檢測(cè)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況。同時(shí)，本研究還觀察到RASSF1A 可使DLD-1 細(xì)胞中線粒體自噬增加而引起膜電位改變，提示RASSF1A 還可能通過線粒體自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

一些細(xì)胞黏附分子的高表達(dá)能夠促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn) 化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）的發(fā)生，使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性增加，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，并且EMT 被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主要因素[13]。β-catenin 作為E-cadherin/catenin 復(fù)合物的成分，可能參與了細(xì)胞黏附性的調(diào)控，由此推測(cè)RASSF1A 也可能通過下調(diào)β-catenin 而進(jìn)一步下調(diào)E-cadherin 的表達(dá)水平，從而在一定程度上抑制EMT 的發(fā)生。CTTN（cortactin）除了參與對(duì)β-actin 和細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控以外，還能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。由此推測(cè)，RASSF1A 可能通過下調(diào)CTTN 的表達(dá)水平，抑制DLD-1 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這為今后的研究提供了新的方向。本研究還通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了LC3-Ⅱ的表達(dá)情況，從細(xì)胞水平驗(yàn)證自噬的發(fā)生，并且在細(xì)胞水平對(duì)細(xì)胞黏附進(jìn)行了驗(yàn)證。

總之，RASSF1A 可以通過促進(jìn)DLD-1 細(xì)胞的凋亡和線粒體自噬以及抑制細(xì)胞的增殖和黏附而發(fā)揮抑癌作用。今后有待開展進(jìn)一步研究，更深入地探討RASSF1A 在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制。