硫酸右旋糖苷通過抑制M2型巨噬細(xì)胞極化以減弱M2型巨噬細(xì)胞對(duì)HGC-27胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的促進(jìn)作用

郭嘉欣 ，李夢琪，趙 媛，陶月佳，李 冰，徐遠(yuǎn)義，黃允寧

胃癌是世界范圍最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。由于胃癌早期隱匿性強(qiáng)，患者就診時(shí)往往已發(fā)展為晚期轉(zhuǎn)移性胃癌，其死亡率高[2]。盡管已出現(xiàn)許多治療胃癌的新興療法，如根除幽門螺旋桿菌、術(shù)前或術(shù)后輔助化療、免疫療法、靶向治療以及一些小分子抑制劑治療等[3]，但是胃癌的進(jìn)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致其5 年總生存率仍低于35%[4]。

胃癌腹腔轉(zhuǎn)移不僅是腫瘤進(jìn)展的結(jié)果，更可能是腫瘤微環(huán)境內(nèi)廣泛的細(xì)胞間相互作用的結(jié)果[5]。有研究指出，腫瘤微環(huán)境中的M2 型巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移而促進(jìn)胃癌進(jìn)展[6]。近年來的研究指出，通過直接或間接抑制M2 型巨噬細(xì)胞的增殖或募集是抗腫瘤免疫療法的潛在目標(biāo)，并且一些靶向M2 型巨噬細(xì)胞的試劑正在進(jìn)行臨床前試驗(yàn)[7]。因此，研究靶向胃癌中的M2 型巨噬細(xì)胞，可能為胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的治療提供一些新的思路。

硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）是一種相對(duì)分子質(zhì)量為5×105的糖類，能夠直接抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移以及裸鼠胃癌腹腔移植瘤的轉(zhuǎn)移[8-9]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射DS 的裸鼠的轉(zhuǎn)移瘤組織中M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤程度明顯下降[10]，表明DS 可能通過影響腫瘤免疫微環(huán)境而影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

本研究首先通過體外實(shí)驗(yàn)檢測DS 對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞極化和募集的影響，以及DS 對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞與胃癌細(xì)胞之間相互作用的影響，然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析M2 型巨噬細(xì)胞與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以期為DS 的抗腫瘤研究提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織標(biāo)本收集

收集寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2018 年10 月—2019 年12 月經(jīng)手術(shù)切除、術(shù)后病理確診為胃癌的病理組織標(biāo)本34 例，以及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（選取距腫瘤邊緣＞2 cm 的胃黏膜組織）標(biāo)本12例。34 例患者中，男性20 例、女性14 例，年齡范圍為44～81 歲。所有患者術(shù)前均未接受過放療或化療，并且不伴有其他惡性腫瘤。所有的組織標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)固定和脫水處理后，石蠟包埋制作成蠟塊；隨后經(jīng)切片機(jī)切成4 μm 厚度的連續(xù)切片以供后續(xù)研究。本研究獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2020103）。

1.2 細(xì)胞、試劑及儀器

人胃癌細(xì)胞HGC-27 和人單核細(xì)胞THP-1購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DS（貨 號(hào)：D8906）和佛波 酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）購自美國Sigma公司，白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）和IL-13 購自美國PeproTech 公司。兔抗人CD163和CD206 單克隆抗體購自英國Abcam 公司，兔抗人CD68 單克隆抗體購自美國CST 公司，兔抗人N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）多克隆抗體和鼠抗人GAPDH 單克隆抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒和BCA 檢測試劑盒等購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，孔徑為8.0 μm 的Transwell 小室購自廣州潔特生物過濾股份有限公司，鋪設(shè)有孔徑為0.4 μm 預(yù)制膠的Transwell 小室購自美國Corning 公司。

熒光顯微鏡和倒置光學(xué)顯微鏡均為日本Olympus 公司產(chǎn)品，凝膠圖像分析儀（Amersham Imager 600，GEL）為美國GE Healthcare 公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及DS 的配制

HGC-27 胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含1%青鏈霉素和15%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，細(xì)胞均置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、恒溫恒濕的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。稱取0.3 g DS 溶于10 mL PBS 中，配制獲得濃度為3%的DS 母液，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)液中加入相應(yīng)體積的DS 母液，使DS 的終濃度為0.3%。

1.4 M0 和M2 型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及驗(yàn)證

1.4.1 M0 和M2 型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)流程

取對(duì)數(shù)生長期的THP-1 細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液重懸后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取3 mL THP-1 細(xì)胞懸液接種至直徑為6 cm 的培養(yǎng)皿中，加入終濃度為200 ng/mL 的PMA 進(jìn)行干預(yù)，誘導(dǎo)24 h 后厚獲得M0 型巨噬細(xì)胞。將誘導(dǎo)獲得的M0 型巨噬細(xì)胞除去培養(yǎng)液后，用PBS 清洗細(xì)胞2 次；加入質(zhì)量濃度為100 ng/mL 的PMA以及20 ng/mL 的IL-4 和IL-13 誘導(dǎo)24 h 后獲得M2 型巨噬細(xì)胞。

1.4.2 免疫細(xì)胞熒光法驗(yàn)證M0 和M2 型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)結(jié)果

分別用免疫細(xì)胞熒光檢測誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞上M0 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD68）和M2 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD206）的表達(dá)水平。將制備獲得的M0 和M2 型巨噬細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/片的密度爬片后，用100% 甲醇溶液固定細(xì)胞5 min，加入0.1% Tween-20 通透處理30 min，用含10%山羊血清的封閉液封閉處理30 min，加入一抗[兔抗人CD206 和CD68 單克隆抗體（體積稀釋比例均為1 ∶1 000）] 4 ℃孵育過夜，再加入二抗[FITC-山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶20）] 37 ℃孵育1 h，避光條件下用PBS浸泡5 min，清洗3 次，加入DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色，最后用抗淬滅處理后封片，熒光顯微鏡下觀察熒光染色情況并拍照。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測THP-1 細(xì)胞、M0 型巨噬細(xì)胞和M2 型巨噬細(xì)胞中CD163 蛋白的表達(dá)水平

參照全蛋白提取試劑盒操作說明書，提取誘導(dǎo)獲得的M0 型巨噬細(xì)胞、M2 型巨噬細(xì)胞及THP-1 細(xì)胞中蛋白，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。按40 μg/10 μL 的蛋白量進(jìn)行上樣，行10%SDS-PAGE 分離蛋白，并將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；用含5%脫脂牛奶的封閉液常溫封閉1 h，加入一抗[兔抗人CD163 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）] 4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶5 000）]常溫下孵育1 h，滴加電化學(xué)發(fā)光顯影液，采用凝膠圖像分析儀進(jìn)行分析。應(yīng)用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參照蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 DS 對(duì)M0 和M2 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化及趨化募集能力的影響

1.5.1 細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)共分成4 組：M0 組、M0DS 組、M2組和M2DS 組。M0 組：M0 型巨噬細(xì)胞（通過誘導(dǎo)獲得，見1.4.1 節(jié)）。M2 組：M2 型巨噬細(xì)胞（通過誘導(dǎo)獲得，見1.4.1 節(jié)）。M0DS 組：在M0 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，懸浮的THP-1 細(xì)胞經(jīng)PMA 處理8～12 h 后開始貼壁生長，于12 h時(shí)加入DS（終濃度為0.3%）繼續(xù)誘導(dǎo)12 h。M2DS 組：在M2 型巨噬細(xì)胞極化過程的起始階段，用DS（終濃度為0.3%）和100 ng/mL 的PMA 合 并20 ng/mL 的IL-4 和IL-13 處 理M0型巨噬細(xì)胞24 h。

1.5.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組巨噬細(xì)胞中CD163及CD206 的蛋白表達(dá)水平

收集4 組巨噬細(xì)胞（細(xì)胞分組及處理見1.5.1節(jié)），采用蛋白質(zhì)印跡法檢測巨噬細(xì)胞中CD163和CD206 蛋白的表達(dá)水平，蛋白檢測流程同1.4.3節(jié)。其中，一抗為兔抗人CD163 和CD206 單克隆抗體（工作液體積稀釋比例均為1 ∶1 000）。

1.5.3 Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測巨噬細(xì)胞的趨化募集能力

實(shí)驗(yàn)同樣分為4 組：M0 組、M0DS 組、M2組和M2DS 組。在置有Transwell 小室的24 孔板的下室中接種HGC-27 胃癌細(xì)胞（3×105個(gè)/600 μL），在上室中分別接種各組巨噬細(xì)胞（M0組、M0DS 組、M2 組和M2DS 組）1×105個(gè)/500 μL。待上下小室內(nèi)細(xì)胞貼壁后共培養(yǎng)24 h，取出小室，用PBS 清洗后晾干，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，用棉簽輕柔擦去小室內(nèi)未穿過小室膜的殘留細(xì)胞。用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，流水下沖洗干凈后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取5～10 個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，以此反映各組巨噬細(xì)胞的趨化能力。

1.6 DS 對(duì)巨噬細(xì)胞（M0 和M2 型）促 進(jìn)HGC-27 胃癌細(xì)胞侵襲和遷移以及侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1.6.1 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測各組巨噬細(xì)胞（M0、M0DS、M2 和M2DS）對(duì)HGC-27 胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5 組：對(duì)照組僅有HGC-27 胃癌細(xì)胞，M0 組、M0DS 組、M2 組和M2DS 組均為HGC-27 胃癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞（誘導(dǎo)獲得，見1.5.1 節(jié)）共培養(yǎng)組。收集對(duì)數(shù)生長期的HGC-27 胃癌細(xì)胞，以2×106個(gè)/孔的密度接種于6 孔板下室，并提前將4 組巨噬細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種于Transwell 小室上室中。待下室中HGC-27 胃癌細(xì)胞貼壁后取出6 孔板，用200 μL槍頭水平劃3 條直線，PBS 漂洗后，在光學(xué)顯微鏡下拍照。將上室放入6 孔板中，共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入無血清培養(yǎng)液。共培養(yǎng)24 h 后，取出6 孔板，棄去上層小室，觀察胃癌細(xì)胞劃痕處細(xì)胞匯合情況，并拍照。細(xì)胞遷移率（%）＝（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積。

1.6.2 Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組巨噬細(xì)胞（M0、M0DS、M2 和M2DS）對(duì)HGC-27 胃 癌細(xì)胞侵襲能力的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置同1.6.1 節(jié)，共設(shè)置5 組。將HGC-27 胃癌細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于24 孔Transwell 小室（鋪設(shè)有預(yù)制膠）中，再將4 組巨噬細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于24 孔板底部。將上室置于24 孔板中，共培養(yǎng)24 h 后，觀察發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)，檢測流程同1.5.3 節(jié)。

1.6.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測共培養(yǎng)后HGC-27 胃癌細(xì)胞中侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

提取HGC-27 胃癌細(xì)胞中的蛋白，蛋白檢測流程同1.4.3 節(jié)。采用的一抗為兔抗人N-cadherin（體積稀 釋比例 為1 ∶500）、Vimentin（體積稀釋比例為1 ∶1 000）和MMP-2（體積稀釋比例為1 ∶500）多克隆抗體以及鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測胃癌及癌旁正常組織中M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤情況

胃癌及癌旁正常組織切片經(jīng)二甲苯溶液脫蠟后，梯度乙醇溶液復(fù)水，枸櫞酸鈉修復(fù)組織抗原，加入3% H2O237℃孵育20 min 后，用含10%山羊血清的封閉液37 ℃封閉30 min；加入一抗兔抗人CD163 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶400）4 ℃孵育過夜，隨后加入二抗[山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）]，二步法孵育。DAB 染色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。CD163 陽性細(xì)胞數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)參閱參考文獻(xiàn)[11]提供的實(shí)驗(yàn)方法：在光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為200 倍）觀察染色結(jié)果，每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)不重疊的區(qū)域，收集圖像并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為該張切片的陽性細(xì)胞數(shù)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以34 例胃癌組織染色結(jié)果的中位數(shù)，將34 例胃癌患者分為CD163 高表達(dá)組（＞322 個(gè)/200 倍視野下）和低表達(dá)組（322 個(gè)/200 倍視野下）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以表示。臨床病理特征分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。2 組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Turkey-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖1A），單核細(xì)胞THP-1 呈懸浮生長，外形為圓形且規(guī)則，細(xì)胞膜透亮且折光性良好。經(jīng)PMA 誘導(dǎo)24 h 后，THP-1 細(xì)胞開始貼壁生長，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形或有突起，提示已分化為M0 巨噬細(xì)胞（M0 組）。M0DS 組（PMA 誘導(dǎo)12 h 時(shí)再加入終濃度為0.3%的DS 繼續(xù)誘導(dǎo)12 h）細(xì)胞雖然仍貼壁生長，但是部分細(xì)胞膜仍透亮，提示細(xì)胞貼壁不完全，并且與M0 組細(xì)胞相比細(xì)胞體積較小。用IL-4 和IL-13 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)M0 巨噬細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞變?yōu)榧?xì)長梭形且形態(tài)多樣，提示M0 巨噬細(xì)胞極化為M2 型巨噬細(xì)胞（M2 組）。采用IL-4 和IL-13 繼續(xù)干預(yù)M0 巨噬細(xì)胞的同時(shí)，加入終濃度為0.3%的DS，即為M2DS 組，M2DS 組中的巨噬細(xì)胞僅貼壁，細(xì)胞突起較少，無M2 型巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征，與M0 巨噬細(xì)胞相似。

應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光法檢測誘導(dǎo)是否成功。結(jié)果（圖1B）顯示，M0 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68 在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206 表達(dá)于細(xì)胞膜上，并且大部分細(xì)胞均有表達(dá)。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖1C）顯示，THP-1 單核細(xì)胞基本不表達(dá)CD163，M0 巨噬細(xì)胞中的CD163 表達(dá)量低于M2 型巨噬細(xì)胞，上述結(jié)果表明M2 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

Fig.1 The morphology of M0-type and M2-type macrophages and dextran sulfate (DS)-treated M0-type and M2-type macrophages was observed under an inverted microscope (A,×400),and the expressions of macrophage surface markers (CD68 and CD206) were detected by immunocytofluorescence (B: fluorescent staining,×400) and Western blotting (C),respectively.THP-1 group: THP-1 cells were not treated with any drugs;M0 group: THP-1 cells were treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA);M0DS group: THP-1 cells were treated with PMA and DS;M2 group: M0-type macrophages were treated with PMA combined with interleukin-4 (IL-4) and IL-13;M2DS group: M0-type macrophages were treated with PMA combined with IL-4,IL-13 and DS.The expressions of M0-type macrophages surface marker CD68 and M2-type macrophage surface marker CD206 were detected by immunocytofluorescence.Western blotting was used to detect the expression levels of CD163 in THP-1 cells,M0-type macrophages and M2-type macrophages.圖1 倒置光學(xué)顯微鏡下觀察M0 和M2 型巨噬細(xì)胞以及DS 處理后M0 和M2 型巨噬細(xì)胞的形態(tài)（A：×400），分別采用免疫細(xì)胞熒光法（B：熒光染色×400）和蛋白質(zhì)印跡法（C）檢測巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況

2.2 DS 可抑制M2 型巨噬細(xì)胞極化

為檢測DS 對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞極化的影響，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163 和CD206 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果（圖2）顯 示，M0 組 和M0DS 組細(xì)胞 中CD163 和CD206 蛋白表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；M2 組細(xì)胞中CD163 和CD206 蛋白的表達(dá)水平均高 于M0DS 組（P＜0.001 和P＜0.01）；M2DS 組中CD163 和CD206 蛋白的表達(dá)水平均較M2 組明顯下調(diào)（P＜0.001 和P＜0.05）。

2.3 DS 抑制M2 型巨噬細(xì)胞的趨化募集能力

采用Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測巨噬細(xì)胞響應(yīng)胃癌細(xì)胞的趨化募集能力。結(jié)果（圖3）顯示，M2 組中穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)為（646.1±116.5）個(gè)，較M0 組的（299±103.8）個(gè)、M0DS 組的（113.6±31.94）個(gè)和M2DS 組的（34.1±15.42）個(gè)均明顯增多（P均＜0.001），M0DS 組中發(fā)生遷移的巨噬細(xì)胞數(shù)較M0 組明顯減少（P＜0.001），M2DS 組中發(fā)生遷移的巨噬細(xì)胞數(shù)較M2 組明顯減少（P＜0.001）。

Fig.3 Trans well assay was used to detect the chemotaxis and recruitment abilities of macrophages cocultured with HGC-27 cells (crystal violet staining,×200).M0 group: THP-1 cells were treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA);M0DS group: THP-1 cells were treated with PMA and DS;M2 group: M0-type macrophages were treated with PMA combined with interleukin-4 (IL-4) and IL-13;M2DS group:M0-type macrophages were treated with PMA combined with IL-4,IL-13 and DS.***P＜0.001,vs M2 group;△△△P＜0.001,vs M0 group (n=3).圖3 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測巨噬細(xì)胞響應(yīng)HGC-27 胃癌細(xì)胞的趨化募集能力

2.4 DS 干預(yù)巨噬細(xì)胞極化后對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組巨噬細(xì)胞對(duì)HGC-27胃癌細(xì)胞橫向遷移能力的影響。結(jié)果（圖4A）顯示，對(duì)照組（僅有HGC-27 胃癌細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)24 h 時(shí)后的劃痕愈合率為（23.33±4.04）%，而與M0 型巨噬細(xì)胞（M0 組）和M2 型巨噬細(xì)胞（M2組）共培養(yǎng)后的HGC-27 胃癌細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（54.33±5.89）% 和（79.00±7.55）%，M0 組和M2 組HGC-27 胃癌細(xì)胞的遷移能力均較對(duì)照組明顯提高（P＜0.01 和P＜0.001），表明M0 和M2 型巨噬細(xì)胞均可促進(jìn)HGC-27 胃癌細(xì)胞的遷移能力；與M0DS 或M2DS 組巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，HGC-27 胃癌細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（48.00±3.00）% 和（56.00±5.29）%，M0DS 組和M2DS 組HGC-27 胃癌細(xì)胞的遷移能力均有明顯下降（P＜0.05 和P＜0.001），表明DS 能夠明顯抑制M0 和M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)HGC-27 胃癌細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用。

采用Transwell 小室侵襲檢測各組巨噬細(xì)胞對(duì)HGC-27 胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果（圖4B）顯示，對(duì)照組中穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)為（93.8±12.81）個(gè)，HGC-27 胃癌細(xì)胞與M0 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)為（92.20±10.43）個(gè)，與M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)為（157.80±20.07）個(gè)，與M0DS 組共培養(yǎng)后穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)為（29.20±9.01）個(gè)，與M2DS 組巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)為（60.00±10.65）個(gè)；與對(duì)照組相比，HGC-27 胃癌細(xì)胞與M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，其侵襲能力明顯提高（P＜0.001），而與M0DS 組和M2DS 組細(xì)胞共培養(yǎng)后，其侵襲能力明顯受抑（P均＜0.001）。上述結(jié)果表明，DS 可以抑制M0 和M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的趨化吸引作用。

Fig.4 The invasion (A) and migration (B) abilities of HGC-27cells after co-culture with M0-type and M2-type macrophages and DS-treated M0-type and M2-type macrophages were detected by woundhealing assay (×40) and Transwell assay (crystal violet staining,×400),respectively.Control group: HGC-27 cells;M0 group: THP-1 cells treated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA);M0DS group: THP-1 cells treated with PMA and DS;M2 group: M0-type macrophages treated with PMA combined with interleukin-4 (IL-4) and IL-13;M2DS group: M0-type macrophages treated with PMA combined with IL-4,IL-13 and DS.**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group;△P＜0.05,△△△P＜0.001,vs M0 group;▲▲▲P＜0.001,vs M2 group (n=3).圖4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（A）和Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)（B）檢測巨噬細(xì)胞對(duì)HGC-27 胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

2.5 DS 干預(yù)巨噬細(xì)胞極化后對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測共培養(yǎng)后的HGC-27 胃癌細(xì)胞中侵襲和遷移相關(guān)蛋白N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 的表達(dá)情況。結(jié)果（圖5）顯示，與M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，HGC-27 胃癌細(xì)胞中N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 蛋白的表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P＜0.001 和P＜0.01）；而與M2DS 組巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，HGC-27 胃癌細(xì)胞 中N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 的表達(dá)水平均較M2 組明顯下調(diào)（P＜0.001 和P＜0.01）。

Fig.6 The infiltration degree of M2-type macrophages in 34 cases of gastric cancer tissues (GT) and the paracancerous tissues (PT) were detected by immunohistochemistry (DAB staining).**P＜0.01.圖6 免疫組織化學(xué)法檢測34 例胃癌組織及癌旁正常組織中M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤情況

表1 胃癌組織中CD163 蛋白的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 The relationship between CD163 expression and the clinicopathological characteristics in gastric cancer tissues[n (%)]

2.6 M2 型巨噬細(xì)胞在胃癌及正常胃黏膜組織中的浸潤情況

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果（圖6）顯示，M2 型巨噬細(xì)胞為形態(tài)不規(guī)則有突起的棕黃色細(xì)胞，定位于腫瘤間質(zhì)中；CD163 主要表達(dá)于M2 型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。胃癌組織間質(zhì)中M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤程度[（365±198）個(gè)]明顯高于癌旁正常組織[（167±93）個(gè)]（P＜0.01）。

2.7 胃癌組織中CD163 蛋白的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

胃癌組織中CD163 蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤浸潤深度以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯相關(guān)性（P均＞0.05），但與胃癌的分化程度和臨床分期有關(guān)（P均＜0.05）。

3 討論

世界范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率和致死率均很高[1]。胃癌的發(fā)生和發(fā)展不僅取決于癌細(xì)胞自身，也與腫瘤微環(huán)境的生理狀態(tài)密切相關(guān)。越來越多的研究表明，胃癌微環(huán)境中的免疫細(xì)胞尤其是數(shù)量最多的M2 型巨噬細(xì)胞與胃癌細(xì)胞之間存在相互調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展[12-14]。有研究提示，腫瘤細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子或趨化因子以招募外周血和組織中駐留的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其極化為M2 型巨噬細(xì)胞；M2 型巨噬細(xì)胞可以通過抑制炎性反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用[15-16]。因此，本研究以M2 型巨噬細(xì)胞作為切入點(diǎn)，為探索M2 型巨噬細(xì)胞在抗腫瘤中的作用提供理論依據(jù)。

CD206和CD163是M2型巨噬細(xì)胞的2種表面標(biāo)志物。TARIQ 等[17]的研究顯示，用吉非替尼處理已經(jīng)IL-13 處理的M2 型巨噬細(xì)胞72 h后，M2 型巨噬細(xì)胞中CD206 和CD163 蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明吉非替尼可有效抑制IL-13 誘導(dǎo)的M2 型巨噬細(xì)胞的極化，因此M2型巨噬細(xì)胞中CD206 和CD163 蛋白的表達(dá)下調(diào)表明M2 型巨噬細(xì)胞的極化受到抑制。本課題組的前期研究證實(shí)，0.3% DS 是可以對(duì)胃癌細(xì)胞發(fā)揮作用的最低濃度，并且對(duì)M0 型和M2 型巨噬細(xì)胞的活性均無影響，對(duì)肝腎功能也無顯著毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞誘導(dǎo)成M0 巨噬細(xì)胞過程中加入DS 后，細(xì)胞不易貼壁且細(xì)胞體積變?。辉贛2 型巨噬細(xì)胞極化過程中加入DS 后，M2型巨噬細(xì)胞的形態(tài)不再呈現(xiàn)細(xì)長或梭形的多樣化特征；蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)DS 處理后，M2 型巨噬細(xì)胞（M2DS）中CD163 和CD206蛋白的表達(dá)水平顯著下降，表明DS 在M2 型巨噬細(xì)胞的極化過程中不僅影響其體積和細(xì)胞形態(tài)，還抑制M2 型巨噬細(xì)胞的極化。然而，DS抑制M2 型巨噬細(xì)胞極化所涉及的具體分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。

胃癌細(xì)胞有招募單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞進(jìn)入胃癌微環(huán)境的能力。巨噬細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境后可極化為M2 型巨噬細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮促癌作用[18]，而抑制胃癌細(xì)胞對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞的招募有助于抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。為檢測胃癌細(xì)胞對(duì)DS 干預(yù)后巨噬細(xì)胞募集趨化能力的影響，本研究進(jìn)一步構(gòu)建體外巨噬細(xì)胞與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細(xì)胞響應(yīng)胃癌細(xì)胞的趨化募集能力強(qiáng)于M0 巨噬細(xì)胞，而DS 干預(yù)后的M2 型巨噬細(xì)胞的趨化募集能力明顯減弱。這部分結(jié)果表明，DS 可能通過干預(yù)M2 型巨噬細(xì)胞的極化過程，阻止M0 巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞極化，從而降低M2 型巨噬細(xì)胞中CD206 和CD163 蛋白的表達(dá)水平，繼而降低M2 型巨噬細(xì)胞的趨化募集能力，即抑制其向胃癌細(xì)胞移動(dòng)。目前針對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的靶向治療措施包括巨噬細(xì)胞極化重編程、耗竭性治療、阻斷募集以及靶向M2 型巨噬細(xì)胞釋放的生成因子等[7,14]。本研究結(jié)果表明，DS 對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞的影響是多方面的，既能抑制其極化過程，又能削弱其募集能力。

研究結(jié)果表明，M2 型巨噬細(xì)胞有促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的潛力[18]。本研究中的劃痕及侵襲實(shí)驗(yàn)均表明，M0 型和M2 型巨噬細(xì)胞均可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的橫向遷移能力，M2 型巨噬細(xì)胞能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲能力；而DS 干預(yù)M2 型巨噬細(xì)胞極化過程后，這種促進(jìn)能力均被弱化。N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，引發(fā)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲性，這在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中尤為重要[19-20]。本研究中的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明，M2 型巨噬細(xì)胞能夠顯著提高胃癌細(xì)胞中N-cadherin、MMP-2 和Vimentin 的表達(dá)水平，而M2DS 組的M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞中這些蛋白的表達(dá)無影響。上述結(jié)果顯示，M2 型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并且增加胃癌細(xì)胞中侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，而DS 能夠抑制M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的促進(jìn)作用以及侵襲和遷移相關(guān)蛋白的上調(diào)作用，表明DS 可以通過調(diào)控M2 型巨噬細(xì)胞間接抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

本研究首先通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示DS 對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞的極化及其與胃癌細(xì)胞相互作用的影響，隨后對(duì)人胃癌組織中M2 型巨噬細(xì)胞的表達(dá)及其意義進(jìn)行研究。免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，胃癌組織中M2 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量較癌旁正常組織中明顯增多；將34 例胃癌組織分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，結(jié)果顯示M2 型巨噬細(xì)胞的浸潤程度與胃癌的分化程度和臨床分期呈正相關(guān)，這與既往張偉杰[21]和ZHU 等[22]報(bào)道的結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果表明，胃癌組織分化程度越低、臨床分期越晚，M2 型巨噬細(xì)胞在胃癌組織中的浸潤程度就越高。上述結(jié)果提示，M2 型巨噬細(xì)胞在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色，因此有望將其作為胃癌治療的靶點(diǎn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究表明DS 能夠干擾M0 巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞的極化，并削弱其趨化募集能力；DS 可以抑制M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的促進(jìn)能力以及侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)；胃癌組織中的M2 型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增多，并且與胃癌組織的分化程度和臨床分期呈正相關(guān)。關(guān)于DS 干預(yù)M2 型巨噬細(xì)胞極化的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，以期為DS 抗腫瘤研究提供更多的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。