重金屬聯(lián)合毒性對蚤類與魚類敏感性的影響及預(yù)測模型研究進展

陳 亮,章文波,霍 正,李陳浩,周霞飛,趙文惠,唐振平*

(1.南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院,湖南 衡陽 421001;2.衡陽市核燃料循環(huán)地質(zhì)理論與技術(shù)重點實驗室,湖南 衡陽 421001;3.稀有金屬礦產(chǎn)開發(fā)與廢物地質(zhì)處置技術(shù)湖南省重點實驗室,湖南 衡陽 421001)

0 引 言

20世紀以來，科學(xué)技術(shù)得到迅猛發(fā)展，在經(jīng)濟與人民生活水平高速提高的過程中，地球環(huán)境質(zhì)量卻迅速下降，人類也付出了慘重的代價。重金屬作為典型的污染物，可導(dǎo)致環(huán)境質(zhì)量急劇惡化，在食物鏈作用下最終危害人體健康，其污染主要來源于工業(yè)方面，特別在礦山開發(fā)、廢氣排放等過程中會對周圍的河流、湖泊環(huán)境產(chǎn)生嚴重影響[1-4]。近年來，世界上針對重金屬污染物的聯(lián)合毒性研究越來越多。蚤類與魚類作為水生生物重要組成部分，被研究者廣泛用于監(jiān)測水環(huán)境污染狀況，E.Perez[5]使用大型蚤評價了Cd與Zn的聯(lián)合毒性，D.B.Kim[6]采用兩種蚤類對廢棄金屬礦山的地表水和土壤生態(tài)毒性進行了評價，李建[7]使用15種常見魚類監(jiān)測長江上游水體的重金屬危害，Z.Torres[8]將湖泊中重金屬污染程度與魚類數(shù)量聯(lián)系在一起評判其對湖泊環(huán)境的影響。為此，本文歸納與總結(jié)國內(nèi)外重金屬對蚤類[9-14]與魚類[15-20]的聯(lián)合毒性實驗研究以及相關(guān)聯(lián)合毒性預(yù)測模型，并指出目前存在的問題與未來發(fā)展趨勢。

1 聯(lián)合毒性作用的表現(xiàn)形式

1939年C.I.Bliss[21]提出研究兩種毒物聯(lián)合作用的毒性并首次提出了協(xié)同作用，拮抗作用，加和作用的劃分。多種重金屬共存于同一環(huán)境中，相互作用機理非常復(fù)雜，研究結(jié)果常出現(xiàn)差異[22]。重金屬復(fù)合污染的效應(yīng)隨重金屬元素性質(zhì)及濃度組合的不同而發(fā)生改變。

1.1 協(xié)同作用

協(xié)同作用是指多種污染物共存時所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)大于各污染物單獨作用的毒性效應(yīng)之和，即某污染物的毒性被其他污染物強化，進而增大了其整體毒性。重金屬復(fù)合污染協(xié)同效應(yīng)對環(huán)境具有較大威脅，這使得研究協(xié)同效應(yīng)對評價環(huán)境安全以及制定相關(guān)環(huán)境保護政策具有重要意義。協(xié)同作用分單向效應(yīng)和雙向效應(yīng)，單向效應(yīng)是指一方促進，另一方被抑制，雙向效應(yīng)則兩者均促進或均抑制。

1.2 拮抗作用

拮抗作用是指多種污染物共存所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)小于各污染物單獨作用的毒性效應(yīng)之和，毒性效應(yīng)被2種或2種以上污染物的交互作用降低。從某種程度上可將位點競爭視作復(fù)合污染產(chǎn)生拮抗作用的直接原因。這些位點包括細胞表面及代謝系統(tǒng)的活性部位和生態(tài)介質(zhì)中的吸附位點，如金屬硫蛋白，特定組織器官上的結(jié)合位點，植物根和土壤中的吸附位點等。

1.3 加和作用

加和作用是指多種污染物共存時所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)等于各污染物單獨作用的毒性效應(yīng)之和。目前有關(guān)重金屬復(fù)合污染表現(xiàn)為加和作用的報道較少，大多數(shù)表現(xiàn)為協(xié)同與拮抗作用。復(fù)合污染的加和效應(yīng)通常有兩種形式，即濃度加和與效應(yīng)加和。

總之，重金屬復(fù)合污染與各種重金屬在環(huán)境中的濃度及其組合關(guān)系、生物的種類、部位和暴露方式等因素密切相關(guān)，表現(xiàn)得極為復(fù)雜，不僅僅是單純的協(xié)同、拮抗或加和作用。重金屬復(fù)合污染的機理也不可能是簡單的各重金屬元素單獨毒害的機理，許多水化學(xué)參數(shù)、生物年齡等因素均可改變重金屬聯(lián)合毒性的影響[23-25]。

2 重金屬聯(lián)合毒性實驗

2.1 收集與培養(yǎng)

關(guān)于水生生物的收集一般分為兩種方式，第一種為野外實驗標本采集，第二種為專業(yè)飼養(yǎng)中心購買。首先，第一種野外實驗標本采集通常為研究者在野外通過手抄網(wǎng)等在河流或湖泊中抓捕部分樣品，再罐裝或盒裝帶回實驗室進一步篩選目標樣品。第二種則是在專業(yè)飼養(yǎng)中心購買，然后在實驗室中按照標準生活環(huán)境進行飼養(yǎng)。由于目前國內(nèi)關(guān)于實驗用水生生物的飼養(yǎng)已成熟，所以類似大型蚤、斑馬魚的收集通常采用第二種購買的方式。如大型蚤的培養(yǎng)通常置于人工恒溫培養(yǎng)箱中，采用大口徑玻璃燒杯，燒杯里裝有曝氣達到48 h以上的自來水，保持一定的pH值、硬度、堿度以及溶解氧，設(shè)定好適宜的環(huán)境溫度與光暗周期，放置一定數(shù)量的大型蚤，以滿足其對空間的需求，每周定時定量進行培養(yǎng)水的更換以及食物喂養(yǎng)，食物喂養(yǎng)可以選擇合適的藻類或魚食。

2.2 實驗方案

重金屬聯(lián)合毒性實驗主要為三個部分組成：1)預(yù)實驗，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果獲得無致死濃度與最大致死濃度。2)正式實驗，包括單一重金屬毒性實驗與聯(lián)合重金屬毒性實驗，聯(lián)合毒性實驗的實驗方案可分為四類：(1)常見的實驗設(shè)計是簡單地改變金屬的絕對濃度，同時保持一個恒定的金屬比例(如保持ρ(Cu)∶ρ(Zn)=1∶10)。(2)保持恒定的效應(yīng)比(如Cu LC25+Zn LC25)。(3)系統(tǒng)地改變金屬的效應(yīng)比，使之產(chǎn)生一個恒定的總效應(yīng)水平(如Cu LC25+Zn LC75，Cu LC50+Zn LC50，產(chǎn)生的總名義效應(yīng)水平為100%的死亡率)。(4)可采用類似于化學(xué)滴定的設(shè)計，即在含有一種或多種其他試劑的溶液中依次增加一種試劑的量，以確定中間反應(yīng)和滴定終點。3)實驗結(jié)果討論，根據(jù)單一重金屬的毒性與聯(lián)合重金屬的毒性結(jié)果比較，分析聯(lián)合作用效應(yīng)與聯(lián)合作用機制。

2.3 重金屬聯(lián)合毒性具體實驗

2.3.1 重金屬聯(lián)合毒性對大型蚤的作用

蚤類作為常見的水生生物，首先其位于食物鏈的底端，研究重金屬對蚤類的影響可引申出重金屬對人類身體健康的影響程度，其次蚤類能成為研究環(huán)境污染的重要指標，也與其對環(huán)境質(zhì)量的敏感性有關(guān)，因此蚤類被廣泛運用于毒理學(xué)和生態(tài)風(fēng)險評估。其中大型蚤是一種小型的蜉蝣甲殼類動物，長度大約為0.2～5 mm，在河流、湖泊中廣泛分布。由于其較短的生活周期和良好的繁殖能力，在國際上被公認為標準受試生物。國外對大型蚤的毒理學(xué)研究已非常成熟，1972年美國環(huán)保局就制定了大型蚤的毒性試驗標準方法[26]，1982年E.N.Attar[27]等研究了大型蚤暴露于Zn和Cd中的單一及聯(lián)合毒性效應(yīng)，獲得該生物暴露于Zn和Cd中36、48、60、72和96 h的劑量-死亡率曲線。2006年J.R.Shaw[28]等結(jié)合了四種蚤類進行了48 h急性毒性實驗，逐個呈現(xiàn)Zn和Cd的影響，以確定致死效應(yīng)濃度并用于推導(dǎo)一系列金屬組合所產(chǎn)生的混合效應(yīng)。J.S.Meyer[29]等以大型蚤為實驗對象，將其暴露于Cd、Cu和Zn的二元或三元混合物中進行急性試驗，在單一毒性實驗中發(fā)現(xiàn)Cd、Cu和Zn的半數(shù)抑制濃度EC50值分別為13.5 μg/L、103 μg/L與696 μg/L，其屬毒性降序為Cd>Cu>Zn。聯(lián)合毒性實驗中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用產(chǎn)生的毒性與其產(chǎn)生毒性的機制具有很強關(guān)聯(lián)性。Cu-Zn急性毒性的主導(dǎo)過程為金屬與金屬在暴露水中結(jié)合溶解有機物(dissolved organic matter,DOM)的競爭，競爭將導(dǎo)致暴露水中Cu2+或Zn2+濃度增加，這造成生物可利用Cu、Zn濃度升高，毒性增強表現(xiàn)為協(xié)同作用。Cd-Cu、Cd-Zn在一定程度均表現(xiàn)了一定的拮抗作用，這是因為其毒性的主導(dǎo)過程為金屬與金屬結(jié)合生物配體(bio-ligand,BL)的競爭。只要Cu保持在亞致死濃度，Cd導(dǎo)致的死亡率就會下降，因為毒性更強的Cd越來越被毒性較小的Cu阻止與BL結(jié)合，從而總體的毒性降低表現(xiàn)為拮抗作用。但是當(dāng)Cu達到單一Cu的半數(shù)抑制濃度EC50時，死亡率開始增加，因為此時Cu也開始產(chǎn)生致死的毒性，導(dǎo)致總體的毒性增加表現(xiàn)為協(xié)同作用。Cd-Zn產(chǎn)生的毒性也是同樣的主導(dǎo)過程，結(jié)果與Cd-Cu一致。E.M.Traudt[30]等研究了Ni、Cd、Cu、Zn對大型蚤的單一與二元聯(lián)合的急性毒性。其方法為通過一種金屬的濃度保持不變，而另一種金屬的濃度通過一系列從非致死濃度到致死濃度不等的變化，然后觀察毒性狀況。根據(jù)個別金屬毒性試驗的半數(shù)抑制濃度EC50值，Ni的毒性最小，其次是Zn、Cu和Cd，毒性依次遞增。在聯(lián)合毒性實驗中，Ni-Cd二元混合作用，當(dāng)Cd的濃度保持不變，Ni濃度增加，產(chǎn)生抑制現(xiàn)象，甚至在某些情況下完全消除初始Cd的毒性。例如0.1 mg/L初始情況下，Ni質(zhì)量濃度很低幾乎沒有，此時的死亡率接近于100%，毒性只有Cd引起，隨著Ni質(zhì)量濃度的增加，在大約0.5 mg/L時，死亡率逐漸下降到5%的最低水平，說明Ni對Cd毒性有很大的保護作用。然而，當(dāng)Ni濃度高到足以引起Ni誘導(dǎo)的毒性時，死亡率增加，這些結(jié)果與Zn對大型蚤的Cd毒性保護作用類似。Cu和Ni的每一種二元混合物產(chǎn)生的毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用。此現(xiàn)象解釋為金屬之間結(jié)合DOM的競爭機制。Ni和Zn有相似的毒性，在Ni濃度隨著Zn濃度的增加而保持不變的混合物中，混合物毒性均表現(xiàn)為拮抗作用。

國內(nèi)關(guān)于大型蚤的研究也逐漸發(fā)展起來，1991年我國制定了大型蚤急性毒性測定方法[31]，董曉曉等[32]以靜水生物測試法研究了Cu、Cd和Se對大型蚤的單一及聯(lián)合毒性效應(yīng)，并采用水生毒理聯(lián)合毒性相加指數(shù)法[33]對其聯(lián)合毒性效應(yīng)進行了評價。許永香等[34]探討Se、Cd、Zn共存時的毒性變化機理，結(jié)果表明,除了Cd和Zn的毒性比1∶1和質(zhì)量濃度比1∶1情況下表現(xiàn)為協(xié)同作用外,其余均為拮抗作用。這些可表明大型蚤以其對環(huán)境的良好敏感性成為了分析環(huán)境污染程度的重要指標。丁嬋娟[35]以重金屬Cu、Pb和Zn為實驗毒物，采用靜水暴露方式，研究了其對大型蚤的單一與聯(lián)合毒性。單一毒性實驗結(jié)果表明不同毒物對大型蚤的的毒性強弱程度有所差異，Cu、Pb和Zn的24 h半數(shù)致死濃度LC50分別為0.123 mg/L、2.392 mg/L和4.084 mg/L，48 h半數(shù)致死濃度LC50分別為0.102 mg/L、1.136 mg/L和2.732 mg/L。由此判斷，三種重金屬毒性大小依次為：Cu>Pb>Zn。在聯(lián)合毒性實驗中，按照毒性比1∶1和質(zhì)量濃度比1∶1兩種不同濃度配比方式，進行兩兩以及三者聯(lián)合實驗。實驗結(jié)果表明：無論是毒性比1∶1還是質(zhì)量濃度比1∶1，Cu-Zn、Cu-Pb和Cu-Pb-Zn三者的聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用，而Pb-Zn的聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為拮抗作用。

2.3.2 重金屬聯(lián)合毒性對魚的作用

目前人們對于許多化學(xué)物的單一毒性已有較多了解，但是對于人類環(huán)境中實際存在多種污染物的聯(lián)合毒性作用及其機理則認識的還不夠深入。兩種或多種化學(xué)物同時作用于生物體時，往往會引起與單一毒物作用完全不同的毒性反應(yīng)。魚類是河流、湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，通過對該生物毒性實驗?zāi)軌虺浞煮w現(xiàn)其生存環(huán)境的危害狀況。例如斑馬魚因為和人類基因有著高度的相似性，其實驗結(jié)果大多數(shù)情況下適用于人體，并且容易飼養(yǎng)，因此被廣泛用于水質(zhì)環(huán)境的檢測。

魚類因其在水生生物中特殊的組成有著重要的研究價值，國外對于魚類毒性實驗的目標生物非常多，B.S.Khangarot[15]等以硬骨魚為實驗對象，研究了Ni、Zn與Cu的聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)其各重金屬48 h半數(shù)致死濃度LC50，Zn為75 mg/L、Ni為37 mg/L以及Cu為2.5 mg/L。在Zn-Ni、Ni-Cu與Zn-Ni-Cu三者的聯(lián)合作用中，毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用。單一重金屬混合后對魚類的毒理學(xué)危害更加嚴重。C.Mebane[16]等研究了包括魚類以及無脊椎動物在Cd、Pb和Zn聯(lián)合作用下的毒性狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Cd-Zn的情況下，無脊椎動物的最低EC50s至少比魚類大一個數(shù)量級。鱒魚對Pb和Zn的毒性抗性隨魚體大小增加而下降。金屬混合物的反應(yīng)是復(fù)雜的，三種金屬的毒性在濃度添加基礎(chǔ)上均表現(xiàn)為拮抗作用。N.R.Lynch[17]等對鰷魚進行了標準96 h毒性試驗，包括單一金屬和二元金屬混合物，以評價二元金屬聯(lián)合的毒性作用，實驗終點為96 h累積的死亡率。實驗遵循固定濃度比例設(shè)計，分析金屬混合物協(xié)同與拮抗作用?；诔醪綔y試結(jié)果，單一金屬實驗濃度從0%至100%死亡率范圍內(nèi)選擇，聯(lián)合金屬實驗中Cu、Zn、Ni的金屬質(zhì)量濃度分別為25 μg/L至400 μg/L、50 μg/L至800 μg/L、250 μg/L至2 000 μg/L。每個金屬濃度和對照各重復(fù)三次，每個重復(fù)試驗包含10條幼魚。單一重金屬情況下，Cu、Zn與Ni的96 h半數(shù)致死濃度LC50值分別為125 μg/L、821 μg/L和3 920 μg/L，總體而言，其死亡率隨著金屬濃度的增加而增加。在相似的濃度下，由個別重金屬引起的總死亡率低于由混合重金屬引起的總死亡率。例如，在單獨2A濃度Cu和2B濃度Zn下，總死亡率為23%，其中20%歸因于Cu，3%歸因于Zn，但這一總死亡率低于二者混合后產(chǎn)生的60%死亡率。同樣，對于Cu和Ni，總死亡率由單獨2A濃度Cu和2C濃度Ni是21%，這低于其暴露在Cu+Ni混合物類似濃度的97%死亡率。同樣情況也發(fā)生在Ni-Zn的混合毒性實驗中。這些結(jié)果均揭示了二元金屬混合物對鰷魚的毒性為協(xié)同作用。

國內(nèi)對于魚類的重金屬聯(lián)合毒性實驗研究也很多，王銀秋等[36]以鯽魚為受試生物，以致死率為指標研究了不同重金屬Cd、Zn、Pb對魚類的急性毒性。應(yīng)用相加指數(shù)法進行Cd、Zn、Pb的聯(lián)合毒性研究，其結(jié)果表明：Cd與Pb、Cd與Zn的聯(lián)合毒性具有明顯的協(xié)同作用，而Pb與Zn結(jié)果相反出現(xiàn)了較強的拮抗作用。趙巖等[37]采用靜水生物測試法研究了Cu、Cd和Cr等重金屬對孔雀魚的單一與聯(lián)合毒性效應(yīng)。通過單一毒性試驗結(jié)果得到其不同暴露時間的半數(shù)致死濃度LC50，3種重金屬離子對孔雀魚均為高毒性,毒性大小為Cu>Cd>Cr。通過聯(lián)合毒性實驗結(jié)果得到，當(dāng)濃度相同時,Cu-Cd、Cu-Cr、Cd-Cr以及三者共存時的聯(lián)合毒性均為毒性增強的協(xié)同作用。修瑞琴等[38]以斑馬魚為實驗生物,按國際標準組織斑馬魚標準實驗法進行了毒性實驗，采用相加指數(shù)法對As、Cd與Zn的聯(lián)合毒性進行了評價。在完成As、Cd與Zn的單一毒性基礎(chǔ)上，再進行As-Cd、As-Zn與Cd-Zn按毒性比1∶1及質(zhì)量濃度比1∶1的不同配比下二元混合以及三元混合的聯(lián)合毒性實驗。最后通過單一毒性實驗結(jié)果與聯(lián)合毒性實驗結(jié)果的LC50值比較，分析聯(lián)合作用下產(chǎn)生的毒性變化。結(jié)果表明,As-Cd、As-Zn共存時聯(lián)合毒性均為拮抗作用,說明此二者共存互相降低了毒性。而Cd-Zn聯(lián)合毒性結(jié)果中除了毒性比1∶1時，結(jié)果為拮抗作用外均為毒性劇增的協(xié)同作用，Cd的存在增加了Zn的毒性，二者共存時毒性遠遠大于單一毒性和。當(dāng)3種毒物聯(lián)合時其毒性為拮抗作用。

3 聯(lián)合毒性作用的預(yù)測模型

許多理論模型已經(jīng)發(fā)展并應(yīng)用于預(yù)測化學(xué)混合物的行為[39-41]。最常見的模型為濃度加成模型(concentration addition model,CA)與獨立作用模型(independent action model,IA)，二者被用于描述基于單一化學(xué)品作用方式的聯(lián)合毒性。濃度加成模型(CA)假設(shè)化學(xué)品具有相同的作用方式。該模型以濃度為基礎(chǔ)，對作用相似的化學(xué)品毒性進行求和，并按比例反映它們的相對毒性。另外，獨立行動模型(IA)假設(shè)化學(xué)物質(zhì)通過不同的作用方式影響生物體，因此它們的影響在統(tǒng)計上是相互獨立的。

3.1 濃度加成模型(CA)

3.1.1 模型介紹

CA模型的理論原理[42]，不相互作用的化學(xué)物質(zhì)只在效力上不同，可以看作是彼此的稀釋。由于同一種化學(xué)物質(zhì)的不同稀釋度始終符合CA，并將以相同的作用機制運作，因此通常假定不同化學(xué)物質(zhì)的混合物在同樣的分子靶點作用時也適用于CA模型。為了計算使用CA化學(xué)物質(zhì)的聯(lián)合作用效應(yīng)，可通過將混合物中每種化學(xué)物質(zhì)的濃度與其單一物質(zhì)毒性聯(lián)系起來計算稀釋程度，將濃度相加，并計算劑量-反應(yīng)曲線。

濃度加成的概念為假定化學(xué)品具有相同的毒性作用機制，計算公式(1)如下：

(1)

其中：pi表示的是化合物中組分i濃度占混合物濃度的比例，ECx,i是組分i達到x效應(yīng)時的濃度，ECx,mix是多種組分達到x效應(yīng)時的濃度。當(dāng)計算結(jié)果為1時，表明混合物之間的作用為加和作用；小于1時為協(xié)同作用；大于1時為拮抗作用。這個方程式適用于作用相似化學(xué)品毒性總和的預(yù)測。

濃度增加通常被認為是對作用方式相似或作用于相同靶點的化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合毒性的合理預(yù)期。但是僅僅對靶點和作用方式定義是不準確的，因為它們具有劑量依賴性，比如大多數(shù)化學(xué)品在低劑量下有一個靶點或作用方式，而在較高劑量下有其他靶點或作用方式。此外，許多化學(xué)品均不了解其靶點和作用方式。盡管濃度加成模型CA對于已知有相似目標位點的混合物預(yù)測結(jié)果存在不確定性，但是已經(jīng)證明其為一個精確的參考模型。

3.1.2 模型應(yīng)用

T.Schell[43]利用大型蚤的急性和慢性反應(yīng)評估了CA模型對7種田間相關(guān)農(nóng)藥混合物的預(yù)測狀況。當(dāng)使用CA模型預(yù)測作為參考時，農(nóng)藥混合物顯示出很大程度的協(xié)同或拮抗作用。與急性的反應(yīng)變量相比，慢性對CA預(yù)測的偏差更低。此外，相對于只含有少量農(nóng)藥的混合物，CA對復(fù)雜混合物的預(yù)測通常更準確。研究表明，CA模型在很大程度上可以保護農(nóng)藥混合物的風(fēng)險評估，證明其作為默認模型的使用是合理的。M.Junghans[44]研究了作用機制相似的8種除草劑對藻類的復(fù)合毒性時，發(fā)現(xiàn)CA模型的預(yù)測能力更強，IA模型低估了混合物的復(fù)合毒性。

C.Chen[45]采用CA模型測定了五種殺蟲劑(A.Chlorpyrifos、B.Malathion、C.Tri-azophos、D.Fenobucarb和E.Carbosulfan)的四種二元混合物對鯉魚腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性抑制的毒性和聯(lián)合作用類型。單一毒性實驗下發(fā)現(xiàn)暴露96 h可導(dǎo)致鯉魚的亞致死、濃度依賴性降低。未暴露和單獨暴露于溶劑的魚AChE活性沒有顯著差異。AChE的半數(shù)抑制濃度EC50值，五種殺蟲劑的毒性各不相同，依次為:C>A>D>E>B。等劑量二元混合物實驗中，A與C、D混合時，預(yù)測毒性對于觀察的結(jié)果沒有明顯不同，表現(xiàn)為加和作用。相比之下，A與E的預(yù)測混合毒性明顯小于觀察值，表現(xiàn)為拮抗作用。而A與B混合時，預(yù)測毒性高于觀察值，表現(xiàn)為協(xié)同作用。質(zhì)量濃度比1∶1混合實驗中，A與C、E混合時，預(yù)測毒性與觀察毒性相似。A與B、D混合時，實際毒性高于預(yù)測的結(jié)果。預(yù)測結(jié)果顯示CA模型沒有明顯低估任何測試混合物的毒性，因此適合用于生態(tài)風(fēng)險評估。

3.2 獨立作用模型(IA)

3.2.1 模型介紹

IA模型的理論原理[42]，混合物中化學(xué)物質(zhì)在物理、化學(xué)或生物上不相互作用，即它們獨立于彼此。在生物系統(tǒng)中，兩種化學(xué)物質(zhì)分別對應(yīng)兩種不同的單位，首先使用由獨立個體組成的測試系統(tǒng)，然后測量每個個體的二進制響應(yīng)(命中/非命中、移動/不移動、死/活等)。隨著毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)對非致命性終點的重視程度提高，越來越多的試驗測量生長、形態(tài)和行為變化以及繁殖力等漸進終點，它們均是定量的，不符合IA的理論假設(shè)。因此，理論上IA適用性受到很大的約束。然而，實踐中人們發(fā)現(xiàn)它提供了不同靶點或作用方式化學(xué)品混合物的良好預(yù)測。

獨立聯(lián)合行動的概念為假定化學(xué)物是通過不相互聯(lián)系的不同作用機制引起其效應(yīng)的，其計算公式(2)如下：

(2)

式中，cmix表示混合物中各個組分的濃度之和，ci表示混合物達到x%效應(yīng)時組分i的濃度，E(ci)表示組分i獨自作用達到x%效應(yīng)時的濃度。

3.2.2 模型應(yīng)用

T.Nagai[46]研究了多種除草劑對藻類的聯(lián)合毒性，考察了CA、IA模型應(yīng)用于物種敏感性分布(species sensitivity distribution,SSD)計算多種物質(zhì)潛在影響部分的有效性。設(shè)計了兩種混合方式：5種作用方式相似的除草劑混合物和5種作用方式不同的除草劑混合物，分別對應(yīng)于CA和IA模型的假設(shè)。CA和IA應(yīng)用于SSD的預(yù)測能力取決于化學(xué)物質(zhì)的作用方式。模型預(yù)測結(jié)果顯示對于不同作用方式的混合除草劑，IA模型的預(yù)測效果優(yōu)于CA模型，能夠準確的預(yù)測除草劑混合物的聯(lián)合毒性。

吳宗凡等[47]以鹵蟲為受試生物，研究了重金屬與農(nóng)藥二元混合的聯(lián)合毒性。運用CA、IA模型對不同配比混合物的聯(lián)合毒性進行預(yù)測。聯(lián)合毒性結(jié)果表明，Zn-Cd混合物聯(lián)合毒性隨Zn比例的增加而增強。5種不同配比的有機磷農(nóng)藥混合物均表現(xiàn)為加和作用。重金屬與農(nóng)藥混合物則均表現(xiàn)為拮抗作用。模型預(yù)測結(jié)果表明，IA模型能夠很好的預(yù)測重金屬農(nóng)藥混合物的聯(lián)合毒性。王娜[48]以淡水發(fā)光細菌青?；【?Q67)作為測試菌，研究了重金屬、殺菌劑等污染物的聯(lián)合毒性，應(yīng)用CA和IA模型對聯(lián)合毒性進行了預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明IA模型可較準確地預(yù)測混合物毒性，CA模型的預(yù)測結(jié)果偏差明顯。

3.3 兩階段預(yù)測模型(TSP)

3.3.1 模型介紹

許多研究對上述兩種模型的預(yù)測結(jié)果進行了分析，結(jié)果具有一定的可變性[49-50]。濃度加成和獨立作用被認為是非相互作用的競爭模型，但目前這兩種模型均存在局限性，因為實際環(huán)境中的復(fù)合污染物質(zhì)可能并不具有完全相同或完全不同的毒性作用方式。因此，最有用的方法是把這兩個概念視為同等有效的備選方案，并接受它們不同的內(nèi)涵，兩階段預(yù)測模型(two-step prediction,TSP)應(yīng)運而生，相關(guān)研究也開始逐漸開展[51]。此模型優(yōu)點在于同時解決作用機制與作用位點相一致或不一致的兩種計算方式。步驟如下：首先，根據(jù)作用機制或作用位點對化合物進行分類，即相同的混合物劃分為一類，不相同的劃分為另一類。然后，分別應(yīng)用CA和IA模型對其毒性進行評估。計算公式(3)如下：

(3)

式中，E(cmix,mix)代表混合物的聯(lián)合毒性，E(cmix,i)代表混合物中組分i的聯(lián)合毒性，n表示混合體系中的組分總數(shù)。

3.3.2 模型應(yīng)用

A.W.Olmstead[52]以水蚤為實驗?zāi)繕?，研究了從對淡水河流的調(diào)查選擇的9種化學(xué)物質(zhì)(A.Bisphenol A、B.Caffeine、C.C-arbaryl、D.Chlorpyrifos、E.N,N-Diethyl-m-to-luamide、F.Diazinon、G.1,4-Dichloroben-zene、H.Fluoranthene、I.4-Nonylphenol)對生物的毒性作用，最后通過一種結(jié)合了CA與IA的綜合模型來比較其偏差程度，原理與TSP模型一致。每個實驗由50種不同的暴露濃度組成。每個毒性評估的數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為0到100%的范圍，從而使實驗結(jié)果標準化，并允許在所有端點包括壽命減少百分比、生長速度和繁殖力上執(zhí)行相同的濃度-響應(yīng)擬合?；旌先芤旱亩拘允峭ㄟ^結(jié)合濃度加成和獨立聯(lián)合作用的概念來模擬的?；瘜W(xué)品根據(jù)其假定的作用機制被分配。具有相同作用機制的化學(xué)物質(zhì)被分配到相同的盒中。其他化學(xué)物質(zhì)均被假定具有不同的作用機制，并被分配到不同的盒中。盒內(nèi)化學(xué)物的聯(lián)合毒性用濃度加法計算，不同盒內(nèi)化學(xué)物的聯(lián)合毒性用獨立聯(lián)合作用計算。從單一毒性實驗的結(jié)果來看，在評估的濃度下，9種化學(xué)品中有4種(C、D、F、I)評估了蚤類的壽命縮短。4種(A、C、H、I)暴露在低于1 000 μg/L的濃度下，會導(dǎo)致生長速率的降低。3種(A、C、H)降低了繁殖力。在評估的混合物水平范圍內(nèi)，該模型準確地預(yù)測了混合物的毒性。從混合物暴露中得出的預(yù)期損失EL05和EL50值與模型預(yù)測值高度一致。未發(fā)現(xiàn)存活的水蚤的生長或繁殖力的水平反應(yīng)關(guān)系，這些結(jié)果與模型預(yù)測相一致，即水蚤存活的混合物水平不會影響生長速率和繁殖力。

L.Y.Mo[53]研究6種酚類化合物和6種重金屬對青海弧菌Q67的聯(lián)合毒性作用，運用兩階段預(yù)測模型對復(fù)雜組分混合物毒性進行預(yù)測。選擇了六種酚類化合物和六種重金屬作為混合組分。等效濃度比構(gòu)建1種混合物M1，固定濃度比設(shè)計4種混合物M2-M5。在M1-M5中，TSP模型較好地預(yù)測了毒性。相比之下，CA模型高估了毒性，表現(xiàn)為協(xié)同作用，IA模型低估了毒性，表現(xiàn)為拮抗作用。在M1-M5中，與實際混合EC50值相比，TSP模型的預(yù)測誤差(分別為13.9%、17.9%、19.2%、17.3%和15.8%)顯著低于CA模型(均高于30%)和IA模型(分別為20.9%、33.0%、20.6%、21.8%和12.5%)。因此，TSP模型的性能優(yōu)于CA和IA模型。

4 結(jié)論與展望

生態(tài)環(huán)境的保護工作從始至今都是人們重點關(guān)注對象，實際環(huán)境污染情況中重金屬在很少的狀況下會以單元素形式存在，多數(shù)為兩種或多種元素共存，即多種元素形成的聯(lián)合作用。目前人們對單一毒性已有了較多理解，但對環(huán)境中存在的多種污染物聯(lián)合毒性作用及其機理的認識還很膚淺。2種或2種以上化學(xué)物同時作用于生物體時，往往可引起與單一毒物作用完全不同的毒性效應(yīng)，并且聯(lián)合毒性實驗研究是在單一毒性實驗研究基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，其研究結(jié)果更具指導(dǎo)意義。在重金屬毒性預(yù)測方面，可根據(jù)每種重金屬特定的作用方式與作用機制，選取合適的模型預(yù)測。許多水生生物均可幫助人們?nèi)ヌ綄の廴疚飳Νh(huán)境的毒性影響，例如介形類因為其個體微小，數(shù)量種類豐富，分布范圍廣，研究成本低，易于采集和進行實驗室培養(yǎng)等一系列特點，被廣泛運用于急性與慢性毒性實驗，用以監(jiān)測重金屬、環(huán)境污染等，可利用其來監(jiān)測包括地表水、地下水、沉積物、工業(yè)污染物等一系列環(huán)境物質(zhì)中重金屬污染。