低聚木糖對三倍體虹鱒生長、抗氧化能力及腸道炎癥因子基因表達的影響

徐喆，王常安，劉紅柏，韓世成，陸紹霞，馮淇元，3

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 2.南京農業(yè)大學 無錫漁業(yè)學院，江蘇 南京 210000； 3.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306)

三倍體虹鱒Oncorhynchusmykiss具有不育性、生長速度快、飼料系數低等特點，是中國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)中主要的養(yǎng)殖品種。在養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖環(huán)境變化、飼料品質不佳等因素，導致魚體免疫力降低，易感染病原菌，此時，一般可通過施用免疫增強劑等來增強魚體的抗應激、抗感染能力[1]。

低聚木糖(xylooligosaccharide，XOS)，又名木寡糖，是一種功能性聚合糖，由β-(1, 4)-糖苷鍵連接的2～7個D-木糖組成，有效成分是木二糖和木三糖，XOS具有優(yōu)于其他功能性聚合糖的理化性質，如耐高溫、耐酸、抗凍性、無配伍禁忌[2]。近年來，在異育銀鯽Carassiusauratusgibelio、草魚Ctenopharyngodonidella、大菱鲆Scophthalmusmaximus和庫圖擬鯉Rutilusfrisiikutum等試驗中發(fā)現，XOS對機體的生長性能和免疫防御能力均有不同程度的改善[3-6]，也可提高羅非魚Oreochromisniloticus的抗氧化功能和先天免疫反應，維持機體健康生長[7]。Chen等[8]研究發(fā)現，質量濃度為0.1～100 μg/mL的XOS可抑制TNF-α基因的表達和一氧化氮(NO)的產生，有效降低脂多糖(LPS)誘導的炎癥發(fā)生。但總的來說，有關XOS對水產動物的營養(yǎng)生理作用還較為有限，其機制尚不明確。本研究中，通過在三倍體虹鱒基礎飼料中添加不同水平的XOS，以魚體生長、血清與腸道抗氧化能力和腸道炎癥因子基因為指標評價XOS對機體的影響，旨在為三倍體虹鱒功能性添加劑篩選提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用初始體質量為(20.85±0.48)g的三倍體虹鱒幼魚450尾，購自遼寧本溪艾格莫林虹鱒養(yǎng)殖公司。XOS購自河南鶴壁泰新科技有限公司，純度為95%。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的制備 根據魚類自身的營養(yǎng)需求，以魚粉(蒸汽白魚粉，含粗蛋白質66.2%、粗脂肪5.92%)和大豆粕為蛋白源，魚油和磷脂為脂肪源，次粉為主要糖源，配制成基礎飼料作為對照組，飼料配方見表1，基礎飼料中含粗蛋白質40.0%、粗脂肪9.0%。

表1 基礎飼料組成(風干基礎)

②礦物質元素(每kg飼料)：Fe 25 mg,Cu 3 mg, Mn 15 mg, I 0.6 mg, Mg 0.7 g,Zn 65 mg, Co 0.1 mg, Se 0.1 mg。

Note：①Vitamin premix containing(per kg diet) VC, 100 mg; VE, 60 mg; VK3,5 mg; VA, 15 000 IU; VD3, 3 000 IU; VB1,15 mg; VB2, 30 mg; VB6,15 mg; VB12,0.5 mg; nicotinic acid,175 mg；inositol,1 000 mg；biotin,2.5 mg；and calcium pantothenate,50 mg.

②Mineral premix containing(per kg diet) Fe 25 mg, Cu 3 mg, Mn 15 mg， I 0.6 mg, Mg 0.7 g, Zn 65 mg, Co 0.1 mg, and Se 0.1 mg.

在基礎飼料中分別添加不同水平的XOS(0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，均為質量分數，下同)，制成5種試驗飼料。具體方法如下：將飼料原料過0.18 mm的目篩后用鼓式混合機混勻，再將溶于水后的XOS添加到混合原料中攪拌均勻，用小型制粒機擠壓制粒(直徑為1.5 mm)，用烘干機干燥，置于-20 ℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理 將試驗魚在室內循環(huán)水系統中暫養(yǎng)14 d。試驗設5組，每組設3個重復，每個重復30尾，投喂含有不同水平XOS的5種試驗飼料，每日按照魚體質量的3%投喂。養(yǎng)殖環(huán)境：水源為自來水，水溫為12～18 ℃，溶氧>6 mg/L，氨氮<0.1 mg/L，pH為6.5～6.8，飼養(yǎng)時間為56 d。養(yǎng)殖試驗結束后饑餓24 h，測定每組魚的體質量，并計算增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料系數(FCR)等生長指標，計算公式為

WGR=(mt-m0)/m0×100%,

SGR=(lnmt-lnm0)/t×100%,

FCR=mf/(mt-m0)。

其中：mt為終末魚體質量(g)；m0為初始魚體質量(g)；mf為飼料攝入量(g)；t為養(yǎng)殖時間(d)。

1.2.3 血清和腸道抗氧化指標的測定 從每個試驗組隨機取9尾魚(每個重復3尾魚)，用MS-222(0.5 mL/L)麻醉后，使用1.5 mL注射器從尾靜脈采血，4 ℃下靜置30 min后，以12 000 r/min離心15 min，取上清液，置于冰箱(-80 ℃)中保存，用于血清抗氧化指標的測定。

將采集血液后的試驗魚于托盤中解剖，采集腸道樣品，并剔除腸系膜脂肪和腸道內容物。取腸組織0.5 g加入1 mL PBS在冰浴上用勻漿機攪拌，加PBS至5 mL，取2 mL研磨液以10 000 r/min離心15 min，取上清液，置于冰箱(-80 ℃)中保存，用于腸道抗氧化指標的測定。

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)活性和溶菌酶(LZM)含量的測定均使用建成(南京)生物工程研究所的試劑盒測定。

1.2.4 腸道炎癥因子基因表達 試驗選用魯氏耶爾森菌Yersiniaruckeri進行免疫刺激，參考本實驗室馮淇元等[9]對虹鱒的應用結果，根據預試驗得出魯氏耶爾森菌濃度為8.4×106CFU/mL時，可致魚患病且特征明顯，因此，本試驗中通過注射微量病菌誘發(fā)虹鱒的炎癥反應，進行腸道炎癥因子相關基因(IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α和PepT1)表達的測定。

采用“1.2.3節(jié)”中的方法采集試驗魚腸道樣品，置于冰箱(-80 ℃)中保存。將凍存的腸道組織研磨成粉狀，用Trizol法對腸組織中的RNA進行分離、沉淀、洗脫、溶解和保存，使用TaKaRa試劑盒反轉錄cDNA模板并進行實時熒光定量PCR。

1.2.5 引物設計 本試驗中所用引物參考虹鱒IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α和PepT1基因的引物序列[10-13](表2)。

1.3 數據處理

試驗數據以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，并用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加XOS后虹鱒生長性能的變化

從表3可見：飼料中添加XOS對增重率和特定生長率有一定影響，各試驗組增重率和特定生長率隨XOS添加量的增加而提高，當添加量為1.00%時達最高值，且顯著高于對照組(P<0.05)，其余各組無顯著性差異(P>0.05)；飼料系數隨XOS添加量的增加略有降低，未達顯著性水平(P>0.05)。

表2 Real-time PCR目標基因與內參基因引物序列

表3 飼料中添加XOS對虹鱒生長性能的影響

2.2 飼料中添加XOS后虹鱒血清和腸道抗氧化指標的變化

從表4可見：飼料中XOS的添加量對虹鱒血清SOD、LZM活性和MDA含量具有影響，與對照組相比，0.50%、0.75%、1.00%組SOD、LZM活性顯著升高(P<0.05)，1.00%組MDA含量顯著降低(P<0.05)；XOS對CAT活性無顯著性影響(P>0.05)。

表4 飼料中添加XOS對虹鱒血清抗氧化指標的影響

從表5可見：飼料中添加XOS對腸道SOD、CAT和LZM活性具有一定影響，隨XOS添加量的增加，SOD、CAT和LZM活性呈先升高后降低趨勢；XOS添加量為0.75%時，SOD、CAT、LZM活性均顯著高于對照組(P<0.05)；隨XOS添加量的增加，MDA含量有降低趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。

表5 飼料中添加XOS對虹鱒腸道抗氧化指標的影響

2.3 飼料中添加XOS后虹鱒腸道炎癥因子和小肽轉運基因表達量的變化

從圖1可見：飼料中添加XOS對腸道白介素IL-1β、IL-8基因和腫瘤壞死因子TNF-α基因的表達量均有影響；隨XOS添加量的增加，IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對表達量均呈先升高后降低的趨勢，分別在0.75%組、0.50%組和0.75%組達最高值，且均與對照組有顯著性差異(P<0.05)。

標有不同字母者表示同一基因中不同XOS質量分數組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters in same gene are significant differences in different XOS mass fraction groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖1 飼料中添加XOS對虹鱒腸道IL-1β、IL-8和TNF-α基因表達量的影響Fig.1 Effects of dietary xylooligosaccharide supplementation on expression of IL-1β,IL-8 and TNF-α genes in rainbow trout

從圖2可見：飼料中添加不同水平XOS對虹鱒腸道白細胞介素IL-2和小肽轉運載體PepT1基因表達量均有一定影響；IL-2基因表達量在0.25%組達最高值，且顯著高于對照組及其他試驗組(P<0.05)；PepT1基因表達量在0.75%組達最高值，且顯著高于對照組、0.25%組和1.00%組(P<0.05)。

圖2 飼料中添加XOS對虹鱒腸道IL-2和PepT1基因表達量的影響Fig.2 Effects of dietary xylooligosaccharide supplementation on expression of intestinal IL-2 and PepT1 genes in rainbow trout

3 討論

3.1 飼料中添加XOS對虹鱒生長性能的影響

飼料中添加XOS可提高魚體生長性能。有研究表明，與對照組相比，在異育銀鯽飼料中添加質量分數為0.01%的XOS時，可提高其生長性能且消化酶活性最強[14]。本試驗結果也表明，XOS可顯著提高虹鱒的增重率和特定生長率，但對飼料系數無明顯影響。這可能是由于XOS可促進腸道有益菌增殖，并加快腸道蠕動，促進腸道吸收營養(yǎng)物質，從而改善生長性能[15]。

3.2 飼料中添加XOS對虹鱒抗氧化能力和非特異性免疫的影響

3.3 飼料中添加XOS對虹鱒腸道炎癥因子和小肽轉運基因表達量的影響

白細胞介素參與機體免疫反應的表達和調節(jié)，介導T、B細胞活化。IL-1β是由T細胞和巨噬細胞激活后經巨噬細胞產生的一種多效炎癥細胞因子，對淋巴細胞的生長和增殖有直接影響，IL-1β通過刺激效應細胞增強免疫應答反應，是特異性免疫和非特異性免疫反應中重要的細胞因子[23]。IL-2為T細胞生長因子，由IL-1β刺激分泌，通過活化T細胞和巨噬細胞的表達促進免疫反應，并有效控制免疫應答[24-25]。IL-8是典型的促炎癥因子，在白細胞的趨化性和功能中具有重要作用，對恢復感染組織有一定作用[26]。TNF-α由T細胞和巨噬細胞產生，是參與白細胞遷移、增殖分化及凋亡的重要免疫因子，在炎癥反應中刺激免疫細胞并介導免疫應答，具有殺傷或抑制腫瘤細胞的功效[27]。Tafalla等[28]發(fā)現，在虹鱒的肝臟、頭腎和脾臟中IL-1β均為組成性表達。飼料中添加XOS可顯著上調草魚腎臟、脾臟免疫相關基因IL-1β和TNF-α的表達[29]。本試驗結果表明，XOS顯著影響虹鱒腸道炎癥因子相關基因的表達，對IL-1β、IL-2、IL-8和TNF-α基因有先上調后下調的作用，其中，對IL-1β的影響最為明顯。外界刺激能夠誘導IL-1β的表達[30]，這表明魚體在飼喂XOS的免疫初期，炎癥因子刺激各種免疫細胞增殖，隨著XOS添加量的提高，炎癥因子在不同的添加量下達到峰值，這說明XOS能夠作用于免疫防御系統，提高免疫因子的表達量，提高機體的特異性和非特異性免疫力，能對病原菌及病毒的抵御起到一定作用，保護機體健康生長[31]。但是，當XOS含量過高時，則抑制了機體的免疫反應，因此，高水平添加劑不利于保持機體內部的動態(tài)平衡[32]。

小肽轉運載體PepT1主要位于腸道上皮細胞，它是一種完整的膜蛋白載體，主要參與腸道內小肽的跨膜轉運，通過轉運二肽和三肽為機體運輸營養(yǎng)物質，促進動物生長發(fā)育，同時也參與炎癥反應的免疫應答，在炎癥細胞因子通訊中發(fā)揮作用[33-34]。本試驗發(fā)現，PepT1基因隨XOS添加水平的提高呈先升高后降低的趨勢，并以0.75%組為最高，且與對照組有顯著性差異。XOS對于水產動物的作用是通過對腸道有益菌的增殖，進而改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進機體消化吸收營養(yǎng)物質[35]。本試驗飼料中添加低水平的XOS對腸道有益菌的增殖有積極作用，上調了PepT1基因表達量并促進腸道對小肽的吸收，當XOS含量過高時，其發(fā)酵產生的酸性物質降低了pH，腸道pH過低后有益菌無法繁殖，菌群結構平衡被打破，腸道吸收力下降，下調了PepT1基因表達量及對營養(yǎng)物質的吸收[36]。

4 結論

1)飼料中添加低聚木糖(0.75%、1.00%)可顯著提高虹鱒的增重率和特定生長率。

2)0.75%、1.00% 低聚木糖組的抗氧化能力和非特異性免疫能力效果最佳。

3)本試驗條件下，三倍體虹鱒飼料中，低聚木糖的最適添加量為0.75%～1.00%。