脂類(lèi)去除對(duì)赤道外海莖柔魚(yú)軟組織穩(wěn)定同位素的影響

劉娜，劉必林，2，3，4*

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306； 2.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

莖柔魚(yú)Dosidicusgigas廣泛分布于東太平洋，是重要的大洋性經(jīng)濟(jì)頭足類(lèi)之一，其既是東太平洋最重要的捕撈對(duì)象，同時(shí)也在中上層海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色[1]。作為東太平洋最重要的漁業(yè)資源之一，隨著其資源不斷被開(kāi)發(fā)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其關(guān)注度也在不斷攀升。20世紀(jì)90年代以來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)莖柔魚(yú)的年齡、生長(zhǎng)、種群、繁殖、漁場(chǎng)及資源等方面做了大量研究工作[1-5]，但對(duì)莖柔魚(yú)攝食生態(tài)學(xué)研究相對(duì)較少。

在生態(tài)系統(tǒng)研究中，由于構(gòu)成消費(fèi)者組織成分的穩(wěn)定同位素與其食物相關(guān)，故穩(wěn)定同位素已成為一種有效研究生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量流動(dòng)的方法，為研究海洋生物營(yíng)養(yǎng)狀況和遷徙模式提供了重要途徑[6-7]。碳穩(wěn)定同位素比(δ13C)從食物到消費(fèi)者變化較小，但是在基礎(chǔ)的生產(chǎn)者中存在差異，因此，其扮演了碳源的示蹤者角色[8]。氮穩(wěn)定同位素比(δ15N)從食物到消費(fèi)者的營(yíng)養(yǎng)富集度為3.0‰～4.0‰，可用來(lái)代表消費(fèi)者的營(yíng)養(yǎng)級(jí)[8-9]。頭足類(lèi)軟組織中含有較多的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，具有豐富的碳氮元素，是穩(wěn)定同位素分析常用材料，對(duì)這些組織中碳氮穩(wěn)定同位素的分析是研究海洋生物洄游路徑和棲息環(huán)境的重要手段，但是脂類(lèi)的存在會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定同位素測(cè)定產(chǎn)生一些偏差，而由此造成的影響在頭足類(lèi)中的研究較少[10]。另外，生物體不同組織間周轉(zhuǎn)率存在差異，即在消費(fèi)者組織中反映其食物來(lái)源穩(wěn)定同位素值所需的時(shí)間不同，因此，研究穩(wěn)定同位素含量在不同組織中的差異非常重要[11-13]。本研究中，通過(guò)比較去脂前后赤道莖柔魚(yú)軟組織中碳氮穩(wěn)定同位素的差異，從而分析了脂類(lèi)對(duì)軟組織穩(wěn)定同位素含量的影響，旨在為進(jìn)一步開(kāi)展莖柔魚(yú)的攝食生態(tài)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年12月—2018年2月從10個(gè)站位(圖1)共采集莖柔魚(yú)樣品500多尾，隨機(jī)挑取62尾(胴長(zhǎng)為195～324 mm，表1)分別提取60個(gè)胴部肌肉樣品、18個(gè)性腺樣品和54個(gè)消化腺樣品(-17 ℃下冷凍保存)，用于軟組織穩(wěn)定同位素分析，由于性成熟度較低，故性腺樣品收集較少。

表1 樣本基礎(chǔ)信息Tab.1 Sample basic information

圖1 莖柔魚(yú)樣品采集站位Fig.1 Sampling stations of jumbo flying squid Dosidicus gigas

1.2 方法

1.2.1 脂類(lèi)去除 將軟組織樣品用超純水清洗后放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥(-55 ℃，干燥24 h以上)，干燥后的樣品用MM400混合型球磨儀(RetschGmbH，Haan，Germany)研磨1.5 min至粉末；稱(chēng)取樣品粉末200 mg加入12 mL三氯甲烷-甲醇溶液中(體積比為2∶1)浸泡24 h，以4 000 r/min離心3 min，取出上清液；再次加入3 mL三氯甲烷-甲醇溶液中(體積比為2∶1)，震蕩2 min混勻，以4 000 r/min離心3 min,取出上清液，此過(guò)程再重復(fù)一次；最后將取出的上清液樣品放入烘箱中(65 ℃)烘干3 h，烘干后的樣品再次用球磨儀研磨至粉末。

1.2.2 穩(wěn)定同位素的測(cè)定 稱(chēng)取1.0～1.5 mg樣品粉末用鋁箔包被后送入儀器，使用ISOPRIME 100穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(Isoprime Corporation，Cheadle，UK)和Vario ISOTOPE cube元素分析儀(Elementar Analysensysteme GmbH，Hanau，Germany)測(cè)定碳氮穩(wěn)定同位素。計(jì)算公式為

δX=(Rsample/Rstandard-1)×103。

其中：X為13C或15N；R為相應(yīng)的比例，如13C/12C或15N/14N；δ為同位素組成的代名詞，如δ13C、δ15N分別為碳和氮穩(wěn)定同位素相對(duì)于各自標(biāo)準(zhǔn)物的比值，可代表碳氮穩(wěn)定同位素值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)分析去脂前后各軟組織碳氮穩(wěn)定同位素差異，用單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)軟組織間碳氮穩(wěn)定同位素進(jìn)行差異性分析和Post-hoc檢驗(yàn)，利用Origin 9.1軟件進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂類(lèi)對(duì)碳氮穩(wěn)定同位素的影響

配對(duì)t檢驗(yàn)顯示，肌肉、性腺、消化腺3種軟組織中，除消化腺中δ15N去脂前后無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，其余軟組織去脂前后δ13C、δ15N和C/N均存在顯著性差異(P<0.05)(表2，圖2)。

肌肉中，δ13Cafter與δ13Cbefore相比升高0.70‰～1.82‰，平均升高1.13‰；δ15Nafter與δ15Nbefore相比升高0.48‰～1.59‰，平均升高1.02‰；C/Nafter與C/Nbefore相比降低0.11～0.31，平均降低0.21。線性回歸分析表明，δ13Cbefore與δ13Cafter、δ15Nbefore與δ15Nafter、C/Nafter與C/Nbefore間均存在顯著正相關(guān) (P<0.05) (圖3)。

性腺中，δ13Cafter與δ13Cbefore相比升高0.70‰～2.44‰，平均升高1.38‰；δ15Nafter與δ15Nbefore相比升高-0.18‰～2.34‰，平均升高0.41‰；C/Nafter與C/Nbefore相比降低0.21～0.86，平均降低0.43。線性回歸分析表明：δ13Cbefore與 δ13Cafter、C/Nafter與C/Nbefore均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，而δ15Nbefore與δ15Nafter存在顯著正相關(guān)(P<0.05)(圖3)。

消化腺中，δ13Cafter與δ13Cbefore相比升高0.84‰～2.23‰，平均升高1.27‰；δ15Nafter與δ15Nbefore相比升高-0.75‰～0.99‰，平均升高0.39‰；C/Nafter與C/Nbefore相比降低0.20～0.82，平均降低0.37。線性回歸分析表明：δ13Cbefore與δ13Cafter、δ15Nbefore與δ15Nafter均存在顯著正相關(guān) (P<0.05) ，而C/Nafter與C/Nbefore無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)(圖3)。

表2 脂類(lèi)去除前后穩(wěn)定同位素值Tab.2 Stable isotope values before and after lipid removal

2.2 穩(wěn)定同位素組織間差異

3種不同的軟組織間δ13C、δ15N、C/N在脂類(lèi)去除前或去脂后均具有顯著性差異(P<0.05)。不同組織去脂前或去脂后δ13Cbefore依次均為肌肉>消化腺>性腺；去脂前或去脂后δ15Nbefore依次均為肌肉>消化腺>性腺；去脂前C/Nbefore依次為性腺>消化腺>肌肉，去脂后C/Nafter依次為消化腺>性腺>肌肉。去脂后3種組織間碳氮穩(wěn)定同位素有明顯的差異，3種組織的δ13C值范圍相較于δ15N變化范圍較窄(圖4)。Post-hoc檢驗(yàn)結(jié)果顯示，δ13C、δ15N去脂前或去脂后兩兩組織間均有顯著性差異(P<0.05)；C/N值除去脂前肌肉與性腺間、去脂后性腺與消化腺間無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，其余兩

圖3 3種組織脂類(lèi)去除前后穩(wěn)定同位素相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of stable isotopes in three tissues before and after the lipid removal

圖4 脂類(lèi)去除后不同組織δ13C、δ15N營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位圖Fig.4 Trophic ecology of δ13C and δ15N in different tissues after lipid removal

組織間均有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

3.1 脂類(lèi)去除對(duì)碳穩(wěn)定同位素的影響

由于脂類(lèi)中的δ13C含量比蛋白質(zhì)和碳水化合物中的含量小，所以脂類(lèi)含量較高的組織中δ13C含量更低，因此，脂類(lèi)去除之后會(huì)導(dǎo)致δ13C值上升[14-15]。本研究中，去脂后的莖柔魚(yú)肌肉、性腺、消化腺中δ13C均明顯增加，去脂后δ13C在肌肉組織、性腺、消化腺等3種組織中平均分別提升了1.13‰、1.37‰、1.27‰，由此也可推測(cè)，莖柔魚(yú)性腺中脂類(lèi)含量較高，消化腺次之，肌肉中最小。Ruiz-Cooley等[10]對(duì)圓鰭槍烏賊Lollingunculabrevis和普氏槍烏賊Loligopleii研究發(fā)現(xiàn)，去脂后δ13C分別升高了1.6‰和2.7‰，并指出δ13C變化范圍與物種、個(gè)體大小及組織中的脂類(lèi)含量有關(guān)。本研究中δ13C的變化也體現(xiàn)了組織間穩(wěn)定同位素的差異，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。脂類(lèi)的存在導(dǎo)致δ13C測(cè)定值產(chǎn)生偏差，從而影響了對(duì)消費(fèi)者食物來(lái)源的分析，因此，利用穩(wěn)定同位素技術(shù)對(duì)頭足類(lèi)軟組織進(jìn)行食性分析時(shí)應(yīng)先進(jìn)行脂類(lèi)去除。

3.2 脂類(lèi)去除對(duì)氮穩(wěn)定同位素的影響

Bodin等[15]、Yurkowski 等[16]研究表明，使用未去脂樣品的δ15N值計(jì)算莖柔魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)級(jí)將會(huì)偏低，這是因?yàn)橹鞍谆衔锞哂休^低的 δ15N，其被抽提后會(huì)引起樣品中δ15N 升高,因而要盡量使用去脂后的δ15N進(jìn)行分析。本研究中發(fā)現(xiàn)，脂類(lèi)去除后莖柔魚(yú)肌肉、性腺中的δ15N 顯著升高，而消化腺中δ15N 也有上升但并不顯著，δ15N在肌肉、性腺、消化腺等3種組織中平均分別提升了1.02‰、0.41‰、0.39‰，再次證明了不去脂會(huì)影響莖柔魚(yú)營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位的計(jì)算。不同組織器官的營(yíng)養(yǎng)成分和結(jié)構(gòu)不同，從而導(dǎo)致δ15N 值在不同組織器官間存在差異[17-19]，本研究中肌肉、性腺、消化腺δ15N值具有顯著性差異也符合這一結(jié)論。Post等[20]在研究穩(wěn)定同位素技術(shù)是否需要考慮脂類(lèi)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，C/N<3.5 時(shí)不需要進(jìn)行脂類(lèi)的去除。而后又有研究發(fā)現(xiàn)，雖然C/N 值較小(C/N<3.5)，但脂類(lèi)去除后莖柔魚(yú)δ13C升高范圍較大(>0.65‰)，脂類(lèi)含量存在較大差異的組織仍然可能有相近的C/N 值，所以C/N 值可能不適合作為衡量莖柔魚(yú)脂類(lèi)含量的標(biāo)準(zhǔn)[11]。本研究中，肌肉、性腺、消化腺中C/N均小于3.5，但是脂類(lèi)去除后3種組織中δ13C、δ15N均有顯著升高，這與貢藝等[21]對(duì)北太平洋柔魚(yú)肌肉分析結(jié)果一致，故在C/N均小于3.5的條件下仍需進(jìn)行去脂處理。

3.3 不同組織間穩(wěn)定同位素差異

研究表明，生物體不同組織間周轉(zhuǎn)率存在差異[22]，頭足類(lèi)肌肉中穩(wěn)定同位素轉(zhuǎn)化率較慢，一般為幾周或者更長(zhǎng)，因此，肌肉的穩(wěn)定同位素比值僅能反映出機(jī)體幾周或數(shù)月前的攝食情況，而消化腺和性腺中的穩(wěn)定同位素轉(zhuǎn)化率較快，可表征機(jī)體幾天內(nèi)的攝食情況[23-24]，這也是本研究不同組織間穩(wěn)定同位素差異的原因之一。因此，可以根據(jù)不同組織的δ13C、δ15N周轉(zhuǎn)率的差異，從不同時(shí)間尺度來(lái)分析頭足類(lèi)的攝食變化。

本研究中對(duì)莖柔魚(yú)不同組織器官中穩(wěn)定同位素的分析，揭示了δ13C、δ15N 值在不同組織器官的分布特征及脂類(lèi)去除對(duì)穩(wěn)定同位素分析的影響，為穩(wěn)定同位素技術(shù)在頭足類(lèi)生態(tài)學(xué)中的研究供了重要基礎(chǔ)。盡管如此，本研究中也存在不足之處，例如性腺樣本較少且大部分樣品性成熟度較低，樣品覆蓋范圍較小，不同體質(zhì)量大小的樣本個(gè)數(shù)分布不均，個(gè)體大小不同對(duì)其穩(wěn)定同位素的影響仍需后期繼續(xù)研究。在今后的研究中需要進(jìn)一步補(bǔ)充樣品量，進(jìn)而分析軟組織中穩(wěn)定同位素值在性別上的差異等。

4 結(jié)論

1) 脂類(lèi)去除前后δ13C、δ15N、C/N在肌肉、消化腺和性腺等3種軟組織間均具有顯著性差異，消化腺中δ15N除外。

2) 不同組織穩(wěn)定同位素含量比較顯示，脂類(lèi)去除前或去脂后，δ13C與δ15N值均依次為肌肉>消化腺>性腺；C/Nbefore依次為性腺>消化腺>肌肉，C/Nafter依次為消化腺>性腺>肌肉。