基因編輯CRISPR技術(shù)在海洋生物遺傳育種的應(yīng)用進(jìn)展

于笛，遲小妹，，滕煒鳴，謝璽，趙沖，王慶志*

(1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院 大連市海產(chǎn)貝類種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點實驗室，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

基因編輯(gene editing)技術(shù)是指在基因組水平進(jìn)行基因的定點插入/缺失突變、敲除、多位點同時突變和小片段刪除等精確操作技術(shù)。通過對基因編輯技術(shù)的研究，可以幫助人類探索生命本質(zhì)，揭開疾病發(fā)生之謎，尋求疾病預(yù)防與治療的有效途徑[1]?；蚓庉嫷淖畛跫夹g(shù)手段為同源重組介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)(gene targeting)，該技術(shù)雖可以準(zhǔn)確對特定基因進(jìn)行修飾，但在實際操作中存在效率低、耗時長且可能導(dǎo)致基因突變等問題，影響了該技術(shù)的實際應(yīng)用。近些年，基因編輯技術(shù)蓬勃發(fā)展，相繼誕生了包括鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonucleases, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)和規(guī)律成簇短回文序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)等高效基因編輯工具。其中，CRISPR技術(shù)是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)之一。2012年至今，世界已發(fā)表數(shù)千篇關(guān)于CRISPR的文章，該技術(shù)還于2013年和2015年先后被《Science》雜志評為全球十大科技突破之一，于2020年獲得諾貝爾化學(xué)獎。

海洋是人類不斷探索的資源寶庫，海洋中的許多生物如魚、蝦、貝、藻等經(jīng)濟(jì)種類更是人類餐桌上的美味佳肴，然而，隨著過度捕撈、海洋環(huán)境污染等問題日益加劇，海洋生物數(shù)量不斷減少，保護(hù)海洋生物的任務(wù)迫在眉睫，將傳統(tǒng)的正向遺傳學(xué)應(yīng)用于海洋生物遺傳育種研究更是困難重重。

作為時下生命科學(xué)領(lǐng)域最前沿的技術(shù)之一，基因編輯技術(shù)在生物基因功能研究、動植物病害防治及品種改良、遺傳疾病基因治療等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。目前，該技術(shù)已經(jīng)在許多模式生物、重要經(jīng)濟(jì)動植物乃至人類胚胎發(fā)育研究中取得一定突破[2-10]。2020年，基因編輯技術(shù)在淡水養(yǎng)殖魚類中取得突破進(jìn)展，成功培育出生長速度快、肉質(zhì)質(zhì)量高和規(guī)格大的新品系黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco等[11]。近年來，CRISPR等基因編輯技術(shù)應(yīng)用于海洋生物的相關(guān)研究已有一些報道[12-13]，已成功應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行遺傳育種研究的物種有玻璃海鞘Cionaintestinalis[14-15]、海七鰓鰻Petromyzonmarinus[16]、?？鸑ematostellavectensis[17]、海膽Strongylocentrotuspurpuratus[18]、三角褐指藻Phaeodactylumricornutum[19]和大西洋鮭Salmosalar[20-21]等。本文主要綜述了基因編輯技術(shù)的發(fā)展建立、作用機(jī)制及其應(yīng)用現(xiàn)狀，并結(jié)合海洋生物基因功能研究領(lǐng)域的研究進(jìn)展，探討了基因編輯技術(shù)在海洋生物資源保護(hù)與開發(fā)、遺傳育種等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用及發(fā)展前景。

1 ZFN和TALEN技術(shù)

1.1 ZFN

基因編輯本質(zhì)上是利用限制性核酸內(nèi)切酶對生物遺傳序列進(jìn)行修飾，并產(chǎn)生穩(wěn)定的突變型。這里的修飾包括插入/缺失突變、敲除、多位點同時突變和小片段刪除等。然而，由于天然核酸內(nèi)切酶的種類有限，科學(xué)家們迫切希望找到新的基因編輯方法。ZFN是由Kim等[22]成功構(gòu)建的第一種人工核酸酶，目前，該技術(shù)已在多種模式生物中實現(xiàn)了靶基因的敲除或定點修飾[23-26]，并于2005年實現(xiàn)了人類細(xì)胞的基因敲除[27]。由于ZFN對于其作用的靶點DNA序列無特異的對應(yīng)性，該技術(shù)需要通過構(gòu)建龐大的鋅指表達(dá)文庫來篩選出能夠特異識別這些靶點的鋅指蛋白。此外，由于ZFN序列識別的特殊性，目前仍無法設(shè)計出滿足任意一段序列要求的ZFN，也無法確保每個基因都能夠找到適合的ZFN作用靶點[28]。

1.2 TALEN

Moscou等[29]首次提出了一種類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白(TALE)，該蛋白具有特異結(jié)合宿主基因的功能[30]。此后，以TALE為DNA結(jié)合域構(gòu)建的TALENs技術(shù)在多個物種的基因修飾研究中均得到了成功應(yīng)用，該技術(shù)被《Science》雜志評為2012年度十大科學(xué)進(jìn)展之一[31]。TALENs技術(shù)的作用機(jī)制與ZFNs技術(shù)類似，其核心是識別特異DNA序列的TALEs蛋白和核酸內(nèi)切酶FokI。TALEs蛋白是植物病原黃單胞桿菌Xanthomonascampestris進(jìn)入植物細(xì)胞改變基因序列后轉(zhuǎn)錄翻譯分泌的一類類似于真核生物轉(zhuǎn)錄因子的TALE蛋白家族，該家族首次發(fā)現(xiàn)的為AvrBs3[32]，由12個或以上特異性識別DNA序列的串聯(lián)“蛋白模塊”和N′端、C′端兩側(cè)的序列組成。每個“蛋白模塊”由34個氨基酸組成，其中，第12和第13位點是靶向識別的關(guān)鍵位置，即重復(fù)可變的雙連氨基酸(repeat variant diresidue，RVD)位點。TALEs蛋白上的每個RVDs只能識別1個堿基(A、G、C、T)，即NI識別A，NG識別T，NN識別G或者A，HD識別C[33-35]。此外，在構(gòu)建模塊時，研究人員發(fā)現(xiàn)，NK識別G的特異性比NN要好，但由于NK活性較低，更傾向于使用NN[29,36]。由于不同物種基因組大小不同，選擇的特異序列長度也不同，對于哺乳動物的基因修飾，識別靶點一般選取16～20 bp的DNA序列。

TALEs蛋白是識別靶基因，而FokI的作用則是切割DNA。FokI是一種核酸內(nèi)切酶，必須形成二聚體才具有活性，所以大大減少了隨機(jī)酶切的概率。TALEs蛋白和FokI連接成重組蛋白表達(dá)1個重組核酸酶，識別靶點核酸序列，發(fā)揮內(nèi)切酶的活性，從而切斷目的基因，實現(xiàn)基因敲除。然而這些方法在操作上技術(shù)難度大、耗時費(fèi)力、費(fèi)用昂貴且效率并不高[37-38]。

2 CRISPR編輯技術(shù)

CRISPR是細(xì)菌和古細(xì)菌自身的一種獲得性免疫系統(tǒng)，通過特異性RNA介導(dǎo)相應(yīng)的內(nèi)源蛋白對侵入DNA進(jìn)行特異性切割降解。1987年，日本學(xué)者Ishino等[39]在對大腸桿菌EscherichiacoliK12克隆時發(fā)現(xiàn)了一系列相互間隔的短回文序列，并于2002年被正式命名為規(guī)律成簇短回文序列。CRISPR系統(tǒng)主要包括一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效應(yīng)蛋白(如Cas9、Cpf1等)的編碼基因和一段成簇的短回文序列組成，CRISPR系統(tǒng)因組分不同可以分成2類5型共16種亞型[40-41]。1類包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，2類包括Ⅱ型和Ⅴ型。前3種發(fā)揮功能時需要利用多個效應(yīng)蛋白復(fù)合物干擾靶基因，而另兩種則只需單一的效應(yīng)蛋白干擾靶基因即可發(fā)揮作用。

2.1 CRISPR/Cas

目前，研究最深入的CRISPR系統(tǒng)為CRISPR/Cas9(CRISPR associated gene 9)。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，存在于大約48%的細(xì)菌和95%的古細(xì)菌中，可提供序列特異性保護(hù)以抵抗外來的DNA甚至RNA。2012年，Jinek等[42]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的crRNA和tracrRNA改造成一條單導(dǎo)向RNA(single-guide RNA, sgRNA)，它能夠指導(dǎo)Cas9蛋白對指定DNA序列進(jìn)行靶向斷裂，這為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2013年，麻省理工學(xué)院Mail等[43]和哈佛大學(xué)Li等[44]首次實現(xiàn)了CRISPR技術(shù)在真核生物基因定點突變領(lǐng)域的突破，由此開始將CRISPR技術(shù)應(yīng)用到基因編輯中。同年，來自不同地區(qū)的研究團(tuán)隊先后證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在哺乳動物中的可行性和初步應(yīng)用研究情況[44-45]。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需對sgRNA進(jìn)行設(shè)計，因此，具有操作簡單和節(jié)省時間等優(yōu)點。

2.2 CRISPR-Cpf1

2015年，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，華裔科學(xué)家張鋒帶領(lǐng)的小組發(fā)現(xiàn)了新一代基因編輯方法，這種新方法與CRISPR/Cas9較為相似，被稱為CRISPR-Cpf1技術(shù)，這是一種更為高效的CRISPR系統(tǒng)[46]。與Cas9相比，Cpf1蛋白更加簡潔且易于操作，這種蛋白僅需要一段crRNA即可構(gòu)成切割復(fù)合體，進(jìn)而完成對目的DNA片段的切割。這種新的蛋白切割后產(chǎn)生的末端為黏性末端，有利于目的基因以非同源重組的方式插入靶向位點，在克服了Cas9蛋白的缺陷后，CRISPR-Cpf1系統(tǒng)成為目前最有效的基因編輯方法。作為全新的基因編輯方法，CRISPR-Cpf1系統(tǒng)中的Cpf1蛋白主要有3個類別：氨基酸球菌Acidaminococcussp.BV3L6、土拉熱弗朗西斯菌FrancisellanovicidaU112和毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium ND2006，分別簡寫為 AsCpf1、FnCpf1和 LbCpf1。

CRISPR-Cpf1系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理類似，Cas9系統(tǒng)集中在提高其特異性上，主要改造針對Cas9自身，諸如改變Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)，給其融合一個DNA結(jié)合域或者FokI核酶等；相比Cas9，Cpf1有許多超過Cas9的優(yōu)點，如序列短，可用于包裝腺病毒等，但對其研究相對較少，Moon等[47]提出，crRNA識別20個靶DNA且3′端加幾個U可以提高Cpf1系統(tǒng)的在靶率，這為Cpf1提供了新的發(fā)展方向。

目前，隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，新的應(yīng)用手段也在不斷開發(fā)，如Co-CRISPR等技術(shù)的出現(xiàn)，為基因編輯技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用展現(xiàn)了更廣闊的前景。

3 基因編輯技術(shù)在海洋生物遺傳育種中的應(yīng)用

海洋生物能夠為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，開展海洋生物尤其是海水養(yǎng)殖品種的基因功能研究，通過揭示其遺傳生長規(guī)律，以及培育高產(chǎn)、抗病和抗逆品種，不僅具有重要的科學(xué)意義，還可有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。近年來， 隨著全基因組測序工作成本的降低，水產(chǎn)生物后基因組時代到來，魚、蝦、蟹、貝、藻等諸多水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)品種的基因組已被測序，為基因編輯在水產(chǎn)養(yǎng)殖物種中的應(yīng)用提供了豐富的遺傳信息資源。 CRISPR技術(shù)在海洋生物中的應(yīng)用也從模式生物開始，該技術(shù)最早在斑馬魚Daniorerio、玻璃海鞘等模式動物中實現(xiàn)。與其他技術(shù)相比，CRISPR技術(shù)在模式生物中普及后開始迅速應(yīng)用于非模式生物中。這從一方面反映了此項技術(shù)的普遍適用性和高效性，從另一方面也為海洋生物的研究帶來了前所未有的機(jī)遇。新型基因編輯技術(shù)不僅可以敲除基因，還可以定向編輯目的基因，能夠顯著縮短育種時間，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比也更加安全。CRISPR技術(shù)在不同水生生物類群中的研究進(jìn)展參見表1。

3.1 魚類

相對于其他物種，基因編輯技術(shù)在魚類中的研究較為廣泛， 該基因編輯技術(shù)迄今已在斑馬魚、青鳉Oryziaslatipes等模式魚類和其他水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類遺傳育種中建立了不少應(yīng)用。 相對于小鼠等模式生物，斑馬魚的胚胎在顯微鏡下觀察是透明的，可以看到各個器官和血管的發(fā)育。斑馬魚體外受精，繁殖周期短并與人類的器官高度相似，因此，該魚已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究的一個重要模型。

2013年，利用CRISPR技術(shù)實現(xiàn)了對斑馬魚fh基因的敲除并獲得了成功[48]。研究證明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚體內(nèi)可誘導(dǎo)胚胎中的靶向基因修飾，其效率與ZFN和TALEN的作用相似。2015年，研究者利用CRISPR技術(shù)成功實現(xiàn)了對海七鰓鰻中與人類同源的tyr基因的敲除，結(jié)果顯示，海七鰓鰻完全適應(yīng)CRISPR技術(shù)且提高注射量能夠成倍地提高其突變量[16]。2017年，研究者利用CRISPR技術(shù)對斑馬魚的atplala.1、atplala.2、atplala.3、atplala.4、atplala.5、pkd2、aqp3a、bmper、s12a、tbx2a等10個前腎表達(dá)基因進(jìn)行敲除，經(jīng)過三代的篩選發(fā)現(xiàn)只有atplala.2和pkd2能夠使斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷[49]。同時該研究敲除了斑馬魚faf1基因，faf1基因參與早期胚胎的神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移分化，通過顯微注射敲除該基因后斑馬魚的色素沉積延遲及尾部肌節(jié)部出現(xiàn)“結(jié)節(jié)樣”變化[50]。

2019年，研究者成功通過CRISPR技術(shù)建立了青鳉foxl2基因缺失的突變體，foxl2突變體有遺傳雌性、生理雄性的表型特征，結(jié)果表明，foxl2對維持青鳉性腺功能具有重要作用[51]。Nanog基因作為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞關(guān)鍵因子之一，對胚胎早期發(fā)育和維持胚胎干細(xì)胞全能性具有重要作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以高效率敲除青鳉tyr基因和nanog基因，且通過同源重組機(jī)制也可介導(dǎo)青鳉nanog基因敲入[52]。該技術(shù)還可以敲除青鳉的SLC45a2基因，產(chǎn)生的突變體顯示出白化病表型[53]。

在研究大西洋鮭身體著色的關(guān)鍵基因slc45a2和tyr過程中，首次利用CRISPR技術(shù)對海洋冷水物種進(jìn)行了敲除[20]。在隨后的研究中，研究者利用Co-CRISPR技術(shù)同時靶定著色基因與一些不相干的基因，使得缺失著色基因的大西洋鮭的突變體更加容易被識別，而且第二個被靶定的基因擁有較高的突變率[21]。

除此之外，CRISPR技術(shù)在牙鲆Paralichthyolivaceus生長發(fā)育方面的應(yīng)用也取得了一定進(jìn)展，研究者采用CRISPR技術(shù)對牙鲆肌生成抑制素(MSTN)進(jìn)行干擾，將靶向MSTN基因第一個外顯子的Cas9 mRNA和sgRNAs共注射到牙鲆胚胎中，通過篩選，在F1代中得到了具有MSTN干擾的雜合雙等位基因突變體，表現(xiàn)為身體增厚，肥滿度增加[54]。

3.2 甲殼動物

目前，甲殼類動物中CRISPR技術(shù)的相關(guān)研究主要涵蓋蝦類和大型溞Daphniamagna。2014年，Nakanishi等[55]利用CRISPR技術(shù)將遺傳突變引入到大型溞的內(nèi)源盲基因中，這是該項技術(shù)在甲殼動物中的首次應(yīng)用。研究者失活了大型溞的pax6基因，證明了該基因在眼發(fā)育中的關(guān)鍵作用。除此之外，研究者還將基因編輯后的個體繼續(xù)培養(yǎng)至性成熟，并對獲得的后代進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)這些編輯過的基因組能夠順利遺傳給后代。

2016年，研究者利用CRISPR技術(shù)在夏威夷明溝蝦Parhyalehawaiensis中成功實現(xiàn)了對Hox基因的定點敲除，結(jié)果表明，特定的Hox基因直接決定了甲殼動物頭胸腹部不同形態(tài)的附肢形態(tài)[56]。這也使得CRISPR技術(shù)在經(jīng)濟(jì)甲殼動物(如蝦蟹類)中的應(yīng)用探索也有了突破。同年，研究者利用CRISPR技術(shù)成功實現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)蝦類脊尾白蝦Exopalaemoncarinicauda中幾丁質(zhì)酶基因Chi4的敲除，同時觀察到Chi4敲除對脊尾白蝦生長發(fā)育的影響，若對更多的基因進(jìn)行改造，可能會獲得更高產(chǎn)率的新品種[57]。在此基礎(chǔ)上，通過共注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9mRNA和gRNA的方法敲除脊尾白蝦的MIH基因，能夠獲得幼體發(fā)育時間縮短的個體[58]。

3.3 軟體動物

CRISPR技術(shù)在軟體動物中的研究相對較少。2015年，研究者利用CRISPR技術(shù)在大西洋角螺Crepidulafornicata幼蟲中檢測到了具有紅色熒光信號的β-catenin蛋白[59]。2019年，一個基于核糖核酸蛋白復(fù)合物的太平洋牡蠣Crassostreagigas基因編輯系統(tǒng)被開發(fā)出來[60]。在靶基因中，肌生成抑制蛋白(MSTN)和Twist被選為靶點，CRISPR誘導(dǎo)的突變主要是1～24 bp的小突變，這種方法為牡蠣和其他海洋雙殼類的基因功能提供了強(qiáng)有力的工具，并有可能作為一種新的基因工程技術(shù)用于養(yǎng)殖并改善牡蠣的特性。

3.4 棘皮動物

在海洋棘皮動物的CRISPR技術(shù)相關(guān)研究方面，多個學(xué)者都針對海膽的基因進(jìn)行了編輯。2016年，研究者利用CRISPR技術(shù)將靶向Nodal基因的sgRNA和編碼Cas9蛋白的mRNA注射到海膽的受精卵中, 成功敲除了海膽的Nodal基因, 在全部6種gRNA中有5種出現(xiàn)了預(yù)期的敲除效果[18]。同年，研究者通過將目標(biāo)對準(zhǔn)一個非必需基因簡化gRNA的構(gòu)建步驟，該基因能快速評估胚胎中成功的CRISPR功能，從而能夠簡單目測出功能基因的破壞[63]。2019年，Lin等[61]詳細(xì)介紹了CRISPR技術(shù)在海膽胚胎中的應(yīng)用方法，包括gRNA設(shè)計、體外合成單導(dǎo)向RNA (sgRNA)、CRISPR技術(shù)在基因敲除和單核苷酸編輯中的應(yīng)用，以及用于評價基因編輯效率的合成胚胎的基因分型方法。2019年，研究者將海膽中的Pks1基因成功敲除，結(jié)果表明，在海膽變態(tài)后的幼體中仍然保留了白化型，能夠存活至少一年并發(fā)育為白化的成年海膽[64]。

3.5 其他

2014年，研究者開始使用CRISPR技術(shù)實現(xiàn)對玻璃海鞘基因的定點敲除[14]，為了敲除玻璃海鞘中的Hox基因，研究人員選取了Hox3、Hox5、Hox12 3個等位基因共計8個靶點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hox3-sg3、Hox5-sg1能使受體目的基因產(chǎn)生突變，其余并未出現(xiàn)預(yù)期效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入的sgRNA表達(dá)框架質(zhì)量必須大于1.5 pg，表達(dá)Cas9蛋白mRNA的質(zhì)量必須大于15 pg，才能使受精卵發(fā)生突變，且突變率與使用量成正比。另一個研究選取了玻璃海鞘發(fā)育過程中非常重要的ebf基因作為靶向基因，并以其為基礎(chǔ)構(gòu)建了2個gRNA表達(dá)載體，將靶向ebf基因的gRNA與編碼Cas9蛋白的mRNA以電穿孔的方式導(dǎo)入受精卵中，取得了較高的突變效率[15]。通過改造載體上的部分序列，試驗還達(dá)到了幫助細(xì)胞中質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的效果。

2014年，研究者分別利用CRISPR和TALEN技術(shù)對海葵Nematostellavectensis的一種內(nèi)源的紅色熒光蛋白(FP-7R)進(jìn)行了敲除，被敲除基因的?？荒馨l(fā)出紅色熒光，該研究還證明了FP-7R并不是?？l(fā)育所必需的[17]。2016年，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域拓展到了海洋藻類中，三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum中的CpSRP54基因被成功敲除[19]，該研究也證實，CRISPR技術(shù)可以在微藻中有效地產(chǎn)生穩(wěn)定的靶向基因突變。2019年，研究者通過CRISPR/CAS9誘變基因編輯對海蠕蟲Capitellateleta橫紋肌視蛋白基因r-opsin1進(jìn)行了破壞，雖然突變個體眼斑感光細(xì)胞和相關(guān)色素細(xì)胞正常形成并持續(xù)存在，但幼蟲的趨光性顯著下降[62]。

4 存在問題及展望

近年來，CRISPR系統(tǒng)和相關(guān)蛋白的研究不斷地完善和優(yōu)化，為整個生物技術(shù)領(lǐng)域提供了無限可能。相對于ZFN和TALEN這兩種基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas作為第三代人工核酸酶成為目前研究的熱點，在技術(shù)門檻、應(yīng)用便捷程度、成本等關(guān)鍵方面具有顯著的優(yōu)勢。然而，從目前的報道來看，CRISPR技術(shù)在研究與應(yīng)用過程中仍存在諸多問題：

1) 應(yīng)用受限：基因編輯技術(shù)主要是通過顯微注射等方法對細(xì)胞系或胚胎進(jìn)行操作，而海洋生物細(xì)胞系較少，一定程度上限制了基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，目前的研究只限于模式生物和少數(shù)海洋生物，廣泛應(yīng)用任重而道遠(yuǎn)。

2) 編輯效率和精確度不高：研究及應(yīng)用中可能產(chǎn)生脫靶問題，引起基因組的重排或無法預(yù)測的突變，已有報道改良后的基因編輯技術(shù)在降低脫靶率和增強(qiáng)特異性等方面均取得了顯著進(jìn)展[65-66]。

3)公眾認(rèn)知度不高：多數(shù)公眾對于CRISPR技術(shù)的發(fā)展、研究及應(yīng)用的了解不多，對于基因編輯的水產(chǎn)品安全性存在一定的疑慮。

隨著海洋生物基因組研究的快速發(fā)展，CRISPR技術(shù)也為海洋生物，特別是水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究帶來了前所未有的機(jī)遇。CRISPR技術(shù)通過高效、定向地編輯目的基因，進(jìn)行基因的切除與導(dǎo)入，未來將對海洋生物的遺傳育種產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，建議今后應(yīng)在以下幾方面開展更多研究工作：

1)擴(kuò)大研究和應(yīng)用范圍：相對于其他物種，CRISPR技術(shù)在海洋生物領(lǐng)域的研究較少且多集中在魚類，未來應(yīng)在更多海洋經(jīng)濟(jì)品種中更深入和廣泛地展開遺傳育種的研究與應(yīng)用。

2)提高基因編輯的效率和精確度：通過對基因更精準(zhǔn)和高效的敲入/敲除或修飾，提升水產(chǎn)苗種的繁育效率和繁殖力、提高生長速度、增強(qiáng)抗逆性與抗病性，獲得具有優(yōu)良性狀的新品種，實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)與社會效益的雙贏。

3)深入解析海洋生物基因功能：隨著更多海洋生物基因組測序的完成，基因編輯技術(shù)將進(jìn)一步解讀不同基因在海洋生物遺傳育種乃至生物進(jìn)化發(fā)育中的作用。

4)提高透明度和公眾認(rèn)知度：一項技術(shù)的成功應(yīng)用，推廣也是其中重要一環(huán)，研究者應(yīng)該讓基因編輯技術(shù)的使用更透明，而管理者則應(yīng)該不斷完善政策和監(jiān)管，從而減少公眾的質(zhì)疑，獲得消費(fèi)者的認(rèn)可，使該技術(shù)理性健康發(fā)展，更好地服務(wù)于大眾。