基于HPLC多組分定量測定結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的慢支固本顆粒質(zhì)量評價

姚建華，趙 博，王婧寧，趙志國，韋 杏，黃 群*

0 引言

慢支固本顆粒由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)和當(dāng)歸組方而成，主要用于慢性支氣管炎緩解期因肺脾氣虛而出現(xiàn)的乏力、自汗、惡風(fēng)寒、咳嗽、咯痰、易感冒、食欲不振等病癥的治療，對呼吸道細(xì)菌感染、支氣管哮喘具有一定的治療作用[1]。慢支固本顆?，F(xiàn)收載于中國藥典2020年版一部[1]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道僅對其所含的1～2個成分進(jìn)行了定量控制，不能全面地反映制劑的整體質(zhì)量[2]。為更好地保障臨床用藥的穩(wěn)定性和療效一致性，本研究依據(jù)中醫(yī)君、臣、佐、使配伍原則，結(jié)合中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，采用HPLC法對慢支固本顆粒中8種主要成分的含量同時進(jìn)行測定，以期建立多指標(biāo)的慢支固本顆?？刂品椒?，同時采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對定量結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析，為全面評價慢支固本顆粒整體質(zhì)量提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；KQ-250DB型超聲波清洗器(功率250 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；XS105DU型電子分析天平(精度：0.01 mg，德國Mettler Toledo公司)。

1.2 試劑 對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號111920-201907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%，CAS號20633-67-4)、升麻素苷(批號111522-201913，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.6%，CAS號80681-45-4)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(批號111978-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，CAS號73030-71-4)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(批號111975-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，CAS號73069-13-3)，購于中國食品藥品檢定研究院；對照品9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(批號PRF8101143，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%，CAS號94367-42-7)、芒柄花苷(批號PRF8081121，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，CAS號486-62-4)、毛蕊異黃酮(批號PRF8062601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，CAS號20575-57-9)、升麻素(批號PRF9092523，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，CAS號37921-38-3)，購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。慢支固本顆粒(規(guī)格：每袋裝10 g；批號：20190203、20190207、20190211、20190215、20190302、20190501、20190503、20190504、20190506和20190507，編號分別為S1～S10)來源于浙江新光藥業(yè)股份有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.498、0.264、0.372、0.196、1.498、0.534、0.158和0.112 mg/ml的混合對照品儲備液。精密吸取上述溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分別用甲醇定容至20 ml，制成6個系列質(zhì)量濃度線性考察用混合對照品溶液；取中間質(zhì)量濃度混對溶液作為混合對照品溶液(毛蕊異黃酮葡萄糖苷24.9 μg/ml、芒柄花苷13.2 μg/ml、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷18.6 μg/ml、毛蕊異黃酮9.8 μg/ml、升麻素苷74.9 μg/ml、升麻素26.7 μg/ml、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 7.9 μg/ml、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 5.6 μg/ml)。

2.1.2 慢支固本顆粒供試品溶液 取慢支固本顆粒樣品適量，剪開內(nèi)包裝，傾出內(nèi)容物研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加入甲醇適量，超聲提取30 min，放冷后用甲醇定容，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按慢支固本顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下處方工藝，分別制備缺黃芪、缺防風(fēng)、缺白術(shù)的陰性樣品，再按上述方法制成3種陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗 采用Agilent SB C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，見表1；流速為0.9 ml/min；檢測波長：254 nm(0～35 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷和升麻素)[3-8]和220 nm(35～55 min檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ)[9-12]；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，進(jìn)樣檢測并記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果理論板數(shù)按各成分色譜峰計均>4 000，8種成分色譜峰分離效果良好，分離度均>1.5，陰性樣品對8種成分同時測定無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

表1 梯度洗脫程序

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項下6個系列質(zhì)量濃度線性考察混合對照品溶液適量，依次進(jìn)樣測定慢支固本顆粒中8種目標(biāo)化合物的峰面積，以各成分質(zhì)量濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得8種目標(biāo)化合物的回歸方程、r值及線性范圍，見表2。

表2 慢支固本顆粒中8種成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗 取同一份慢支固本顆粒供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積，結(jié)果8種目標(biāo)化合物峰面積的RSD分別為0.88%、1.01%、0.95%、1.14%、0.52%、0.79%、1.06%和1.23%。

2.5 重復(fù)性試驗 取同一批慢支固本顆粒樣品，平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積并計算各成分含量，結(jié)果8種成分含量的RSD分別為1.45%、1.62%、1.30%、1.51%、0.89%、1.08%、1.73%和1.86%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份慢支固本顆粒供試品溶液于0、2、4、9、18和24 h進(jìn)樣檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積，結(jié)果顯示，慢支固本顆粒供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，供試品溶液中8種目標(biāo)化合物峰面積的RSD分別為0.90%、1.03%、1.01%、1.12%、0.58%、0.82%、1.11%和1.19%。

2.7 加樣回收率試驗 取8種成分含量均已知的同一批次慢支固本顆粒樣品適量，傾出內(nèi)容物研細(xì)，取9份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入根據(jù)8種成分含量另行配制的混合對照品溶液(毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.326 mg/ml、芒柄花苷0.198 mg/ml、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷0.262 mg/ml、毛蕊異黃酮0.138 mg/ml、升麻素苷1.074 mg/ml、升麻素0.372 mg/ml、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 0.108 mg/ml、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 0.084 mg/ml)0.5、1.0、1.5 ml，再按供試品溶液制備方法制成加樣回收樣品溶液，依法進(jìn)樣測定，計算各成分含量及加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 慢支固本顆粒中8種成分的回收率實驗結(jié)果

續(xù)表

2.8 樣品含量測定 取10個批次慢支固本顆粒樣品，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積，計算8種目標(biāo)化合物含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)

2.9 化學(xué)計量學(xué)分析

2.9.1 聚類分析 為考察不同批次間慢支固本顆粒的含量差異，采用SPSS 26.0軟件組間聯(lián)接聚類分析方法，以歐氏距離為測度，以8種目標(biāo)化合物毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量為變量，對10個批次慢支固本顆粒樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)類間距離為15時，10批樣品聚為2類，樣品S2、S5、S4、S1和S3聚為第Ⅰ類，樣品S6、S9、S7、S10和S8聚為第Ⅱ類。從分類結(jié)果可以看出，目標(biāo)化合物含量差異與樣品批次期間相關(guān)，可能與慢支固本顆粒生產(chǎn)所用原藥材的產(chǎn)地來源、采收時節(jié)不同以及原藥材的批間質(zhì)量差異有關(guān)。

圖2 10批慢支固本顆粒聚類分析樹狀圖

2.9.2 主成分分析 采用SPSS 26.0軟件，以8種目標(biāo)化合物含量為變量，對10個批次慢支固本顆粒含量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得初始特征值和方差貢獻(xiàn)率見表5。

表5 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率

由表5可知，按照特征值>1，累積方差貢獻(xiàn)率>85%為提取標(biāo)準(zhǔn)，從慢支固本顆粒8種目標(biāo)化合物中提取出前3個主成分進(jìn)行分析評價。由表5可知，升麻素苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和毛蕊異黃酮葡萄糖苷是對主成分1影響較大的特征向量；升麻素對主成分2貢獻(xiàn)度高，芒柄花苷對主成分3貢獻(xiàn)度顯著。見表6。

表6 10批慢支固本顆粒主成分分析結(jié)果

3 討論

3.1 定量目標(biāo)成分的選擇 慢支固本顆粒由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)和當(dāng)歸4味中藥材加工而成，方中黃芪補(bǔ)脾益肺、益氣固表，為君藥；白術(shù)健脾益氣、

利水止汗，助君藥黃芪補(bǔ)益脾肺，為臣藥；當(dāng)歸補(bǔ)血和血，防風(fēng)祛風(fēng)解表、勝濕止痛，共為佐使藥，諸藥合用，共奏補(bǔ)肺健脾、固表和營之效。本文選取慢支固本顆粒君藥黃芪所含活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊異黃酮，臣藥白術(shù)所含主要活性成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，佐藥防風(fēng)所含代表性成分升麻素苷、升麻素為定量測定目標(biāo)成分，以期更加全面地評價慢支固本顆粒的整體質(zhì)量。

3.2 流動相的優(yōu)化 在流動相優(yōu)化過程中，首先對不同有機(jī)相(甲醇、乙腈)進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示甲醇-水體系[6-8]色譜圖基線不平穩(wěn)，部分色譜峰拖尾嚴(yán)重，達(dá)不到定量檢測要求，而乙腈-水體系[11-13]基線稍平穩(wěn)，但升麻素苷色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。為有效改善峰形，采用乙腈為流動相中有機(jī)相，對不同水相(0.1%甲酸溶液[3-4,14-15]、0.1%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液[10,16]、0.2%磷酸溶液)進(jìn)行對比分析，同時對有機(jī)相和水相比例進(jìn)行多次優(yōu)化，最終選擇“2.4”項下的色譜條件。

中藥及其制劑，尤其是中成藥復(fù)方制劑相比于化學(xué)藥品，質(zhì)量控制方法比較滯后，控制體系尚不完善，制劑生產(chǎn)所用原藥材因種屬來源、產(chǎn)地差異、生長年限、采收季節(jié)等因素影響，造成中藥制劑批間差異較大。從10批次樣品含量測定結(jié)果來看，8種目標(biāo)化合物含量存在一定批間差異，編號S4、S5和S2樣品的8種目標(biāo)化合物綜合含量較高，編號S9和S6樣品綜合含量較低，與聚類分析結(jié)果一致。本實驗采用HPLC法對慢支固本顆粒中8種成分含量同時進(jìn)行測定，建立該制劑多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，同時采用聚類分析、主成分分析等化學(xué)計量學(xué)手段對測定結(jié)果進(jìn)行綜合評價，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷完善制劑制備過程參數(shù)控制以及對原藥材內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，為慢支固本顆粒質(zhì)量控制體系的建立提供參考。中藥指紋圖譜具有信息量大、特征性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠呈現(xiàn)中成藥復(fù)方制劑所含更多化學(xué)成分信息，采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對該制劑進(jìn)行綜合評價正在進(jìn)一步研究中。