高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤殘留量的不確定度評定

◎ 唐韻熙

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121）

豆芽因其產(chǎn)量高、價(jià)格便宜、有利于消化且加工方便，成為人們餐桌上的日常食品，受到普遍歡迎。但在豆芽生產(chǎn)過程中，各地多次出現(xiàn)了黑作坊生產(chǎn)的“毒豆芽”，嚴(yán)重危害著廣大消費(fèi)者的健康。其大多是不法商販為了提高豆芽的產(chǎn)率，縮短豆芽生長周期，在豆芽生產(chǎn)過程中添加4-氯苯氧乙酸（4-CPA）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）等植物生長調(diào)節(jié)劑以及抗生素類藥物，促進(jìn)豆芽下胚軸粗大，減少根部萌發(fā)，加速細(xì)胞分裂，且能起到抗菌、殺菌作用，使豆芽在生長過程中免受微生物的侵蝕。經(jīng)常食用這些“毒豆芽”，會(huì)使人體內(nèi)殘留高劑量的藥物，可能影響中樞神經(jīng)[1-9]?！秶沂称匪幤繁O(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)關(guān)于豆芽生產(chǎn)過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告》（2015年第11號(hào)）[10]中明確規(guī)定，生產(chǎn)者不得在豆芽生產(chǎn)過程中使用4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤；豆芽經(jīng)營者不得經(jīng)營含4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤的豆芽。

植物生長調(diào)節(jié)劑的化學(xué)性質(zhì)和生物特性因其種類繁多而各有異同，有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，殘留量低，為提高檢測質(zhì)量與準(zhǔn)確度，需對檢測方法進(jìn)行不確定度評定。目前，植物生長調(diào)節(jié)劑僅有6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸和多效唑的非標(biāo)準(zhǔn)方法的不確定度報(bào)道[11-12]，因此，本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測豆芽中4-CPA、6-BA 含量的測定方法，并且依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[13]、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[14]的相關(guān)規(guī)定，對該方法的不確定度進(jìn)行評定，找出影響測定結(jié)果的主要因素，并進(jìn)行不確定度分析計(jì)算，進(jìn)而對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評判，提高檢測質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB5500 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）、1290 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、3-30KS 型冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司）、ML-886 渦旋儀（海門市其林貝爾儀器）、Turbovap LV 全自動(dòng)濃縮儀（英國Biotage 公司）、Milli-Q reference 型純水機(jī)（美國MILLIPORE 超純水系統(tǒng)）、MSA225S-100-DU 電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）、ME203/02 電子分析天平（千分之一，瑞士METTLER TOLEDO 公司）。

4-氯苯氧乙酸（4-CPA）標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度：98.11%）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度：98.51%）、甲醇、乙腈、甲酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、Bondesil-C18。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10.73 mg 4-CPA、10.24 mg 6-BA 于10 mL 容量瓶中，甲醇溶液定容，配制成濃度分別為1.053 mg·mL-1、1.009 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 配制[c（4-CPA）=10.53 μg·mL-1，c（6-BA）=10.09 μg·mL-1]：分別移取100 μL 4-CPA和100 μL 6-BA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 配制[c（4-CPA）=1.053 μg·mL-1，c（6-BA）=1.009 μg·mL-1]：準(zhǔn)確移取1 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 至10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液配制：分別準(zhǔn)確移取10 μL、20 μL、40 μL 混合標(biāo)準(zhǔn) 溶 液2，10 μL、15 μL、20 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 于1 mL 容量瓶中，用陰性基質(zhì)定容至刻度。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

稱取5 g均質(zhì)的豆芽樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 的1%甲酸乙腈溶液，振蕩渦旋5 min，加入2 g 無水硫酸鎂、0.5 g 無水乙酸鈉，迅速振搖，于9 000 r·min-1離心10 min，準(zhǔn)確移取4 mL 上清液至干凈離心管中，45 ℃氮吹干，加入1 mL 甲醇溶解，超聲5 min，轉(zhuǎn)移上述溶解液于1.5 mL 凈化小管中（內(nèi)含75 mg 無水硫酸鎂，25 mg C18），渦旋2 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm 濾膜，待LC/MS/MS 分析。

1.3.2 液相色譜

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A：0.1 %甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫程序：0 ～0.5 min，10% B，0.5 ～2.5 min，10% B →90% B，2.5 ～4.5 min，90% B，4.5 ～4.6 min，90% B →10% B，4.6 ～6.5 min，90% B，流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧（ESI）離子源，負(fù)離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子源電壓：4 500 V；氣簾氣壓力：275.79 kPa；GAS1：379.21 kPa，GAS2：379.21 kPa；目標(biāo)化合物的監(jiān)測離子對，去簇電壓（DP）和碰撞能（V）參數(shù)見表1。

表1 4-CPA 及6-BA 的母離子、子離子及其他質(zhì)譜參數(shù)表

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

樣品中待測組分的含量的計(jì)算公式為：

式中，X-樣品中待測組分的含量，單位為μg·kg-1；C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品溶液中待測組分的濃度，單位為ng·mL-1；V-樣品溶液最終定容體積，單位為mL；m-稱樣量；fr-待測組分的回收率（%）；2.5-稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的不確定度來源

根據(jù)試驗(yàn)測試過程，分析影響豆芽試樣中4-CPA及6-BA 殘留量測定結(jié)果的各種不確定的因素，評價(jià)不確定度來源主要有：樣品前處理制備、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（包括儲(chǔ)備液與混合中間溶液的配制過程）、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、根據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品濃度、回收率以及測試儀器。

2.2 由樣品前處理引入的相對不確定度urel（樣品）

樣品前處理引入的不確定度主要有樣品稱量urel（m樣）、加入提取試劑0.1%甲酸乙腈體積urel（V10mL）、移取4 mL提取試劑urel（V4mL），最終定容體積urel（V1mL），各分量不相關(guān)，具體見表2。合成樣品前處理制備的相對不確定度為：

表2 樣品前處理引入的不確定度表

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對不確定度urel（s）

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制urel（s1）、標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制urel（s2）和urel（s3）、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制urel（s4）。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對不確定度urel（s1）

其主要來源有：標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度urel（p）、標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度urel（ms）、10 mL容量瓶校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)引入的不確定度urel（V10mL），具體見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對不確定度表

續(xù)表3

2.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制引入的相對不確定度urel（s2）和urel（s3）

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1、2 配制過程中引入的不確定度主要是：200 μL 移液槍、1 mL 移液槍、10 mL容量瓶以及容量瓶溫度效應(yīng)。根據(jù)移液槍校準(zhǔn)證書，200 μL 和1 mL 移液槍最大允許誤差分別是±0.3%和±0.4%，按矩形分布，k=，則兩者產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由表3 可知，10 mL 容量瓶引入的相對不確定度urel（V10mL）=0.003 38，將上述分量合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對不確定度urel（s4）

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液是由豆芽陰性基質(zhì)逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制而成的。配制過程中引入的不確定度分量及數(shù)值見表4[15]，則合成各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)引入的相對不確定度為：

表4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中引入的不確定度表

2.4 根據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品濃度引入的不確定度u（y）

將標(biāo)準(zhǔn)曲線的6 個(gè)濃度點(diǎn)每個(gè)進(jìn)樣3 次，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C，ng·mL-1），目標(biāo)物分子離子峰的峰面積為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行線性回歸，回歸方程、相關(guān)系數(shù)r見表5。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度按式（3）計(jì)算：

其中Sr按公式（4）計(jì)算：

式中Sr為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，Sr（4-CPA）=21.414 4；Sr（6-BA）=15.778 1；m為 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)個(gè)數(shù)，m=6；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)，n=3；p為待測物質(zhì)測定次數(shù)，p=3，為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度；a為斜率，b為截距。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性表

將被測樣品平行測定3 次，分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的4-CPA 和6-BA 化合質(zhì)量濃度Cx（ng·mL-1）見表6。

表6 被測樣品的測定數(shù)據(jù)表

被測樣品由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（y4-CPA）=0.041 56，urel（y6-BA）=0.040 13。

2.5 回收率測試過程引入的不確定度urel（fr）

在6份空白豆芽試樣中分別加入絕對含量為52.65 ng的4-氯苯氧乙酸（4-CPA）和50.45 ng 6-芐基腺嘌呤（6-BA）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1、1.3.2 和1.3.2 試樣制備和儀器條件進(jìn)行操作，結(jié)果見表7。按照式以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率不確定度和回收率相對不確定度。

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差：

回收率不確定度：

回收率相對不確定度：

表7 回收率引入的不確定度表

用t檢驗(yàn)法，，來檢驗(yàn)回收率是否與100%存在顯著差異性，結(jié)果見表7。由于t值>臨界值（2.57），說明平均回收率與100%回收率之間有顯著性差異，回收率矯正因子必須在計(jì)算公式中采用，以修正結(jié)果。

2.6 檢測儀器引入的相對不確定度urel(fm)

根據(jù)《液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 儀器校準(zhǔn)證書》知，urel(fm)=4.0%。

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

3.1 各分量不確定度匯總

對于豆芽中4-CPA 和6-BA 測定結(jié)果有影響的各種不確定分量來源匯總見表8。

表8 各分量不確定度匯總表

3.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于上述各因素的不確定度互不相關(guān)，合成豆芽中4-CPA 和6-BA 含量的相對不確定度為：

3.3 相對擴(kuò)展不確定度

在95%置信水平下，k=2，4-CPA 的相對擴(kuò)展不確定度為u（4-CPA）=9.06×0.095 14=0.86 μg·kg-1；6-BA的相對擴(kuò)展不確定度為u（6-BA）=9.41×0.093 98=0.88 μg·kg-1。

3.4 測定結(jié)果

按照該方法測定豆芽中4-CPA 含量的結(jié)果為：X（4-CPA）=（9.06±0.86）μg·kg-1，k=2；X（6-BA）=（9.41±0.88）μg·kg-1，k=2。

4 結(jié)論

通過不確定度評定分析，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測中豆芽中4-CPA 和6-BA 含量的過程中，樣品前處理制備引起的不確定度最大，其次是由儀器以及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合求得樣品濃度值過程帶入。因此，在實(shí)際工作中應(yīng)對樣品前處理進(jìn)行規(guī)范操作，同時(shí)選取精密性高的儀器進(jìn)行檢測，高精密度天平精密稱量，高精密度的移液槍和容量瓶進(jìn)行溶液配制，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。