◎ 金倩儀
(中山市食品藥品檢驗(yàn)所,廣東 中山 528437)
通過室間比對(duì)和盲樣考核是一種提升食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢測能力的常見方式,因此,實(shí)驗(yàn)室會(huì)每年定期參加不同的能力驗(yàn)證以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室檢測能力穩(wěn)步提升。2020 年,中山市食品藥品檢驗(yàn)所參與了由廣東省市場監(jiān)督管理局組織的“2020 年食品安全抽檢監(jiān)測工作承檢機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)”,現(xiàn)將有關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道如下,以其為今后食品微生物檢測工作提供參考。
由廣東省微生物分析檢測中心提供的4 個(gè)不同凍干樣品(菌落總數(shù)1 個(gè)、大腸菌群1 個(gè)以及沙門氏菌2 個(gè)),采用西林瓶真空密閉包裝,分別編號(hào)為A1、E1、S34 和S78。
1.2.1 試劑
磷酸鹽緩沖液、平板計(jì)數(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)、緩沖蛋白胨水、TTB 增菌液、SC 增菌液、BS 瓊脂、三糖鐵、革蘭氏染色液、賴氨酸脫羧酶肉湯及氨基酸脫羧酶對(duì)照均購自北京陸橋技術(shù)有限公司;沙門氏菌屬診斷血清購于泰國S&A 公司;沙門顯色培養(yǎng)基購自法國科瑪嘉;API 20E 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡和VIDAS沙門氏菌屬篩檢試劑條均購于梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。
1.2.2 儀器
電子天平、生化培養(yǎng)箱、電子顯微鏡、生物安全柜、均質(zhì)器、VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、mini-VIDAS 全自動(dòng)免疫熒光分析儀。
整個(gè)實(shí)驗(yàn)在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,遵循無菌操作原則進(jìn)行。
菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌的檢驗(yàn)方法如表1。
表1 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目和方法列表
按作業(yè)指導(dǎo)書上樣品處理的操作方法,在生物安全柜內(nèi)無菌操作開啟樣品后,將粉末按步驟溶解于100 mL 磷酸鹽緩沖液作為樣品原液,按相應(yīng)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
取25 mL 樣品混懸液于225 mL 的磷酸鹽緩沖液中,用均質(zhì)器拍打混勻,作為第一稀釋度。再取1 mL(1 ∶10)的樣品勻液于9 mL 磷酸鹽緩沖液中,振蕩混勻作為第二稀釋度。按照同樣的步驟做到第八稀釋度。吸取1 mL 稀釋液于無菌平皿內(nèi)倒入平板計(jì)數(shù)瓊脂,(36±1)℃倒置培養(yǎng)(48±2)h[1]。
樣品稀釋同1.6。樣品稀釋至第七稀釋度,吸取1 mL稀釋液于無菌平皿內(nèi)倒入VRBA 瓊脂,(36±1)℃倒置培養(yǎng)18 ~24 h。從VRBA 平板上挑取10 個(gè)不同類型的典型可疑菌落,少于10 個(gè)菌落的挑取全部典型可疑菌落。分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi),(36±1)℃培養(yǎng)24 ~48 h,觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣,即可報(bào)告為大腸菌群陽性[2]。
1.8.1 前增菌
取25 mL 樣品混懸液于225 mL 的緩沖蛋白胨水中,振蕩混勻,于(36±1)℃培養(yǎng)8 ~18 h[3]。
1.8.2 增菌
各取1 mL 輕搖培養(yǎng)過的混勻液于10 mL 的TTB增菌液、SC 增菌液中培養(yǎng)。TTB 增菌液需在(42±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 ~24 h;SC 增菌液需在(36±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 ~24 h[3]。
1.8.3 分離培養(yǎng)
用無菌接種環(huán)挑取增菌后的TTB 增菌液和SC 增菌液各一環(huán),分別劃線接種BS 平板,沙門氏顯色培養(yǎng)基平板。兩種平板菌在(36±1)℃環(huán)境下培養(yǎng),其中BS 平板需要培養(yǎng)40 ~48 h,而沙門顯色培養(yǎng)基平板需要培養(yǎng)18 ~24 h。
菌落總數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果如表2,因?yàn)榫淇倲?shù)的計(jì)數(shù)方法是取30 ~300 CFU 菌落數(shù),只有稀釋度為10-3的平板在計(jì)數(shù)范圍內(nèi),所以結(jié)果為5×104CFU·mL-1。
表2 菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表
大腸菌群計(jì)數(shù)結(jié)果如表3,因?yàn)榇竽c菌群計(jì)數(shù)方法是取15 ~150 CFU 菌落數(shù),只有稀釋度為10-2的平板在計(jì)數(shù)范圍內(nèi),所以通過計(jì)算得到了7 550 CFU·mL-1的檢測值,經(jīng)過第3 位數(shù)字“四舍五入”的修約后得到了7.6×103CFU·mL-1的結(jié)果。
表3 大腸菌群計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表
2.3.1 樣品S34 的結(jié)果
經(jīng)過mini-VIDAS 進(jìn)行初篩得到了陽性的結(jié)果,結(jié)合劃線后的亞硫酸鉍瓊脂平板上生長黑色有金屬光澤菌落,菌落周圍培養(yǎng)基呈棕色;沙門顯色培養(yǎng)基上生長淡紫色圓形菌落,以上現(xiàn)象均是沙門氏菌的可疑現(xiàn)象,需要進(jìn)一步做生化試驗(yàn)。三糖鐵瓊脂的結(jié)果為斜面產(chǎn)堿變紅,底層產(chǎn)酸變黃,產(chǎn)氣,產(chǎn)硫化氫;賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性,兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果可初步判斷為可疑沙門菌屬。筆者運(yùn)用了API 和VITEK2-Compact 兩種方法進(jìn)行了確證,反饋的結(jié)果都是Salmonellagroup 99%,結(jié)果可見圖1、圖2。同時(shí)還做了血清試驗(yàn),O 多價(jià)和H 多價(jià)血清均凝集。因此樣品S34 的結(jié)果報(bào)告是檢出了沙門氏菌。
圖1 樣品S34 API20E 的結(jié)果圖
圖2 樣品S34 VITEK2 的結(jié)果圖
2.3.2 樣品S78
經(jīng)過mini-VIDAS 進(jìn)行初篩得到了陰性的結(jié)果,見表4,結(jié)合劃線后的亞硫酸鉍瓊脂平板上未見菌落生長;沙門顯色培養(yǎng)基上生長藍(lán)色圓形菌落,以上現(xiàn)象可判斷為未檢出沙門氏菌。因此樣品S78 的結(jié)果報(bào)告是未檢出沙門氏菌。
表4 Mini VIDAS 結(jié)果表
2020 年食品安全抽檢監(jiān)測工作承檢機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果如表5。
表5 2020 年食品安全抽檢監(jiān)測工作承檢機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)情況表
參加本次室間比對(duì)的實(shí)驗(yàn)室共有44 家,其中有4家的結(jié)果為不滿意,有2 家的結(jié)果為基本滿意,其余的38 家實(shí)驗(yàn)室反饋結(jié)果均為滿意。出現(xiàn)不滿意結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室,有3 家都是在考核沙門氏菌出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果;剩下1 家是在大腸菌群計(jì)數(shù)時(shí)結(jié)果超出考核范圍。沙門氏菌檢驗(yàn)出現(xiàn)的問題可以能是因?yàn)橄竟ぷ鳑]做好、操作人員判斷典型菌落時(shí)出現(xiàn)了偏差而沒有進(jìn)行下一步鑒定或是挑取錯(cuò)誤、樣品前處理時(shí)沒做好導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗等。因此,在對(duì)待可疑樣品時(shí)應(yīng)采取多種方法來鑒定,以免造成錯(cuò)檢或漏檢[4]。
在進(jìn)行沙門氏菌檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)在增菌后通過mini-VIDAS 進(jìn)行初篩,如果出現(xiàn)陽性的結(jié)果應(yīng)更加謹(jǐn)慎的對(duì)待該樣品。mini-VIDAS 檢測方法既快速準(zhǔn)確又可以避免人工檢測造成的誤差,與傳統(tǒng)方法互補(bǔ)[5],不過檢驗(yàn)費(fèi)用較為昂貴。在后續(xù)的鑒定中筆者實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用傳統(tǒng)方法同時(shí)再結(jié)合API 法和VITEK2-Compact 兩種方法來確證,API 法能夠提高檢測效率還能彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足[6];全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)在實(shí)操中會(huì)更加便利,生化結(jié)果準(zhǔn)確而且快速。雖然相對(duì)人工進(jìn)行的傳統(tǒng)生化試驗(yàn)這兩種方法成本都更高,但是檢測時(shí)間更短,而且結(jié)果影響因素更少,得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。通常會(huì)用這兩種方法來互相確證試驗(yàn)結(jié)果,如果結(jié)果存在較大偏差時(shí),應(yīng)及時(shí)重做試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)問題。