食品微生物檢驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果與分析

◎ 金倩儀

（中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437）

通過室間比對(duì)和盲樣考核是一種提升食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的常見方式，因此，實(shí)驗(yàn)室會(huì)每年定期參加不同的能力驗(yàn)證以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力穩(wěn)步提升。2020 年，中山市食品藥品檢驗(yàn)所參與了由廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局組織的“2020 年食品安全抽檢監(jiān)測(cè)工作承檢機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)”，現(xiàn)將有關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道如下，以其為今后食品微生物檢測(cè)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品

由廣東省微生物分析檢測(cè)中心提供的4 個(gè)不同凍干樣品（菌落總數(shù)1 個(gè)、大腸菌群1 個(gè)以及沙門氏菌2 個(gè)），采用西林瓶真空密閉包裝，分別編號(hào)為A1、E1、S34 和S78。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

磷酸鹽緩沖液、平板計(jì)數(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、緩沖蛋白胨水、TTB 增菌液、SC 增菌液、BS 瓊脂、三糖鐵、革蘭氏染色液、賴氨酸脫羧酶肉湯及氨基酸脫羧酶對(duì)照均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；沙門氏菌屬診斷血清購(gòu)于泰國(guó)S&A 公司；沙門顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉；API 20E 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡和VIDAS沙門氏菌屬篩檢試劑條均購(gòu)于梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2.2 儀器

電子天平、生化培養(yǎng)箱、電子顯微鏡、生物安全柜、均質(zhì)器、VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、mini-VIDAS 全自動(dòng)免疫熒光分析儀。

1.3 檢驗(yàn)環(huán)境

整個(gè)實(shí)驗(yàn)在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，遵循無菌操作原則進(jìn)行。

1.4 檢驗(yàn)方法

菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌的檢驗(yàn)方法如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目和方法列表

1.5 樣品制備

按作業(yè)指導(dǎo)書上樣品處理的操作方法，在生物安全柜內(nèi)無菌操作開啟樣品后，將粉末按步驟溶解于100 mL 磷酸鹽緩沖液作為樣品原液，按相應(yīng)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.6 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)

取25 mL 樣品混懸液于225 mL 的磷酸鹽緩沖液中，用均質(zhì)器拍打混勻，作為第一稀釋度。再取1 mL（1 ∶10）的樣品勻液于9 mL 磷酸鹽緩沖液中，振蕩混勻作為第二稀釋度。按照同樣的步驟做到第八稀釋度。吸取1 mL 稀釋液于無菌平皿內(nèi)倒入平板計(jì)數(shù)瓊脂，（36±1）℃倒置培養(yǎng)（48±2）h[1]。

1.7 大腸菌群計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)

樣品稀釋同1.6。樣品稀釋至第七稀釋度，吸取1 mL稀釋液于無菌平皿內(nèi)倒入VRBA 瓊脂，（36±1）℃倒置培養(yǎng)18 ～24 h。從VRBA 平板上挑取10 個(gè)不同類型的典型可疑菌落，少于10 個(gè)菌落的挑取全部典型可疑菌落。分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，（36±1）℃培養(yǎng)24 ～48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性[2]。

1.8 沙門氏菌的檢驗(yàn)

1.8.1 前增菌

取25 mL 樣品混懸液于225 mL 的緩沖蛋白胨水中，振蕩混勻，于（36±1）℃培養(yǎng)8 ～18 h[3]。

1.8.2 增菌

各取1 mL 輕搖培養(yǎng)過的混勻液于10 mL 的TTB增菌液、SC 增菌液中培養(yǎng)。TTB 增菌液需在（42±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 ～24 h；SC 增菌液需在（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 ～24 h[3]。

1.8.3 分離培養(yǎng)

用無菌接種環(huán)挑取增菌后的TTB 增菌液和SC 增菌液各一環(huán)，分別劃線接種BS 平板，沙門氏顯色培養(yǎng)基平板。兩種平板菌在（36±1）℃環(huán)境下培養(yǎng)，其中BS 平板需要培養(yǎng)40 ～48 h，而沙門顯色培養(yǎng)基平板需要培養(yǎng)18 ～24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的結(jié)果

菌落總數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果如表2，因?yàn)榫淇倲?shù)的計(jì)數(shù)方法是取30 ～300 CFU 菌落數(shù)，只有稀釋度為10-3的平板在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，所以結(jié)果為5×104CFU·mL-1。

表2 菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2 大腸菌群計(jì)數(shù)的結(jié)果

大腸菌群計(jì)數(shù)結(jié)果如表3，因?yàn)榇竽c菌群計(jì)數(shù)方法是取15 ～150 CFU 菌落數(shù)，只有稀釋度為10-2的平板在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，所以通過計(jì)算得到了7 550 CFU·mL-1的檢測(cè)值，經(jīng)過第3 位數(shù)字“四舍五入”的修約后得到了7.6×103CFU·mL-1的結(jié)果。

表3 大腸菌群計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3 沙門氏菌的結(jié)果

2.3.1 樣品S34 的結(jié)果

經(jīng)過mini-VIDAS 進(jìn)行初篩得到了陽(yáng)性的結(jié)果，結(jié)合劃線后的亞硫酸鉍瓊脂平板上生長(zhǎng)黑色有金屬光澤菌落，菌落周圍培養(yǎng)基呈棕色；沙門顯色培養(yǎng)基上生長(zhǎng)淡紫色圓形菌落，以上現(xiàn)象均是沙門氏菌的可疑現(xiàn)象，需要進(jìn)一步做生化試驗(yàn)。三糖鐵瓊脂的結(jié)果為斜面產(chǎn)堿變紅，底層產(chǎn)酸變黃，產(chǎn)氣，產(chǎn)硫化氫；賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果可初步判斷為可疑沙門菌屬。筆者運(yùn)用了API 和VITEK2-Compact 兩種方法進(jìn)行了確證，反饋的結(jié)果都是Salmonellagroup 99%，結(jié)果可見圖1、圖2。同時(shí)還做了血清試驗(yàn)，O 多價(jià)和H 多價(jià)血清均凝集。因此樣品S34 的結(jié)果報(bào)告是檢出了沙門氏菌。

圖1 樣品S34 API20E 的結(jié)果圖

圖2 樣品S34 VITEK2 的結(jié)果圖

2.3.2 樣品S78

經(jīng)過mini-VIDAS 進(jìn)行初篩得到了陰性的結(jié)果，見表4，結(jié)合劃線后的亞硫酸鉍瓊脂平板上未見菌落生長(zhǎng)；沙門顯色培養(yǎng)基上生長(zhǎng)藍(lán)色圓形菌落，以上現(xiàn)象可判斷為未檢出沙門氏菌。因此樣品S78 的結(jié)果報(bào)告是未檢出沙門氏菌。

表4 Mini VIDAS 結(jié)果表

2.4 結(jié)果反饋

2020 年食品安全抽檢監(jiān)測(cè)工作承檢機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果如表5。

表5 2020 年食品安全抽檢監(jiān)測(cè)工作承檢機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)情況表

3 結(jié)論

參加本次室間比對(duì)的實(shí)驗(yàn)室共有44 家，其中有4家的結(jié)果為不滿意，有2 家的結(jié)果為基本滿意，其余的38 家實(shí)驗(yàn)室反饋結(jié)果均為滿意。出現(xiàn)不滿意結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室，有3 家都是在考核沙門氏菌出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果；剩下1 家是在大腸菌群計(jì)數(shù)時(shí)結(jié)果超出考核范圍。沙門氏菌檢驗(yàn)出現(xiàn)的問題可以能是因?yàn)橄竟ぷ鳑]做好、操作人員判斷典型菌落時(shí)出現(xiàn)了偏差而沒有進(jìn)行下一步鑒定或是挑取錯(cuò)誤、樣品前處理時(shí)沒做好導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗等。因此，在對(duì)待可疑樣品時(shí)應(yīng)采取多種方法來鑒定，以免造成錯(cuò)檢或漏檢[4]。

在進(jìn)行沙門氏菌檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)在增菌后通過mini-VIDAS 進(jìn)行初篩，如果出現(xiàn)陽(yáng)性的結(jié)果應(yīng)更加謹(jǐn)慎的對(duì)待該樣品。mini-VIDAS 檢測(cè)方法既快速準(zhǔn)確又可以避免人工檢測(cè)造成的誤差，與傳統(tǒng)方法互補(bǔ)[5]，不過檢驗(yàn)費(fèi)用較為昂貴。在后續(xù)的鑒定中筆者實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用傳統(tǒng)方法同時(shí)再結(jié)合API 法和VITEK2-Compact 兩種方法來確證，API 法能夠提高檢測(cè)效率還能彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足[6]；全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)在實(shí)操中會(huì)更加便利，生化結(jié)果準(zhǔn)確而且快速。雖然相對(duì)人工進(jìn)行的傳統(tǒng)生化試驗(yàn)這兩種方法成本都更高，但是檢測(cè)時(shí)間更短，而且結(jié)果影響因素更少，得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。通常會(huì)用這兩種方法來互相確證試驗(yàn)結(jié)果，如果結(jié)果存在較大偏差時(shí)，應(yīng)及時(shí)重做試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)問題。