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    探究PCR 技術在食品微生物檢測中的應用

    2021-03-11 08:20:04張麗敏劉印歡左麗娜
    現(xiàn)代食品 2021年1期
    關鍵詞:沙門氏菌合格食品

    ◎ 張麗敏,劉印歡,左麗娜,高 騰

    (石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司,河北 石家莊 050000)

    1 食品微生物檢測現(xiàn)狀

    有害微生物是導致食品風險的主要因素。微生物的種類有非常多,并且存在超強的變異性,微生物檢測手段也一直在進步。隨著近幾年分子生物學的快速發(fā)展,具備超強特異性、靈敏度等優(yōu)點的聚合酶鏈式反應(PCR 技術),已經(jīng)成為食品有害微生物檢測的一種常規(guī)方法。目前,很多生物制品公司利用傳統(tǒng)的微生物檢測原理設計了不同的檢測儀器,同時,微生物檢測應當向著快速、自動化方向發(fā)展,PCR 已經(jīng)作為一種新的檢測方法在一些行業(yè)和地區(qū)得到了應用。與傳統(tǒng)的檢測方法相比,PCR 技術檢驗速度快、特異性強、靈敏度高,可以減少對微生物培養(yǎng)的依賴,因此也逐漸成為食品檢驗中的常用方法。

    2 PCR 技術

    PCR 技術,全稱聚合酶鏈式反應,是通過對溫度的控制,從而在體外擴增出大量靶DNA 片段,該技術可將靶DNA 片段在短時間內(nèi)擴增到十萬甚至是百萬倍。PCR 技術具備超強的特異性,它的原理是和DNA 的自然復制過程類似。通過溫度的變化控制DNA 的變性、復性,完成DNA 體外復制。PCR 體外復制過程主要包含以下3 個步驟,①變性。溫度在一定時間內(nèi)保持在94 ℃左右,雙鏈DNA 會解離成單鏈。②復性。將溫度降低,保持在55 ℃左右,引物與單鏈DNA 結合。③延伸。通過TaqDNA 聚合酶的作用,將dNTP 作為反應原材料,合成和模板DNA 互補的一條新鏈。然后重復循環(huán)以上步驟,1 h 內(nèi)即可完成大量DNA 的合成。一般情況下,PCR 技術的檢驗速度比傳統(tǒng)模式更有優(yōu)勢。

    3 應用PCR 進行檢測的微生物菌種類型

    3.1 沙門氏菌

    沙門氏菌是一類主要寄生在人和動物腸道中的微生物,屬于革蘭氏陰性桿菌,其生化反應和人體的抗原結構有關。受污染的水是沙門氏菌感染的主要來源。沙門氏菌會導致人類和動物疾病,人類疾病的主要包括傷寒和敗血癥。沙門氏菌SP-1 的毒性很低,但是在菌體裂解過程中產(chǎn)生的強毒性的內(nèi)毒素,會迅速侵入宿主細胞,從而危害人體健康。目前,invA、invb、hila、FIMA、16S rRNA 是沙門氏菌檢測的主要靶基因。

    3.2 單核增生李斯特菌

    單核細胞增生李斯特菌生長的溫度范圍為2~42 ℃,主要存在于污水和腐爛蔬菜中。它很容易通過食品和糞便傳播。這種微生物是一種細胞內(nèi)寄生細菌。單核細胞增生性李斯特菌感染早期常表現(xiàn)為非典型感冒樣癥狀,臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦炎等,也可能導致流產(chǎn)。單核細胞增生李斯特菌的毒力基因主要包括LIPI-1 和UPI-2,最常用的檢測基因是hly-A、inl-A 和ACT-A。

    3.3 副溶血性弧菌

    副溶血性弧菌是嗜鹽菌,3.5%的NaCl 最合適微生物生長。副溶血性弧菌致病性的關鍵在于它與宿主細胞會產(chǎn)生相互作用。例如,TDH 的微生物可以使人或兔子的紅細胞產(chǎn)生神奈川現(xiàn)象。但是這些基因在環(huán)境中很少被檢測到。

    3.4 阪崎氏腸桿菌

    阪崎腸桿菌培養(yǎng)要求低,不形成孢子。這種微生物和單核增生李斯特菌相類似,其主要危害是引發(fā)人體腦膜炎和敗血癥。這兩種病癥的易感人群為早產(chǎn)兒和低出生體重兒這類抵抗力很弱的新生兒群體,因此其對新生兒的健康威脅還是很大的。阪崎腸桿菌感染不常發(fā)生,但嬰兒感染所帶來的風險是致命的,主要是附著在腸道組織上,通過血腦屏障導致嬰兒腦細胞死亡。阪崎腸桿菌的分子檢測主要是用ITS 基因和16S rRNA 兩種基因進行測定。

    3.5 金黃色葡萄球菌

    目前沒有針對金黃色葡萄球菌的疫苗。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高,空氣、水、灰塵和人畜排泄物都中可能存在。臨床上重要的毒力基因包括luks/f-pv基因和TST 基因。

    4 PCR 檢測中的微生物采樣

    微生物采樣需要做好有效的執(zhí)行方法,確定了采樣方案之后,采樣方法的有效執(zhí)行和樣品的有效性在一定程度上與最后的檢驗結果有關。

    4.1 現(xiàn)場采樣注意事項

    現(xiàn)場采樣過程需要規(guī)范操作,所有的采樣工具都應該是經(jīng)過高壓滅菌的,以避免一切污染,容器需要干燥清潔、大小合適,采樣過程中,應采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化,確保檢樣的代表性。若取樣的是固體食品,也需要根據(jù)相關的管理辦法,不破壞產(chǎn)品的代表性。若取樣的是液體,應當在取樣之前搖晃或者攪拌,將其混合均勻,通常情況下需要將樣品冷卻到0 ~4 ℃,再進行檢驗。

    4.2 生產(chǎn)過程取樣注意事項

    生產(chǎn)過程中的取樣中,應當注意其隨機性和無菌性,以車間的用水取樣為例,要從各個水龍頭上取樣,若進行車間衛(wèi)生監(jiān)測,應當在保證水龍頭表面干燥的基礎上,用無菌稀釋液潤濕棉簽擦拭龍頭表面,若檢測空氣狀況,則在車間的四角和中部分別放置平皿蓋,暴露采樣檢驗。

    5 PCR 技術在食品微生物檢驗中的應用

    以牛奶樣品的基因組提取與檢驗分析為例進行分析,操作步驟應當符合《分子克隆實驗指南》。

    5.1 DNA 提取

    脂肪的密度較小,自然情況下會出現(xiàn)輕微的上浮,為了提升檢驗效率,一般會采用高速離心的方式實現(xiàn)脫脂。取乳品樣品10 mL,將樣品放置到LB 液體培養(yǎng)基中,充分混合,使用機器高速離心,時間設置為5 min,然后去除上層的脂肪。然后放入115 ℃的環(huán)境中高溫滅菌,將微生物全部殺死,避免出現(xiàn)分裂影響實驗結果的問題。在制備的樣品中加入2 μL 蛋白酶,去除蛋白質(zhì),取10 μL 0.5 mol·L-1的EDTANa2溶液加入樣品中,以上流程完成之后,應離心2 min 最后用滅菌生理鹽水清洗。

    5.2 測序

    對分離株和產(chǎn)物的序列結果進行分析,以Gen Bank 公布的序列結果進行比照,分析其微生物的保守區(qū)序列和測序結果是否一致。

    5.3 PCR 檢測效果

    用相同的引物和反應條件在無乳鏈球菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌等DNA 中擴增,如果得不到已知的DNA 擴增片段,則證明了PCR 檢驗的單一性。牛奶樣品的宏基因組的測定,主要進行普通PCR 和qPCR 兩項檢測。以沙門氏菌為例,如果未添加細菌的牛奶加標樣品在連續(xù)梯度稀釋下產(chǎn)生明顯的擴增曲線,最后將樣品放置在置有緩沖蛋白胨水中,在37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng),培養(yǎng)結果表明,部分沙門氏菌污染樣品能被有效檢測。

    6 食品微生物檢測結果判定標準

    經(jīng)PCR 檢測得出單位食品樣品中的微生物含量情況后,需要分析檢測結果數(shù)據(jù),并判定食品樣品是否合格,判斷方法主要有以下2 種。

    6.1 二級法

    二級法是根據(jù)樣品數(shù)量(n)、不合格品儲糧(c)、國家規(guī)定的合格判定標準(m)進行判斷,超過m值即為不合格品。例如生海產(chǎn)品,n=5,c=0,m=102,n=5,即取5 個樣品,c=0 表示該批樣品中未發(fā)現(xiàn)超過m值的樣品,則說明該產(chǎn)品合格。

    6.2 三級法

    二級法是根據(jù)樣品數(shù)量(n)、不合格品儲糧(c)、國家規(guī)定的合格判定標準(m)與判定為合格的菌數(shù)限量(M)進行判斷,m、M這兩個量是相互關聯(lián)的,如果m不符合標準則直接不合格,如果m符合標準但是M不符合標準,則也是不合格。這一標準更加嚴格,以某批產(chǎn)品為例,n=5,c=3,m=101,M=102,這其中可以有小于等于3 個樣品的菌種數(shù)量在m~M,如果有3 個以上的菌種在m~M,或者其中有任何一個超過M值,就說明這批產(chǎn)品不合格。

    7 結語

    總而言之,隨著時代的發(fā)展,食品安全問題應當?shù)玫接行Ы鉀Q,高效精準的食品檢驗技術在當下具有很強的研究意義,而保證食品中微生物的檢驗的科學性、安全性,具有深刻的研究價值,為了達到提升食品安全質(zhì)量標準的目的,應當做好微生物檢測的深度研究,保證食品檢驗工作質(zhì)量,保障大眾的身體健康。

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