野菠蘿果中多糖、黃酮與多酚的含量測定 及抗氧化研究

◎ 成宏斌，李曉波，賈笑英，潘曉翠，王代軍，王帆林

（海南省農(nóng)墾科學(xué)院，海南 ?？?571000）

研究表明，人體的細胞和組織在正常的氧化代謝過程中會產(chǎn)生自由基及活性氧等物質(zhì)，正常情況下，自由基可促進膠原蛋白的合成、提高抗菌能力和調(diào)控基因的表達等。但是，當機體受到外界刺激，如環(huán)境污染、飲食過量和煙酒等因素影響時，易引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，細胞及組織釋放大量的自由基，導(dǎo)致氧化損傷[1-2]，從而誘導(dǎo)心腦血管、癌癥、帕金森和腫瘤等疾病的發(fā)生[3-4]。因此，開發(fā)安全、有效的抗氧化劑就顯得尤為重要，目前市場的抗氧化劑以人工合成和天然產(chǎn)物提取為主，但人工合成的抗氧化劑有毒副作用、穩(wěn)定性差和存在安全隱患，所以，來自植物安全無毒和穩(wěn)定性強的天然抗氧化劑成為人們研究和開發(fā)的熱點[5]。

野菠蘿（Pandanus tectorius Sol.）也稱露兜樹、露兜簕和山菠蘿等，分布于東半球熱帶和亞熱帶地區(qū)，海南擁有較為豐富的露兜樹資源，但常作為綠化和觀賞的樹種。在民間可作為野果食用，同時也具有重要的藥用價值，有平肝清熱、去濕利尿的功效，可治療感冒發(fā)熱、肝火頭疼、痢疾等癥狀[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，野菠蘿果中含有多糖、黃酮、多酚和生物堿等多種天然活性成分，對其研究主要集中在降血糖、降血脂和降血壓等方面，但是關(guān)于野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚的抗氧化研究較少[8-11]。

本研究以野菠蘿果為原料，采用索式提取法提取黃酮、溶劑浸提法提取多糖和多酚3 種天然活性成分，并以DPPH 自由基清除能力和·OH 自由基清除能力為指標，進行多糖、多酚和黃酮的抗氧化活性檢測及比較研究，以期為野菠蘿果的綜合利用提供理論依據(jù)，促進相關(guān)抗氧化功效食品的研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野菠蘿果實，產(chǎn)于海南省海口市屯昌縣。

蘆丁標準品（純度≥98%）、沒食子酸標準品（純度≥98%）、D（+）-無水葡萄糖標準品（純度≥98%），均為分析純，購自上海源葉生物科技有限公司；L（+）-抗壞血酸、六水合三氯化鐵、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、30%過氧化氫和二水合草酸，均為分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、硫酸亞鐵七水合物、水楊酸和福林酚，均為分析純，購自上海源葉生物科技有限公司；苯酚，分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；無水乙醇，分析純，購自廣東光華科技股份有限公司；碳酸鈉，分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7502PC 紫外分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；KE52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHI-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；SXT-06 型索式提取器，上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；20B 風(fēng)冷式萬能粉碎機，河南晟峰瑞樺機械設(shè)備有限公司；ME2002E 電子分析天平、ME204E 精密電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101T 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州予華儀器制造有限公司。

1.3 野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的提取

1.3.1 黃酮的提取

采用索式提取法提取野菠蘿果中的黃酮。精密稱取野菠蘿果粉末4.000 g，以80%乙醇為溶媒，固液比為1 ∶25，提取溫度為90 ℃，提取4 h，最后將提取液定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，即得[12-13]。

1.3.2 多糖的提取

采用溶劑浸提法提取野菠蘿果中的多糖。精密稱取野菠蘿果粉末5.000 g 并置于250 mL 的三角瓶中，以200 mL 的蒸餾水為溶劑，80 ℃水浴浸提2 h，抽濾得澄清液，50 ℃真空旋蒸濃縮后定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，即得[14-15]。

1.3.3 多酚的提取

采用溶劑浸提法提取野菠蘿果中的多酚。精密稱取野菠蘿果粉末2.500 g 并置于250 mL 的三角瓶中，量取100 mL 60%乙醇溶液，60 ℃水浴攪拌2 h，抽濾得上清液并定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，即得[16]。

1.4 野菠蘿果中黃酮含量的測定

1.4.1 蘆丁標準曲線的繪制

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法繪制黃酮的標準曲線[17]，精密稱取蘆丁10.8 mg 用80%乙醇溶解并定容至50.0 mL，其終濃度為0.216 mg·mL-1，冷藏備用。分別精取標準液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL和1.8 mL 于10.0 mL 的容量瓶，依次加入80%的乙醇至2.0 mL，再加入0.4 mL 質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液和0.4 mL 質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置10 min，再加入4.0 mL 質(zhì)量分數(shù)為10%的氫氧化鈉溶液，最后加80%的乙醇定容至10.0 mL。用無水乙醇做空白對照，于510 nm 處測定吸光度，用最小二乘法進行線性擬合，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2。

1.4.2 黃酮含量的測定

準確量取野菠蘿果黃酮提取液2 mL，參照1.3.1蘆丁標準曲線繪制方法處理，測得吸光值并帶入回歸方程，求出野菠蘿果中黃酮的含量。

1.5 野菠蘿果中多糖含量的測定

1.5.1 葡萄糖標準曲線的繪制

采用苯酚硫酸法繪制多糖的標準曲線[18]，精密稱取葡萄糖粉末11.0 mg 置于棕色的容量瓶中，加蒸餾水定容至100 mL，其終濃度為0.11 mg·mL-1。分別量取標準液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL和0.7 mL 于10 mL 的棕色容量瓶中，依次加入蒸餾水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液2 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸7.0 mL，迅速搖勻，放置10 min，沸水浴加熱20 min，放于陰涼處至室溫，用蒸餾水做空白對照，于488 nm 處測定吸光度，以多糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2。

1.5.2 多糖含量的測定

準確量取野菠蘿果多糖提取液1 mL，參照1.4.1葡萄糖標準曲線繪制方法處理，測得吸光值并帶入回歸方程，求出野菠蘿果中多糖的含量。

1.6 野菠蘿果中多酚含量的測定

1.6.1 沒食子酸標準曲線的繪制

采用福林-酚比色法繪制多酚的標準曲線[19]，精確稱量沒食子酸標準品10.0 mg，去離子水超聲溶解并定容至100 mL，其終濃度為0.1 mg·mL-1，冷藏備用。分別移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL沒食子酸溶液，去離子水補充至1 mL，分別加入1 N福林酚試劑1 mL，室溫反應(yīng)3 min，在分別加入10%碳酸鈉溶液1.0 mL，30 ℃條件下反應(yīng)30 min，于760 nm處測定吸光度，用最小二乘法進行線性擬合，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2。

1.6.2 多酚含量的測定

準確量取野菠蘿果多酚提取液1 mL，參照1.5.1沒食子酸標準曲線繪制方法處理，測得吸光值并帶入回歸方程，求出野菠蘿果中多酚的含量。

1.7 抗氧化實驗

1.7.1 DPPH 自由基清除率的測定

參照GONG Jinyan 等的方法[20]，將野菠蘿果供試液（黃酮、多糖和多酚）配制成不同濃度的樣品溶液（0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1），精密移取2 mL 于試管中，加入0.25 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液2 mL，混勻。室溫靜置30 min，于517 nm 波長處測量吸光度，記為A1，2 mL 樣品溶液與2 mL 無水乙醇混合均勻，測量吸光度，記為A2，2 mL DPPH 乙醇溶液與2 mL 無水乙醇溶液混合均勻，測量吸光度，記為A3，用維生素C（Vc）作為陽性對照，設(shè)3 個平行試驗，按式（1）計算DPPH 清除率，取均值±標準方差。

1.7.2 ·OH 自由基清除能力的測定

參照CHEN Ling 等的方法并稍作修改[21]，取2.0 mL 不同濃度的野菠蘿果供試液（0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1）加入到比色管中，再依次分別加入2.0 mL 濃 度 為8.0 mmol·L-1的FeSO4溶 液，2.0 mL濃 度 為8.0 mmol·L-1的H2O2溶 液 和2.0 mL 濃 度 為8.0 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液混合均勻，避光在37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫后離心，最后在510 nm測上清液的吸光值，記為Ai，用無水乙醇替換水楊酸-乙醇溶液測定其吸光值為Aj，用蒸餾水替換檢測液測定其吸光值為A0。以Vc 作為陽性對照，設(shè)3 個平行試驗，按式（2）計算·OH 自由基清除率，取均值±標準方差。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0 和Origin8.0 進行數(shù)據(jù)處理、繪圖及分析，每個試驗均在相同水平條件下進行3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的含量測定

按照1.3、1.4 和1.5 方法所述標準曲線的繪制，根據(jù)硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法、苯酚硫酸法和福林-酚比色法分別測定了野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚含量的標準曲線，如圖1 ～圖3 所示。

從上述結(jié)果分析得出，黃酮、多糖和多酚的標準曲線線性擬合效果較佳，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.990。因此，從上述方法得出野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的含量分別為2.30 mg·g-1、4.32 mg·g-1和1.28 mg·g-1。

圖1 黃酮的標準曲線圖

圖2 多糖的標準曲線圖

圖3 多酚的標準曲線圖

2.2 野菠蘿果中黃酮多糖和多酚的抗氧化研究結(jié)果

Andriani 等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，野菠蘿果不同溶劑的提取物均具有較好的抗氧化能力，但是關(guān)于野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚的抗氧化功能及綜合對比的研究還未見報道[22]。因此，本研究以DPPH 自由基清除能力和·OH 自由基清除能力為參考指標對野菠蘿3 種活性物質(zhì)進行抗氧化活性檢測。

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基是一種人工合成、比較穩(wěn)定的非生理自由基，在乙醇溶液中呈紫紅色，當向DPPH 自由基溶液中加入抗氧化物質(zhì)時，紫紅色的DPPH 自由基溶液被還原成黃色，其DPPH 清除率越大，表明抗氧化能力越強，經(jīng)常用于評價化學(xué)物質(zhì)或食品的抗氧化能力[23-25]。本研究以Vc 作陽性對照，對野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚3 種活性物質(zhì)對DPPH 清除能力進行綜合測定并比較，試驗結(jié)果如圖4 所示。

圖4 三種活性物質(zhì)對DPPH 清除能力圖

從圖4 可以看出，野菠蘿果中黃酮、多糖、多酚和Vc 均對DPPH 有顯著的清除能力，且存在著量效關(guān)系，隨著濃度的逐漸增加，DPPH 清除能力顯著提高。當濃度達到0.02 mg·mL-1時，黃酮、多糖、多酚和Vc 對DPPH 清除率逐漸開始趨于平緩，同時發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，可以看出Vc 清除率高于黃酮、多糖和多酚，且在同一濃度下多糖的清除率顯著高于黃酮和多酚的清除率，初步說明野菠蘿果中多糖具有較強的抗氧化能力，黃酮和多酚具有較好的抗氧化能力。其中野菠蘿果多糖的DPPH 自由基清除率的IC50為（0.010±0.288）mg·mL-1，黃酮的DPPH 自由基清除率的IC50為（0.017±0.283）mg·mL-1，多酚的DPPH自由基清除率的IC50為（0.025±0.266）mg·mL-1，進一步說明野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚有著較好的DPPH 清除能力且多糖的清除效果最佳。

2.2.2 ·OH 自由基清除能力

·OH 自由基具有很強的抗氧化能力且十分活躍，能與大多數(shù)物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致細胞失活或壞死，抗氧化劑能夠有效的清除·OH 自由基的產(chǎn)生量，從而抑制氧化的發(fā)生[26-27]。本試驗測定了野菠蘿果中黃酮、多糖和多酚3 種活性物質(zhì)對·OH 自由基的清除能力并進行相互比較，以Vc 作陽性對照，其結(jié)果如圖5 所示。

圖5 3 種活性物質(zhì)對·OH 自由基清除能力圖

從圖5 結(jié)果表明，在試驗濃度范圍內(nèi)，3 種活性物質(zhì)對·OH 自由基清除能力隨著濃度的增大逐漸增加，Vc 的·OH 自由基清除率高于多糖的清除率、顯著高于黃酮和多酚的清除率。同時，在相同濃度下，黃酮和多酚的清除率效果相差不大，而多糖的清除率顯著高于黃酮和多酚的·OH 自由基清除率，說明野菠蘿果中多糖具有較強的抗氧化能力，黃酮和多酚具有較好的抗氧化能力。當濃度達到0.1 mg·mL-1，3 種活性物質(zhì)的清除率均達到最大值，多糖對·OH 自由基清除 率 達 到65.15%，IC50為（0.041±0.229）mg·mL-1，黃 酮 對·OH 自 由 基 清 除 率 達 到21.21%，IC50為（0.400±0.032）mg·mL-1，多酚對·OH 自由基清除率達 到20.23%，IC50為（0.382±0.039）mg·mL-1。由此可見，多糖對·OH 自由基的清除效果高于多酚和黃酮的清除效果，具很強的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本研究對野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚進行提取并檢測其含量，同時用兩種方法測定野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚的抗氧化活性并進行比較研究。結(jié)果表明，野菠蘿果中多糖、黃酮和多酚均有著較好的抗氧化活性，且多糖的抗氧化活性較高于黃酮和多酚的抗氧化活性。野菠蘿果中多糖清除DPPH 的IC50為（0.010±0.288）mg·mL-1、清 除·OH 的IC50為（0.041±0.229）mg·mL-1，多糖的抗氧化性較高于黃酮和多酚的抗氧化性。綜上所述，野菠蘿果可作為一種安全、綠色的天然抗氧化物的來源，在食品、化妝品和醫(yī)藥等方面具有較高的應(yīng)用價值和較好的市場前景。