補腎健脾方對卵巢早衰大鼠下丘腦-垂體-性腺軸功能的影響

朱景茹，陳姝婷，卓澤偉，張 斐，王維斌，王 洋*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證研究基地，福建 福州350122；2.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識重點實驗室，福建 福州350122）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）為多種因素導(dǎo)致的40歲之前女性卵巢儲備能力降低的常見婦科內(nèi)分泌疾病，以高促卵泡激素和低雌二醇激素水平為主要特征。POF的發(fā)病率逐年上升，約占成年女性的1%～3%，閉經(jīng)患者甚至達(dá)到2%～10%，是目前女性生育力下降甚至喪失的主要原因之一。本病患者自然妊娠率低于15%，嚴(yán)重影響POF患者生殖健康［1-2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用激素替代療法來保護剩余卵巢功能，建立人工周期，然而長期使用激素會大大增加罹患婦科腫瘤、靜脈栓塞性疾病等風(fēng)險，且發(fā)病風(fēng)險性與服藥劑量及療程呈正相關(guān)［3］。隨著近年來對POF的深入研究表明，中醫(yī)藥在整體觀指導(dǎo)下進行辨證論治，能夠有效改善卵巢卵泡發(fā)育情況，對POF患者有很好的防治作用。國醫(yī)大師夏桂成和朱南孫一致認(rèn)為脾腎虛弱、天癸虧耗是POF發(fā)病的主要病機，多采用補腎健脾法進行治療，臨床療效突出［4-5］。有報道指出：補腎健脾類中藥能夠改善卵巢血液供應(yīng)，促進各級卵泡生長發(fā)育，恢復(fù)卵巢儲備功能，存在類雌激素樣調(diào)節(jié)作用［6］。因此，本研究擬觀察補腎健脾方對POF大鼠卵巢組織形態(tài)、內(nèi)分泌水平等方面的影響，探討補腎健脾方治療POF大鼠的可能分子機制，為中醫(yī)臨床診療提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物2月齡SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［許可證編號：SCXK（滬）2017-0005，合格證號：20170005005273］。大鼠分籠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，每籠5只，控制室溫20～22℃，相對濕度50%，自然光暗周期，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，稱取體質(zhì)量后開始實驗。整個實驗過程對動物的處置遵循2006年國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 試劑和儀器 環(huán)磷酰胺（南京建成生物工程研究所，批號：X22D8Y51136）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20190228）；大鼠促卵泡素（FSH）、雌二醇（E2）、促性腺激素釋放激素（GnRH）、抗苗勒管激素（AMH）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：20190506A、20190603A、20190605A）；RNA抽提試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：20190507）；Trizol（美國Thermo公司，批號：204210）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、iTaq Univer SYBR Green SMX 500（美國Bio-Rad公司，批號：1708891、1725121）；絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的引物序列由福州市鼓樓區(qū)鼎國生物技術(shù)有限公司合成；QuantsStudio 6型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Nanodrop 2000型微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）；Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Axio Imager A2型正置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）。

1.3 藥物制備 補腎健脾方為左歸飲（《景岳全書》）與四君子湯（《太平惠民和劑局方》）合方，處方：熟地黃9 g，人參9 g，白術(shù)9 g，茯苓13.5 g，山藥6 g，枸杞子6 g，山茱萸6 g，炙甘草9 g。中藥飲片由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供，每周常規(guī)煎煮后濃縮至含生藥量0.709 g/mL，3層干凈紗布過濾3遍后用EP管分裝，凍存于-20℃冰箱。

2 實驗方法

2.1 模型建立與評價 將具有正常動情周期的34只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組10只，造模組24只。正常組不予處理，造模組大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，首劑量50 mg/（kg·d），再以8 mg/（kg·d）連續(xù)注射14 d，建立POF大鼠模型［7］。從造模第7天起行陰道脫落細(xì)胞涂片，連續(xù)2個周期觀察造模組大鼠動情周期變化。造模組大鼠動情期延長，甚至持續(xù)處于動情期，涂片呈現(xiàn)大量無核角化上皮細(xì)胞，動情周期紊亂則提示模型建立成功。造模結(jié)束后剔除5只不成模大鼠，其余大鼠均造模成功。

2.2 動物分組及干預(yù) 將成模的19只大鼠隨機分為模型組10只，補腎健脾組9只。按大鼠給藥劑量為人的6.3倍換算［8］，補腎健脾組予補腎健脾方10 mL/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，共4周。

2.3 標(biāo)本采集 動物實驗結(jié)束后，禁食不禁水12 h，稱取大鼠體質(zhì)量，用2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉。取腹主動脈血，室溫靜置1 h，低溫冷凍離心機3 000 r/10 min離心，抽提血清，-20℃冰箱凍存；斷頭處死后，分離雙側(cè)卵巢，剝離干凈脂肪、結(jié)締組織，以4℃PBS緩沖液清洗殘血，濾紙濾干，一側(cè)卵巢固定于4%多聚甲醛溶液，于4℃冰箱保存，另一側(cè)卵巢放入凍存管，-80℃冰箱保存。

3 指標(biāo)檢測

3.1 動情周期觀察 中藥干預(yù)最后4 d，每日早晨10∶00采集大鼠陰道脫落細(xì)胞。無菌棉簽用生理鹽水蘸濕后輕柔插入大鼠陰道轉(zhuǎn)動2圈取出，均勻涂抹于提前編號的載玻片上，95%乙醇固定后HE染色，光鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞涂片，判斷動情周期變化。

3.2 卵巢組織病理形態(tài) 將固定于4%多聚甲醛溶液中的卵巢取出，紗布塊扎牢后流水沖洗6 h，行梯度乙醇脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、拷片，經(jīng)脫蠟、水化、封片后光鏡下觀察3組大鼠卵巢卵泡數(shù)量及形態(tài)學(xué)變化。

3.3 體質(zhì)量增量與卵巢指數(shù) 根據(jù)3組大鼠實驗前后體質(zhì)量差值計算體質(zhì)量增量。用精密電子天平稱取卵巢濕重，計算卵巢指數(shù)。

卵巢指數(shù)/%＝卵巢濕重/大鼠體質(zhì)量×100%

3.4 血清FSH、E2、GnRH、AMH含量檢測 上述備用血清按照酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒說明書操作后，放入酶標(biāo)儀用450 nm波長測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本實際濃度，檢測FSH、E2、GnRH、AMH的含量。

3.5 卵巢組織Akt、mTOR mRNA相對表達(dá)量檢測

用Trizol抽提卵巢組織RNA，測定純度和濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行實時熒光定量PCR（q-PCR）檢測。反應(yīng)條件：95℃2 mim預(yù)變性；95℃15 s變性，60℃1 min退火延伸，40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)部參照，2-△△ct法計算Akt和mTOR mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

3.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 23.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗。

4 結(jié) 果

4.1 3組大鼠動情周期比較 正常組大鼠動情周期各期循環(huán)時間基本一致；模型組大鼠動情周期呈現(xiàn)紊亂狀態(tài)，動情期延長，失去規(guī)律性變化；補腎健脾組大鼠動情周期縮短且趨向于規(guī)律，動情期無核角化上皮細(xì)胞數(shù)量增多。見圖1。

圖1 3組大鼠動情周期陰道脫落細(xì)胞HE染色圖（×100）

4.2 3組大鼠卵巢組織形態(tài)比較 正常組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)清晰，可見各級發(fā)育良好的卵泡，顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液含量多，血管豐富，閉鎖卵泡很少；模型組大鼠卵巢體積較小，卵泡內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，閉鎖卵泡數(shù)量較多，生長卵泡數(shù)量少，未見成熟卵泡，黃體較多；補腎健脾組大鼠卵巢組織病理形態(tài)明顯改善，可見少量閉鎖卵泡，生長卵泡與成熟卵泡數(shù)量增加，卵泡液含量增多。見圖2。

圖2 3組大鼠卵巢組織HE染色圖（×100）

4.3 3組大鼠體質(zhì)量增量及卵巢指數(shù)比較 見表2。

表2 3組大鼠體質(zhì)量增量與卵巢指數(shù)比較（±s）

表2 3組大鼠體質(zhì)量增量與卵巢指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

卵巢指數(shù)/%0.036±0.007 0.029±0.0091）0.037±0.0072）組別正常組模型組補腎健脾組n 10 10 9體質(zhì)量增量/g 53.90±13.51 40.24±10.501）45.63±9.03

4.4 3組大鼠血清FSH、E2、GnRH、AMH含量比較見表3。

4.5 3組大鼠卵巢組織Akt、mTOR mRNA相對表達(dá)量比較見圖3。

5 討 論

POF根據(jù)其閉經(jīng)、不孕、類圍絕經(jīng)期綜合征的臨床表現(xiàn)歸屬中醫(yī)“血枯”“經(jīng)水早斷”等范疇。先天腎精與脾胃運化的水谷精微皆為卵巢、卵泡發(fā)育過程中關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)，若脾腎虧虛，沖任失調(diào)，天癸耗竭，則卵巢卵泡無以為養(yǎng)，經(jīng)水漸斷，醞釀成病。補腎健脾方具有補腎健脾、益氣滋陰的功效，是臨床治療POF的常用方劑，療效顯著，然而作用機制尚不明確。

表3 3組大鼠血清FSH、E2、GnRH和AMH含量比較（±s）

表3 3組大鼠血清FSH、E2、GnRH和AMH含量比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

AMH/（pmol/L）2 338.60±299.53 800.83±310.011）1 544.17±725.402）組別正常組模型組補腎健脾組n 10 10 9 FSH/（mIU/mL）5.92±0.92 11.98±1.161）8.91±2.742）E2/（pg/mL）60.62±6.90 27.80±5.551）49.23±6.422）GnRH/（mIU/mL）45.84±9.66 96.06±8.041）68.77±8.422）

動情周期變化與激素水平高低關(guān)系密切，激素分泌水平又能直接影響卵泡生長情況和卵巢組織形態(tài)。AMH是由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的二聚體糖蛋白，可有效抑制卵泡過速發(fā)育，防止卵泡過早消耗［9］，血清AMH水平是預(yù)測POF較準(zhǔn)確的內(nèi)分泌指標(biāo)。AMH的生成和FSH活性之間存在互為依賴的密切關(guān)系，可以反映早期卵泡數(shù)量，用于評估女性卵巢儲備功能。本實驗結(jié)果顯示：POF大鼠卵巢指數(shù)與AMH含量均下降，動情周期延長、紊亂，閉鎖卵泡數(shù)量增加，反映出卵巢儲備能力低下；補腎健脾方治療后，卵巢指數(shù)與AMH的含量升高，動情周期趨于正常，卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)改善，生長卵泡數(shù)量增多。這提示補腎健脾方能促進卵巢形態(tài)與功能的恢復(fù)，促進生長卵泡發(fā)育，提高卵巢儲備功能。

下丘腦-垂體-性腺軸（HPG軸）是女性生殖系統(tǒng)至關(guān)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)體系，E2是HPG軸上非常重要的性激素且受到FSH調(diào)節(jié)，有助于生殖器官的發(fā)育和卵泡成熟。下丘腦脈沖式分泌GnRH，直接促進垂體前葉促性腺激素分泌，二者共同調(diào)節(jié)E2水平以達(dá)到調(diào)控卵巢功能的目的［10］。PI3K/Akt/mTOR信號通路對HPG軸具有調(diào)控作用，Akt是PI3K的下游效應(yīng)因子，同時也是mTOR激活的關(guān)鍵性因子，其通過磷酸化的mTOR絲氨酸448位點來激活mTOR，mTOR被激活后刺激E2分泌，以維持卵巢正常組織形態(tài)與功能［11-12］。本實驗結(jié)果顯示：POF大 鼠FSH、GnRH水平升高，E2含量與Akt、mTOR mRNA表達(dá)均降低；補腎健脾方治療后，大鼠FSH、GnRH水平下降，Akt、mTOR mRNA表達(dá)均增強，促使E2趨向正常。這說明補腎健脾方能夠顯著調(diào)節(jié)POF大鼠HPG軸功能，影響激素釋放水平，對POF大鼠具有明顯的治療效應(yīng)。

綜上所述，補腎健脾方可以調(diào)節(jié)POF大鼠血清FSH、E2、GnRH、AMH激素水平，促進Akt、mTOR mRNA表達(dá)，從而改善卵泡發(fā)育情況，促使成熟卵泡增加，提高卵巢儲備功能，其作用機制可能與上調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路中下游基因Akt、mTOR mRNA表達(dá)，進而調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸功能相關(guān)。