人KIBRA基因真核表達載體的構(gòu)建及生物信息學分析

王 博，宋少苒，田碧霞，楊澤健，張 妙，高小倩，孫 偉，蔣依娜，劉培軍

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，陜西西安 710061；2. 陜西省腫瘤精準醫(yī)學重點實驗室，陜西西安 710061；3. 西安交通大學醫(yī)學部，陜西西安 710061；4. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院病理科，陜西西安 710061)

Hippo信號通路主要通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)增殖和凋亡相關(guān)基因，進而控制細胞接觸抑制、組織大小、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[1]。該通路的核心機制是Lats1/2磷酸化下游效應(yīng)分子YAP/TAZ使其被泛素化降解，從而抑制其入核調(diào)控下游靶基因的表達。目前，已有大量的研究表明，Hippo信號通路在人類惡性腫瘤中明顯失調(diào)，且與患者較差的預后相關(guān)[2]。同時，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路上游膜蛋白CRB3可以通過穩(wěn)定腎臟腦蛋白(human kidney and brain protein, KIBRA)參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[3]，但具體的相互作用機制和KIBRA在乳腺癌中的作用機制仍不是十分清楚。因此，KIBRA的克隆和表達對研究Hippo信號通路上游信號及在乳腺癌中的作用機制具有重要意義。

本研究從人乳腺癌細胞系MCF7的總RNA中特異性PCR擴增KIBRA編碼區(qū)全長序列，并將其克隆到真核表達載體pCMV-Blank上，通過測序鑒定以及轉(zhuǎn)染MCF7細胞驗證該載體的表達情況，同時分析KIBRA的蛋白物理特性、翻譯后修飾情況、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，為全面了解Hippo信號通路上游重要分子的特性提供基礎(chǔ)，也為研究KIBRA在乳腺癌中的分子機制奠定良好的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細胞系載體質(zhì)粒pCMV-Blank(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；宿主菌E.coliDH5α[天根生化科技(北京)有限公司]；人乳腺癌細胞系(MCF7細胞)為實驗室受贈保存細胞，使用含100 mL/L胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，F(xiàn)BS(Gibco公司)，Trizol(Invitrogen公司)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真PCR酶(Thermo公司)，限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和ApaⅠ、T4 DNA連接酶(NEB公司)，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒 [天根生化科技(北京)有限公司]，轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche公司)，實時定量PCR試劑SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa公司)，NC膜(Pall公司)，兔抗人KIBRA多克隆抗體(CST公司)，HRP標記山羊抗兔IgG抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，ECL試劑盒(Pierce公司)，相關(guān)引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 KIBRA基因PCR擴增消化MCF7細胞，使用Trizol按照說明書提取總RNA，Nano Drop進行定量取5 μg總RNA，按照RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中人的KIBRA(NM_001161661.2)CDs區(qū)序列，運用Oligo 7軟件設(shè)計特異性PCR引物，并在上游引物引入EcoRⅤ酶切位點和保護堿基，5′-CCGGATATCATGCCCCGGCCGGAGCTGCC-3′；下游引物引入ApaⅠ酶切位點和保護堿基，5′-CGCGGGCCCTTAGACGTCATCTGCAGAGA-3′。以該cDNA作為PCR模板，通過上述引物克隆人KIBRA全長CDs區(qū)的序列。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Mix 25 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 3.5 min，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物長度3 378 bp，通過8 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定分析。

1.4 構(gòu)建KIBRA真核表達載體用DNA凝膠回收試劑盒將大小正確的PCR產(chǎn)物進行膠回收，再用限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和ApaⅠ雙酶切回收的PCR產(chǎn)物和真核表達載體pCMV-Blank，37 ℃雙酶切2 h。膠回收經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳后的雙酶切產(chǎn)物，按照KIBRA與載體pCMV-Blank摩爾比3∶1的量，用T4 DNA連接酶將KIBRA連接到真核表達載體pCMV-Blank多克隆位點上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，并涂布于含有卡那霉素(Kan)的LB平板上。次日挑取單克隆菌落，接種于液體LB(KanR)培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)基渾濁后進行菌液PCR，對克隆的KIBRA基因進行鑒定；將鑒定陽性的單克隆菌液提取質(zhì)粒，再通過限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和ApaⅠ雙酶切驗證。隨后將菌液PCR和雙酶切鑒定成功的陽性KIBRA克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。對測序結(jié)果進行BLAST比對分析，并將序列正確的陽性克隆載體命名為pCMV-KIBRA。

1.5 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV-KIBRA使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒pCMV-Blank和pCMV-KIBRA。將對數(shù)生長期的乳腺癌MCF7細胞按照7×105/孔的密度接種6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。使用轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP將無內(nèi)毒素質(zhì)粒pCMV-Blank和pCMV-KIBRA分別轉(zhuǎn)染MCF7細胞，同時設(shè)置對照組，即未加質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。

1.6 分析載體pCMV-KIBRA表達情況將轉(zhuǎn)染48 h的細胞經(jīng)預冷PBS沖洗后，分別加入Trizol提取總RNA及RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，使用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ進行實時定量PCR，其中引物KIBRA：上游5′-AGCTCCAAGTATGACCCTGAG-3′，下游 5′-AAAGCCACGCTCTTTGAACTG-3′，產(chǎn)物大小123 bp；GAPDH：上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′，產(chǎn)物大小101 bp。qPCR反應(yīng)體系：cDNA模板0.5 μL，上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Mix 12.5 L，ddH2O 10 μL。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。將總蛋白進行定量，再按照每孔50 μg的上樣量進行8% SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗兔抗人KIBRA多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗HRP標記山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光并使用成像系統(tǒng)進行照相和分析。

1.7 KIBRA蛋白特性分析使用在線的ProtParam tool軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對KIBRA蛋白的理化性質(zhì)進行分析。使用PhosphoSitePlus軟件(https://www.phosphosite.org//homeAction.action)對KIBRA蛋白的磷酸化、乙?；头核鼗稽c進行分析。使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對KIBRA蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析[4]。使用SWISS-MODEL軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/)對KIBRA蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行分析。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 人KIBRA編碼區(qū)的克隆以人MCF7細胞的cDNA為模板，PCR擴增KIBRA全長編碼區(qū)序列，并將PCR產(chǎn)物通過8 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明，PCR得到大小約3 400 bp的基因條帶(圖1)，與預期的大小一致。

圖1 人KIBRA編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of PCR fragment with CDs of human KIBRAM：1 kb marker；1,2：人KIBRA編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。

2.2 真核表達載體pCMV-KIBRA的構(gòu)建將大小正確的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收和雙酶切過程，連接到pCMV-Blank載體多克隆區(qū)，轉(zhuǎn)化宿主細胞后挑起單克隆菌落進行如下鑒定。真核表達載體pCMV-KIBRA結(jié)構(gòu)示意圖(圖2A)。將單克隆菌液進行菌液PCR鑒定，結(jié)果表明，菌液PCR得到大小約3 400 bp的基因條帶(圖2B)，與KIBRA理論大小相同。將菌液PCR鑒定陽性的菌液提取質(zhì)粒，并進行EcoRⅤ和ApaⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，雙酶切得到大小分別約3 400 bp和4 300 bp的兩條條帶(圖2C)，與預期KIBRA和載體pCMV-Blank大小一致。將雙酶切鑒定陽性克隆送至基因檢測公司進行測序，比對結(jié)果表明，pCMV-KIBRA中KIBRA序列與人KIBRA編碼區(qū)序列完全相同。

圖2 重組質(zhì)粒pCMV-KIBRA結(jié)構(gòu)示意圖及菌液PCR和雙酶切鑒定Fig.2 Structure schematic and identification of recombinant plasmid pCMV-KIBRA with colony PCR and restriction enzyme digestion

2.3 mRNA和蛋白水平檢測KIBRA表達情況將對照質(zhì)粒pCMV-Blank和重組質(zhì)粒pCMV-KIBRA分別轉(zhuǎn)染MCF7細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細胞總RNA和總蛋白，通過時實定量PCR和Western blottting分別檢測KIBRA表達情況。時實定量PCR檢測結(jié)果表明，pCMV-KIBRA轉(zhuǎn)染組相比未轉(zhuǎn)染組，KIBRA的mRNA水平明顯升高，且升高了13.83倍(圖3A)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而未轉(zhuǎn)染組與pCMV-Blank轉(zhuǎn)染組比較無統(tǒng)計學意義。Western blotting檢測結(jié)果同樣表明，pCMV-KIBRA轉(zhuǎn)染組KIBRA的蛋白水平明顯升高(圖3B)，且升高了4.57倍(圖3C)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。該部分結(jié)果充分說明，構(gòu)建的真核表達載體pCMV-KIBRA可在細胞中瞬時過表達目的基因KIBRA。

圖3 轉(zhuǎn)染后KIBRA的mRNA和蛋白表達水平檢測Fig.3 Detection of mRNA and protein expressions of KIBRA after transfectionA：mRNA水平檢測KIBRA表達情況；B：蛋白水平檢測KIBRA表達情況；C：蛋白水平檢測KIBRA表達情況的統(tǒng)計分析；未轉(zhuǎn)染組、pCMV-Blank轉(zhuǎn)染組分別與pCMV-KIBRA轉(zhuǎn)染組相比，**P<0.01，***P<0.001。A：重組質(zhì)粒pCMV-KIBRA結(jié)構(gòu)示意圖；B：重組質(zhì)粒pCMV-KIBRA菌液PCR鑒定；C：重組質(zhì)粒pCMV-KIBRA雙酶切鑒定。M：1 kb marker；1～4：載體pCMV-KIBRA單克隆菌液PCR產(chǎn)物，其中2號和4號為陽性克??；5、 6：2號和4號陽性克隆質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果。

2.4 KIBRA蛋白特性及結(jié)構(gòu)預測通過在線軟件ProtParam tool對KIBRA蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，人KIBRA蛋白是由1 119個氨基酸組成，分子質(zhì)量為125 904.55，理論的等電點為5.65，降解的半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為58.64，脂肪族指數(shù)為76.64，平均親水值為-0.682。通過在線軟件PhosphoSitePlus對KIBRA蛋白的磷酸化、乙?；头核鼗稽c進行分析，結(jié)果表明，共有52個磷酸化位點，包括35個絲氨酸(S141、S144、S208、S241、S255、S427、S434、S438、S523、S525、S530、S533、S535、S539、S542、S548、S623、S626、S651、S815、S834、S841、S876、S899、S922、S927、S931、S945、S947、S962、S967、S974、S975、S978、S1081)、5個酪氨酸(Y128、Y781、Y786、Y788、Y938)和12個蘇氨酸(T284、T527、T532、T837、T893、T895、T901、T912、T923、T929、T951、T1006)磷酸化位點，1個乙?；稽c(K154)，5個泛素化位點(K117、K161、K324、K347、K379)(圖4A)。通過在線軟件SOPMA對KIBRA蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，α-螺旋530處、外延伸鏈104處、β-折疊49處和無規(guī)則卷曲436處，分別占其二級結(jié)構(gòu)的47.36%、9.29%、4.38%和38.96%，故其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。同時KIBRA蛋白結(jié)構(gòu)中包含兩個WW結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸6～39位和53～86位，一個C2樣結(jié)構(gòu)域(C2-like domain)位于658～781位，三個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil motif)，分別位于107～193位、293～431位和1 001～1 032位(圖4B)。通過軟件SWISS-MODEL對KIBRA蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行分析，2.2?的X射線結(jié)果表明，KIBRA蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲[5](圖4C)。

圖4 人KIBRA蛋白修飾化位點、結(jié)構(gòu)域示意圖和三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Modified sites, domain schematic diagram and 3D constitution of human KIBRA proteinA：人KIBRA蛋白修飾化位點示意圖；B：人KIBRA蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖；C：人KIBRA蛋白三級結(jié)構(gòu)圖。

3 討 論

KIBRA作為支架蛋白參與多種重要的細胞功能和進程，如細胞骨架的調(diào)控、MAPK(mitogen-activated protein kinase)的活化以及細胞移動方向的調(diào)節(jié)等[6-7]。2003年首次在腦組織中發(fā)現(xiàn)KIBRA，其主要表達于細胞質(zhì)，并在細胞核周圍有明顯聚集[8]。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，KIBRA屬于進化保守的WWC家族蛋白，由2個WW結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、C2樣結(jié)構(gòu)域、谷氨酸富集區(qū)(glutamic acid stretch)以及PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成[6]。在腫瘤研究中，乳腺上皮細胞中KIBRA與DDR1(discoidin domain receptor 1)結(jié)合，促進膠原誘導的MARK信號通路活化[9]。乳腺上皮細胞系MCF10A中CRB3調(diào)控KIBRA的蛋白穩(wěn)定性，進而參與Hippo信號通路[3]，其主要是通過WW結(jié)構(gòu)域和NF2、Lats2相互結(jié)合影響Hippo信號通路[8]。同時敲低KIBRA的表達，可下調(diào)磷酸化Lats和YAP導致EMT的發(fā)生[10]。MDA-MB-231乳腺癌細胞系中，Notch3通過上調(diào)KIBRA蛋白水平抑制EMT過程[11]。KIBRA的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域可結(jié)合Aurora A/B促使 KIBRA磷酸化以及結(jié)合PP1促使KIBRA去磷酸化[12]，但目前腫瘤中KIBRA磷酸化的機制研究較少。C2樣結(jié)構(gòu)域是KIBRA二聚化重要結(jié)構(gòu)域[13]。腫瘤組織中低表達CDC14A，在CDC14A敲除細胞系中過表達KIBRA可恢復細胞運動的表型[14]，其原因可能是KIBRA的PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與極性蛋白PATJ結(jié)合，被招募到細胞膜邊緣參與細胞的運動[15]。因此，KIBRA可被認為是抑癌基因，但在腫瘤中的具體分子機制尚不清楚，還值得深入探究。

本研究成功構(gòu)建了真核表達載體pCMV-KIBRA，并建立了在細胞水平瞬時過表達KIBRA的方法，在mRNA和蛋白水平進行了驗證。同時通過生物信息學網(wǎng)站分析了KIBRA蛋白的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)，并總結(jié)了KIBRA的磷酸化、乙酰化和泛素化位點。KIBRA克隆和真核表達載體的構(gòu)建將為細胞水平研究KIBRA生物學功能提供基礎(chǔ)，翻譯后修飾的分析將為其在乳腺癌中的分子機制研究，特別是磷酸化KIBRA的功能研究提供了保障。