大骨節(jié)病和骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解差異

武世勛，吳翠艷，郭 雄

(1. 西安交通大學(xué)第三附屬醫(yī)院，陜西西安 710068：2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，國家衛(wèi)健委微量元素與地方病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省絲路區(qū)域地方病與健康促進(jìn)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西西安 710061)

大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease, KBD)是一種關(guān)節(jié)軟骨早期發(fā)育異常，后期以損害為主的地方性骨關(guān)節(jié)疾病。目前研究主要集中于軟骨細(xì)胞過度死亡和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分解。前期研究發(fā)現(xiàn)，大骨節(jié)病患者尿液中膠原蛋白主要成分羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)和Ⅱ型膠原羧基端肽(C-telopeptide of type Ⅱcollagen, CTX-Ⅱ)含量明顯增加[1]，提示軟骨組織中膠原過度降解。成人大骨節(jié)病的發(fā)生發(fā)展與血清一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)水平的升高及透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)水平的降低有關(guān)[2]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎和大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α明顯增加[3]；應(yīng)用透明質(zhì)酸治療可降低這兩種炎性因子的分泌。低硒聯(lián)合T2毒素下調(diào)Ⅱ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-13和組織金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)的表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨損傷[4]。這一研究結(jié)果可以解釋低硒和/或T2毒素等已知環(huán)境因素可以導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分解。目前，尚未見到有關(guān)大骨節(jié)病與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞外基質(zhì)丟失程度的報(bào)道。為此，本研究采用3種軟骨組織切片染色法比較兩種骨性關(guān)節(jié)疾病的細(xì)胞外基質(zhì)含量的差異。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源按照我國《大骨節(jié)病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T207-2010)納入KBD患者，收集來自陜西KBD病區(qū)永壽、麟游、彬縣、長武等縣進(jìn)行KBD關(guān)節(jié)清理術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)治療后的軟骨標(biāo)本12例，男性7例，女性5例，平均年齡52.11歲。根據(jù)2007年《中國骨關(guān)節(jié)炎診療指南》診斷原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎(OA)病例，收集陜西省人民醫(yī)院骨科、西安紅會醫(yī)院等OA關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)清理術(shù)術(shù)后軟骨標(biāo)本13例，男性9例，女性4例，平均年齡54.67歲；收集年齡、性別盡量匹配的健康者因車禍截肢術(shù)后正常關(guān)節(jié)軟骨8例，男性6例，女性2例，平均年齡28.29歲。通過詢問病史和查閱病例資料以排除關(guān)節(jié)炎病史和家族遺傳史的病例。所有標(biāo)本收集均征得患者及家屬知情同意。本研究通過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 蘇木精-伊紅染色法染色(hematoxylin-eosin staining, HE)①脫蠟與水合：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min，無水乙醇 10 min，95%、80%乙醇各5 min，PBS洗3 min×3次；②染色：放入蘇木素液中染色10 min，自來水浸洗；③分化與反藍(lán)：鏡下觀察，若染色過深，可用鹽酸乙醇分色數(shù)秒，自來水浸洗。PBS液反藍(lán)10 min，自來水浸洗；④染色：放入伊紅液中染色3～5 min，自來水浸洗；⑤自然晾干后中性樹膠封片，光鏡下觀察，采集圖像。

1.3 甲苯胺藍(lán)-固綠染色(toludine blue- fast green, TB)①脫蠟與水合：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min，無水乙醇 10 min，95%、80%乙醇各5 min，PBS洗3 min×3次；②蘇木素染色5 min，自來水洗3遍后，用鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水洗3遍；③0.2%(2 g/L)光綠浸染10 min，自來水洗；④TB液(pH=2.0～3.0)浸染1.5～2 min；快速晾干；⑤用新的95%乙醇分化3 min，100%乙醇脫水3 min，二甲苯透明2遍，每次10 min；⑥自然晾干后中性樹膠封片。

1.4 番紅花精O-固綠染色(safranin-fast green staining)①脫蠟與水合：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min，無水乙醇 10 min，95%、80%乙醇各5 min，PBS洗3 min×3次；②Weigert氏蘇木素染5 min，自來水洗；③1%(10 mL/L)鹽酸乙醇分色數(shù)秒，自來水洗；④0.2%(2 g/L)固綠水溶液內(nèi)染5 min，自來水洗；⑤在0.1%(1 g/L)番紅花精O水溶液內(nèi)染1～2 min，自來水洗；⑥用0.1%(1 mL/L)醋酸水溶液分化，自來水洗；⑦95%乙醇、100%乙醇脫水，二甲苯透明2遍，中性樹膠封固。

1.5 圖像采集光學(xué)顯微鏡下觀察，調(diào)整最佳亮度、對比度后，采集圖像。

1.6 HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、番紅花素染色圖片半定量分析選取40倍鏡下背景低、染色清晰、對比度好的組織切片標(biāo)本進(jìn)行圖像采集；用Image-Pro Plus 6.0 (IPP 6.0)圖像分析軟件分析每張圖片的平均染色面積百分比(染色面積/每張圖片的組織總面積)，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果光學(xué)顯微鏡下可見，軟骨基質(zhì)染成淡粉紅色，軟骨細(xì)胞及軟骨陷窩呈強(qiáng)嗜堿性而染成藍(lán)色。NC組軟骨組織結(jié)構(gòu)良好，表面平整，表層軟骨細(xì)胞平行排列，分布均勻，中層細(xì)胞柱狀排列，深層細(xì)胞體積肥大，數(shù)量較少(圖1A)。與之相比，OA組軟骨組織表層破裂，凹凸不平，且明顯纖維化，中層軟骨細(xì)胞排列層次感較差，部分區(qū)域可見異常的軟骨細(xì)胞團(tuán)，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少(圖1B)。KBD組軟骨組織表層破損較OA組輕，主要在中層和深層均發(fā)生不同程度的細(xì)胞丟失，結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨深層壞死、細(xì)胞溶解，壞死區(qū)內(nèi)僅殘留紅染的細(xì)胞核(圖1C綠色箭頭部分為壞死區(qū))。

圖1 3組軟骨組織的形態(tài)學(xué)比較Fig.1 Comparison of HE morphology in three groups of cartilages (HE, ×40)A：NC組軟骨；B：OA組軟骨；C：KBD組軟骨。

每張標(biāo)本切片隨機(jī)取3個(gè)視野，40倍鏡下采集關(guān)節(jié)軟骨圖像，然后用IPP 6.0圖像分析軟件測量3組軟骨組織獲得的伊紅染色面積百分比。隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示：3組軟骨組織的伊紅染色面積百分比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。LSD-t分析結(jié)果表明，NC組(83.65±8.38)%的染色面積百分比明顯高于OA組的(57.90±21.88)%和KBD組的(43.67±23.91)%，P值均為0.001；OA組高于KBD組(P=0.034)。說明OA組和KBD組關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)均較NC組軟骨減少，而KBD組關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的丟失比OA組軟骨多。

2.2 甲苯胺藍(lán)-固綠染色結(jié)果采用甲苯胺藍(lán)染色法觀察軟骨組織中酸性黏多糖的表達(dá)情況，固綠進(jìn)行襯染。40倍光學(xué)顯微鏡下可見，細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)染色很淺，軟骨基質(zhì)呈紫藍(lán)色，軟骨下骨組織染成亮綠色，與軟骨組織清晰對比。NC組組織結(jié)構(gòu)層清晰，細(xì)胞豐富，甲苯胺藍(lán)染色均勻(圖2A)。OA組軟骨結(jié)構(gòu)層次感較差，表層少量纖維化(固綠染色部分)，甲苯胺藍(lán)染色缺失多少不一(圖2B)。KBD組軟骨層次不良，表層和深層甲苯胺藍(lán)染色較淺(圖2C)。與NC組軟骨組織(37.66±23.16)%相比，OA組軟骨(28.45±11.81)%和KBD組軟骨(29.22±21.30)%內(nèi)的酸性黏多糖(如硫酸軟骨素)均有不同程度減少，但是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NC組、OA組和KBD組的甲苯胺藍(lán)染色面積差異不明顯(P>0.05)。

圖2 3組軟骨組織的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果Fig.2 Results of toluidine blue staining in three groups of cartilages (TB, ×40)A：NC組軟骨；B：OA組軟骨；C：KBD組軟骨。

2.3 番紅花精O-固綠染色結(jié)果用番紅花精O染色法觀察軟骨組織中基質(zhì)的合成情況。光學(xué)顯微鏡下可見，細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)染色很淺，軟骨基質(zhì)呈紅色或橘紅色，軟骨下骨組織染成亮綠色或淺粉紅色，與軟骨組織對比鮮明。NC組組織結(jié)構(gòu)層清晰，細(xì)胞豐富，番紅花精O因易與硫酸軟骨素或硫酸角質(zhì)素結(jié)合而使中層和深層均勻紅染(圖3A)。OA組軟骨僅有深層和部分中層紅染，但染色不如正常軟骨深，表層和中層染色很淺(圖3B)。KBD組中層染色淺紅染，表層和深層染色很淺，甚至缺失(圖3C)。與NC組相比，OA組軟骨和KBD組軟骨的表中深3層均有不同程度的軟骨基質(zhì)，尤其是蛋白多糖中的硫酸軟骨素丟失，OA組軟骨的表、中層軟骨基質(zhì)減少比中層明顯，KBD組軟骨的表、深層軟骨基質(zhì)缺失更嚴(yán)重。

圖3 3組軟骨組織的番紅花精O-固綠染色結(jié)果Fig.3 Staining results of saffron essence O-fast green in three groups of cartilages (Safranin, ×40)A：NC組軟骨；B：OA組軟骨；C：KBD組軟骨。

LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果表明，NC組(75.66±12.54)%明顯高于OA組(53.81±10.48)%和KBD組(62.07±14.66)%，P值均為0.001；KBD組高于OA組(P=0.011)，說明OA組和KBD組關(guān)節(jié)軟骨均有不同程度的蛋白多糖丟失，而OA組關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖的丟失比KBD組軟骨更嚴(yán)重。

3 討 論

軟骨組織是由大量細(xì)胞外基質(zhì)與分布于基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞組成。細(xì)胞外基質(zhì)主要由水分、蛋白多糖、膠原纖維、糖蛋白等組成。軟骨蛋白聚糖主要包括透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸皮膚素等(圖4)。臨床上主要將透明質(zhì)酸及硫酸軟骨素作為軟骨丟失的補(bǔ)充制劑。之前的研究主要集中于KBD和OA軟骨細(xì)胞代謝差異，目前尚未見到細(xì)胞外基質(zhì)降解的相關(guān)研究。因此，本研究采用不同的軟骨組織染色法比較正常軟骨、OA和KBD軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的含量差異。

圖4 軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)成及主要代謝酶Fig.4 Composition of cartilage extracellular matrix and metabolic enzymes

骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨退變程度與軟骨細(xì)胞外蛋白聚糖丟失量成正比，OA軟骨組織中MMP-3、MMP-9、MMP-13基因轉(zhuǎn)錄均較正常軟骨組織明顯增加[5]，說明骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞外基質(zhì)過度降解是軟骨丟失的病理特征之一。KBD軟骨的破壞依賴于膠原和蛋白聚糖降解蛋白酶，如膠原酶(MMP-1/-13)及蛋白聚糖酶。壞死區(qū)附近TIMP-2水平升高提示修復(fù)機(jī)制也被激活[6]。真菌毒素雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)能明顯抑制培養(yǎng)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖合成[7]。凋亡途徑JNK抑制劑(SP600125)對軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成具有一定的抑制作用[8]，說明細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑對細(xì)胞外基質(zhì)的降解代謝有促進(jìn)作用。

蘇木素-伊紅染色可以清楚地顯示軟骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因而通常用于形態(tài)學(xué)研究。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)易與伊紅結(jié)合而呈淡粉紅色，軟骨陷窩周圍富含硫酸軟骨素而呈強(qiáng)嗜堿性染成藍(lán)色。本研究采用HE染色法觀察軟骨組織的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)KBD軟骨組織整體層次感欠佳，細(xì)胞深層形成明顯的條帶狀壞死，在壞死區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞崩解，紅色細(xì)胞核殘留。KBD軟骨組的伊紅染色面積在組織總面積中的百分比明顯低于NC組，說明軟骨基質(zhì)大量降解。而OA軟骨表層有剝蝕現(xiàn)象、纖維化，軟骨細(xì)胞成簇分布，基質(zhì)染色不均。OA軟骨組的伊紅染色面積在組織總面積中的百分比明顯低于NC組，說明OA軟骨基質(zhì)也有丟失。KBD軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)丟失比OA軟骨更嚴(yán)重。

硫酸軟骨素、維生素E及抗炎鎮(zhèn)痛藥等藥物聯(lián)合治療成人大骨節(jié)病效果較好[9]。硫酸軟骨素和硫酸氨基葡萄糖均可減緩成人大骨節(jié)病患者膝關(guān)節(jié)間隙繼續(xù)變窄的進(jìn)程，對關(guān)節(jié)軟骨有間接保護(hù)作用[10]。硫酸軟骨素納米硒能顯著拮抗T-2毒素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，提示其有一定治療大骨節(jié)病軟骨損傷的潛能[11]。甲苯胺藍(lán)主要與軟骨組織中硫酸軟骨素等酸性黏多糖結(jié)合而呈深紫藍(lán)色，間接反映軟骨基質(zhì)中硫酸軟骨素的含量。本研究對甲苯胺藍(lán)染色面積進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，OA軟骨組和KBD軟骨組的甲苯胺藍(lán)染色面積百分比均較NC軟骨減小，但這種差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

大骨節(jié)病患者接受膝關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉治療后2月，其生存質(zhì)量(生理功能、軀體疼痛、一般健康狀況、精力、社會功能、精神健康)明顯提高[12]。針對大骨節(jié)病患者，采用關(guān)節(jié)鏡清理聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉注射治療療效良好[13]。膝關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉治療大骨節(jié)病6個(gè)月內(nèi)的關(guān)節(jié)功能改善率維持在80%～85.7%，提示透明質(zhì)酸鈉治療是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的治療方案[14]。結(jié)合本研究的組織學(xué)染色結(jié)果，說明透明質(zhì)酸治療KBD仍然是臨床的重要手段之一。

番紅花精O染料是一類含有陽離子的堿性染料，能與蛋白多糖中的硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素等陰離子結(jié)合，可以采用此染色法對軟骨組織切片上的蛋白多糖進(jìn)行半定量分析。本研究結(jié)合番紅花精O染色面積和圖像分析系統(tǒng)來間接反映軟骨中蛋白多糖的含量。在NC關(guān)節(jié)軟骨組織中，表層染色較淺，中層和深層染色比較深，表明軟骨表層的蛋白多糖含量最低，主要分布于中層和深層，這與既往發(fā)表的研究結(jié)果類似[15-16]。結(jié)合圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的半定量結(jié)果，KBD組和OA組的蛋白聚糖染色面積明顯低于NC軟骨，OA軟骨組的蛋白多糖丟失較KBD軟骨更多。結(jié)合HE和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果，我們認(rèn)為，KBD軟骨和OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)丟失的主要是透明質(zhì)酸，而不是硫酸軟骨素，因此，建議臨床治療KBD以補(bǔ)充關(guān)節(jié)腔透明質(zhì)酸為主，以補(bǔ)充硫酸軟骨素為輔助治療。

綜上所述，KBD軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)總量丟失比OA軟骨多，OA關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖的丟失比KBD軟骨更嚴(yán)重，而KBD軟骨組織中的Ⅱ型膠原蛋白可能丟失更多，今后可以將Ⅱ型膠原蛋白酶抑制劑作為KBD治療的研究方向。