耐冷菌的適冷分子機(jī)制及在污水處理中的應(yīng)用

申秋華，王曉杰

(海軍勤務(wù)學(xué)院 海防工程系軍港勤務(wù)教研室，天津 300450)

1 引言

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人口增長(zhǎng)，城市生活污水年排放量迅速增加，水環(huán)境中污染物排放數(shù)量及處理難度逐漸加大。這些污染物質(zhì)大量排入天然水體，消耗水中的溶解氧，引起水質(zhì)惡化。因此，研究如何高效地處理城市生活污水是當(dāng)前函待解決的首要問題。生活污水處理技術(shù)存在物理法、化學(xué)法、生物法之分。憑借自身無二次污染、效果好、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，生物技術(shù)成為污水處理的主要手段[1～3]。國(guó)內(nèi)城市生活污水處理方面，以生物處理技術(shù)為主，其處理系統(tǒng)主要是依賴具有降解活性的中溫菌，當(dāng)這種菌處于20～25 ℃溫度區(qū)間時(shí)，可釋放較強(qiáng)生物活性與降解活性[4～6]。若環(huán)境溫度在10 ℃以下，絕大多數(shù)中溫菌代謝功能減弱，甚至失活而死亡。我國(guó)北方區(qū)域冬季溫度低，各大城市全年中月氣溫均值低于10 ℃的月份達(dá)6個(gè)[7，8]。從環(huán)境溫度來看，冬季的低溫對(duì)以中溫菌為主的污水處理設(shè)備造成劇烈的影響，很大程度地減弱了其對(duì)有機(jī)污染物的去除效果，使得出水難以達(dá)標(biāo)排放。為提升低溫環(huán)境下污水處理效率，目前工程中主要采用降低污泥的處理壓力、對(duì)污水施以一定保溫處理、提高污泥濃度等措施[9～11]。這些措施雖在一定程度上能提高污水處理效率，但是大大增加了投資和運(yùn)行費(fèi)用，并未能從根本上解決低溫帶來的不利影響。

污水處理工程實(shí)踐表明，當(dāng)溫度降低至10℃左右時(shí)，活性污泥中的大多數(shù)中溫菌的生長(zhǎng)受到抑制，但是仍有少數(shù)的耐冷微生物可以存活下來，存活下來的耐冷菌能夠正常的代謝生長(zhǎng)，并在污水處理中起著重要的作用。因此，要解決低溫生活污水達(dá)標(biāo)排放問題，有效的方法是篩選出能高效降解生活污水中有機(jī)污染物的耐冷微生物。因此，從根本上根除低溫污水處理不佳的難題，有效途徑是從活性污泥中分離篩選具有較高降解活性的耐冷菌。

2 耐冷菌的分類

對(duì)于微生物分布與代謝活動(dòng)，溫度是發(fā)揮著主要作用的一個(gè)環(huán)境因素?；谀偷蜏啬芰Φ膮^(qū)別，可將微生物劃分成下述三類：低溫微生物、中溫微生物和高溫微生物[6，12]。低溫微生物的種類很多，包括真細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、酵母菌以及一部分單細(xì)胞藻類。根據(jù)Morito的定義，將低溫微生物分為嗜冷菌和耐冷菌兩類。嗜冷菌的生長(zhǎng)繁殖的溫度可低于0 ℃，其最適宜的溫度應(yīng)在15 ℃以下，若溫度超過20 ℃，其無法生長(zhǎng)繁殖；耐冷菌可生長(zhǎng)繁殖的溫度為0～5 ℃，生長(zhǎng)最適宜的溫度大于15 ℃，當(dāng)溫度超過20 ℃時(shí)，其依然可生長(zhǎng)繁殖[6]。

耐冷菌對(duì)于一定范圍內(nèi)的溫度波動(dòng)具有較強(qiáng)的忍受能力，就在地球上的分布而言，相比嗜冷菌，耐冷菌的分布更具廣泛性，自常溫環(huán)境至低溫環(huán)境皆能夠分離得到耐冷菌[13～17]。現(xiàn)已自諸多低溫環(huán)境，諸如淡水、冷凍食物、海水、冰川與高山的土壤等，分離到了各種類型的耐冷菌[18,19]。

已發(fā)現(xiàn)的耐冷菌主要有細(xì)菌、古菌、酵母菌、真菌、霉菌及藻類等。其中，細(xì)菌的數(shù)量和種類最多，并且以革蘭氏陽性菌占主導(dǎo)。從極地和海洋分離到的耐冷菌是優(yōu)勢(shì)菌群，一些代表性的耐冷菌，見表1。

表1 耐冷菌的主要種屬

目前已發(fā)現(xiàn)的耐冷菌主要包括：鞘氨醇單胞菌屬，假單胞菌屬，生絲單胞菌屬，微球菌屬，動(dòng)性球菌屬，鹽桿菌屬，弧菌屬，節(jié)桿菌屬，假交替單胞菌屬，嗜冷桿菌屬和鹽單胞菌屬等[4，20]。

3 耐冷菌的耐冷機(jī)制

溫度對(duì)于任何生物來說，都是一個(gè)非常重要的環(huán)境因子。耐冷菌在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過程中，已形成了適應(yīng)低溫環(huán)境的特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶代謝機(jī)制。耐冷菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)以及酶的種類與結(jié)構(gòu)均有別于中溫菌，形成了一套與低溫相適應(yīng)的適冷分子機(jī)制。隨著基因分析技術(shù)的發(fā)展，其耐冷機(jī)制可以從細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、低溫酶、蛋白質(zhì)合成以及冷休克蛋白等幾方面解釋。

3.1 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)

細(xì)胞膜在細(xì)胞同外部環(huán)境開展生命活動(dòng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。耐冷菌通過對(duì)細(xì)胞膜內(nèi)脂類的構(gòu)成進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)膜結(jié)構(gòu)與流動(dòng)性的有效調(diào)節(jié)，使得細(xì)胞正常生理機(jī)能得以維持[8，21]。低溫條件下細(xì)胞膜流動(dòng)性和結(jié)構(gòu)的變化，能夠保證其正常發(fā)揮吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和電子轉(zhuǎn)移等功能。當(dāng)處于低溫環(huán)境時(shí)，耐冷菌細(xì)胞內(nèi)的不飽和脂肪酸含量升高，進(jìn)而是脂類熔化點(diǎn)下降，此結(jié)構(gòu)的變化對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的保持有利[22，23]。諸如，Canillac等把3株中溫菌、Psychrotrophs與Psychiophiles的Arthrobacter菌株，分別培養(yǎng)在各自最適宜生長(zhǎng)溫度以下的環(huán)境中，獲得以下結(jié)果：3株菌的細(xì)胞膜含不飽和脂肪酸量皆上升[22]。眾多研究證實(shí)，導(dǎo)致不飽和脂肪酸水平改變的原因主要為，飽和酶的引入導(dǎo)致脂肪酸的鏈長(zhǎng)以及甲基支鏈發(fā)生改變。革蘭氏陰性菌通過改變脂肪酸飽和度和甲基鏈長(zhǎng)度，而革蘭氏陽性菌更多是改變甲基鍵的類型和數(shù)目，這些變化對(duì)于低溫時(shí)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性具有重要意義。

3.2 低溫酶

耐冷菌通常不會(huì)以產(chǎn)生孢子等休眠體的形式來抵御低溫時(shí)的“冷脅迫”，而是通過酶含量改變，對(duì)酶濃度以及酶種類進(jìn)行調(diào)節(jié)，由此定量與定性地對(duì)低溫所致影響進(jìn)行補(bǔ)償[19，22]。低溫酶是耐冷菌能夠長(zhǎng)期在低溫環(huán)境下生存尤為重要的一個(gè)因素，它能夠使得酶促反應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。研究證實(shí)，當(dāng)處于低溫時(shí)，耐冷菌的酶活力除了有所增強(qiáng)，其分泌能力也有所提升。雖然在低于最適生長(zhǎng)溫度的條件下，耐冷菌的代謝速率減慢，但其仍能表現(xiàn)出更高的生化活力和更高的酶產(chǎn)出量。眾多研究結(jié)果顯示，耐冷菌的最高酶產(chǎn)生量出現(xiàn)在溫度遠(yuǎn)低于其最適宜生長(zhǎng)溫度的環(huán)境中。

低溫酶分子通常具備較高柔性，當(dāng)處于低溫環(huán)境時(shí)會(huì)快速調(diào)整自身構(gòu)象，其活性中心更易于接受與釋放底物，由此確保催化反應(yīng)的成功實(shí)施[22]。例如，Narinx等從南極海水中2株不同的枯草桿菌中分離出兩種蛋白酶，與中溫菌蛋白酶的多肽鏈相比，這兩株低溫枯草桿菌的蛋白酶多肽鏈稍長(zhǎng)。研究證實(shí)，此兩類酶含二硫橋結(jié)構(gòu)，同時(shí)，此結(jié)構(gòu)使酶分子內(nèi)基團(tuán)間相互作用下降，酶與溶劑分子間相互作用提高，低溫酶由此可具備較高柔韌性，同底物結(jié)合幾率更高[19，22，24]。但是，低溫酶的熱穩(wěn)定性較低，隨著環(huán)境溫度升高，低溫酶容易發(fā)生去折疊結(jié)構(gòu)變化，使酶的活性中心失去活性，且低溫酶發(fā)生錯(cuò)誤折疊的幾率更高[8,9]。

3.3 蛋白質(zhì)合成

耐冷菌在低溫環(huán)境中約10%～15%的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)經(jīng)是由調(diào)節(jié)機(jī)制合成。在影響細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方面，溫度的作用機(jī)制是調(diào)控核糖體上蛋白質(zhì)或某類特異mRNA的翻譯速率[19，22，24，25]。高溫菌、中溫菌的蛋白質(zhì)存在冷不穩(wěn)定的特性，其活性與溫度正向相關(guān)，而耐冷菌的蛋白質(zhì)處于低溫時(shí)結(jié)構(gòu)完整性與催化活性卻無明顯變化，因此表現(xiàn)出非常高的催化能力[6，22]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，耐冷菌處于低溫時(shí)，最不易發(fā)生體外蛋白質(zhì)翻譯錯(cuò)誤。比如，Szer等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)條件相同時(shí)，在蛋白質(zhì)合成錯(cuò)配率方面，適冷性的假單孢桿菌低于中溫菌。可見，低溫時(shí)耐冷菌擁有有效啟動(dòng)的特殊功能，高溫菌與中溫菌則無此特殊功能。

研究證實(shí)，在耐冷菌的核糖體內(nèi)能夠提取得到一類在0 ℃時(shí)具有翻譯能力的蛋白質(zhì)，此類蛋白能夠使大腸桿菌的核糖低于0 ℃時(shí)翻譯Poly U聚合酶[4，22，24，26]。對(duì)于低溫環(huán)境，中溫菌的核糖體缺乏適應(yīng)性，同時(shí)低溫還會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞膜受損，造成細(xì)胞溶解而死亡。故0℃低溫條件時(shí)，眾多中溫菌皆無法合成蛋白質(zhì)。

3.4 冷休克蛋白

冷休克蛋白也稱為冷激蛋白，它是通過耐冷菌的自身調(diào)節(jié)機(jī)制產(chǎn)生。冷休克蛋白最初是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，總共發(fā)現(xiàn)了9種冷休克蛋白，分別命名為CspA～CspI。它是一類由68～74個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì)，在核酸結(jié)合區(qū)都包含有兩個(gè)一致的保守RNA結(jié)合基序。冷休克蛋白對(duì)于微生物低溫耐受至關(guān)重要，其與RNA結(jié)合改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響DNA復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄和翻譯等冷適應(yīng)調(diào)節(jié)過程。當(dāng)受到冷刺激時(shí)，微生物可生成冷休克蛋白這種關(guān)鍵性應(yīng)激蛋白，此蛋白在低溫時(shí)對(duì)維持耐冷菌的生理活性起著十分重要的作用[8，22，27]。在環(huán)境溫度出現(xiàn)快速、大幅度降低等波動(dòng)的情況下，耐冷菌會(huì)產(chǎn)生一種適應(yīng)溫差的冷休克反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)大量誘導(dǎo)分泌高達(dá)幾十倍的冷休克蛋白。例如，F(xiàn)ujii等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行冷誘導(dǎo)反應(yīng)，溫度從37 ℃下降到10 ℃后，CspA的濃度在1～1.5 h就能夠達(dá)到100 μmol/L，并隨后誘導(dǎo)產(chǎn)生多種冷休克蛋白。此外，通過探究耐冷酵母Trichos-poronpullulans的冷休克反應(yīng)，Julseth等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生長(zhǎng)溫度從21 ℃下降至5 ℃時(shí)，此耐冷酵母12 h內(nèi)即可誘導(dǎo)合成26類冷休克蛋白[10，22]。

細(xì)胞通過產(chǎn)生冷休克蛋白來應(yīng)對(duì)外界溫度的變化，產(chǎn)生蛋白數(shù)量與溫度降低的劇烈程度成正比關(guān)系。實(shí)際上，中溫菌、耐冷菌以及嗜熱菌在低溫刺激時(shí)都會(huì)產(chǎn)生冷休克蛋白，只是這種調(diào)節(jié)機(jī)制在耐冷菌細(xì)胞內(nèi)體現(xiàn)的更加明顯。例如，Ray在自南極分離出的耐冷菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，冷休克基因在高溫和低溫時(shí)都可以正常表達(dá)，只是當(dāng)溫度由高溫降低至5 ℃以下低溫時(shí)，CspA 表達(dá)量大大增加。

耐冷菌通過調(diào)控在細(xì)胞膜、酶分子、蛋白質(zhì)層面上精細(xì)的構(gòu)成與結(jié)構(gòu)變化，使低溫時(shí)自身正常代謝活動(dòng)與繁殖能力得以維持。耐冷菌的此適冷性的生物特征，決定了自身可高效降解低溫污水中所含的污染物。探究耐冷菌的冷適應(yīng)機(jī)理，能夠?yàn)榇祟惥鷱V泛應(yīng)用于污水處理方面予以提供堅(jiān)實(shí)的理論支撐。

4 耐冷菌在污水處理中的應(yīng)用與展望

在微生物篩選技術(shù)快速發(fā)展背景下，借助耐冷菌可高效降解低溫污水內(nèi)污染物的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可顯著擴(kuò)寬其在環(huán)境工程特別是污水處理方面的應(yīng)用范圍[8]。通過引入篩選低溫環(huán)境下的耐冷菌的措施，來克服低溫對(duì)污水處理廠所帶來的不利影響。國(guó)內(nèi)外對(duì)耐冷菌在污水處理領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。目前，耐冷菌在降解污水中的氮和磷、石油烴類、氯酚類、脂肪類等物質(zhì)領(lǐng)域已經(jīng)取得了很好的效果。國(guó)外對(duì)耐冷菌的研究起步比較早，比如，早在1974年，Westlake和Atlas等就從極地環(huán)境中分離到了能夠降解原油的耐冷菌株。我國(guó)對(duì)耐冷菌的篩選與研究工作開始于20世紀(jì)90年代初。目前，我國(guó)已經(jīng)從多種低溫環(huán)境中分離出了大量耐冷菌，并且在耐冷菌的分子鑒定與技術(shù)培養(yǎng)等方面取得了一定的研究成果。

在生活污水處理系統(tǒng)中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要是研究在寒冷氣候條件下耐冷菌對(duì)氮、磷和COD污染物的去除情況。城市生活污水處理大多選擇生物處理方法，環(huán)境溫度對(duì)此處理系統(tǒng)的效率具有較大影響，在實(shí)際工程運(yùn)行過程中，若生化池的污水溫度在10 ℃以下時(shí)，大多存在微生物生長(zhǎng)停滯以及降解活性下降的現(xiàn)象[13]。原因主要在于，低溫時(shí)中溫菌細(xì)胞內(nèi)代謝生成的酶親和底物分子能力大大下降，酶催化活性減弱，生理代謝能力也隨之下降。通過投加具有高效降解活性的耐冷菌，可有效克服低溫對(duì)生活污水處理所帶來的不利影響[28]。例如，李亞選等[19]于冬季自我國(guó)東北區(qū)域某污水處理廠二沉池的活性污泥內(nèi)，分離出對(duì)有機(jī)污染物具有高效降解作用的耐冷菌。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)污水溫度在10 ℃以下時(shí)，耐冷菌成為活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群。低溫時(shí)，耐冷菌對(duì)COD去除率相比中溫菌對(duì)COD去除率高出63.67%；中溫時(shí)，兩者對(duì)COD去除率相差在10%以下，由此可見，耐冷菌在我國(guó)寒冷地區(qū)生活污水處理方面具有良好的應(yīng)用前景。另外有研究發(fā)現(xiàn)，采用耐冷性的復(fù)合菌群處理低溫生活污水比單一菌具有更高的COD去除率。學(xué)者姜安璽等[29]于冬季的市政下水道的污泥內(nèi)提取得到4類耐冷菌，同時(shí)針對(duì)單菌與混合菌開展了有機(jī)物降解的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明混合菌的對(duì)COD去除率高達(dá)72%，明顯高于各單菌的去除率，節(jié)約了工程投資成本，從而證明耐冷菌在寒冷地區(qū)生活污水治理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

污水所含氮與磷污染物是造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵因素之一，這兩類物質(zhì)的去除對(duì)我國(guó)污水處理與生態(tài)平衡的維持發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，低溫會(huì)使細(xì)菌的生物活性和生長(zhǎng)速率大大降低，使得氮和磷的去除變得更加困難。經(jīng)研究，張雷等[30]發(fā)現(xiàn)，借助低溫馴化培養(yǎng)技術(shù)與微生物固定化技術(shù)構(gòu)建的耐冷硝化菌群，可實(shí)現(xiàn)污水60%的氨氮去除率。固定化微生物技術(shù)能夠提高低溫污水的脫氮效率，克服懸浮態(tài)微生物流失問題。唐雙[31]從天然冷水體中篩選得到3株優(yōu)勢(shì)耐冷菌Pseudomonas koreensis YB1、Pseudomonas fragi YB2、Pseudomonas lundensis YB3。后續(xù)采用吸附法和包埋法對(duì)混合耐冷菌進(jìn)行固定化處理，與游離的混合耐冷菌相比，固定化的混合耐冷菌比單一菌株明顯提高了低溫污水的處理效率，且利用新型聚氨酯固定化材料包埋混合菌株可使污水中 COD、NH3-N去除率超過90%，TP 去除率超過60%。

5 結(jié)語

耐冷菌及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的研究以及它們?cè)谖鬯幚砉こ讨械臐撛趦r(jià)值逐漸引起人們的廣泛關(guān)注，并成為新的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外從低溫環(huán)境下篩選出的耐冷菌株在污水處理中的效果也非常顯著，但離實(shí)際的污水工藝的應(yīng)用還有一定差距。究其主要原因是目前對(duì)于耐冷菌的研究大多局限于一種或者少數(shù)幾種菌株，而實(shí)際污水是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境體系，需要數(shù)量和種類較多的優(yōu)勢(shì)菌株共同起作用?？傊瑖?guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)耐冷菌的研究和菌株開發(fā)上處在摸索階段，也缺乏一定的研究深度。因此，研究利用這些在低溫環(huán)境中已分離到的耐冷微生物降解污水中的各種有機(jī)污染物，這對(duì)污水治理工作起很重要的作用。