基于金黃色葡萄球菌FnBPA 和停乳鏈球菌GapC 的多表位疫苗免疫原性研究

馬駿，王然，劉碩，王欣，段旭陽(yáng)，陳晶，楊思宇，王麗，劉慧婷，范釗偉，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

奶牛乳腺炎是奶牛最常見(jiàn)的疾病，嚴(yán)重危害奶牛健康和奶業(yè)的發(fā)展。奶牛乳腺炎主要是由細(xì)菌乳腺內(nèi)感染（IMI）引起的，而金黃色葡萄球菌和鏈球菌是引起奶牛乳腺炎的常見(jiàn)重要病原體[1-2]。盡管在世界各地的一些奶牛場(chǎng)采取了乳腺炎控制計(jì)劃，但在過(guò)去的幾十年中對(duì)奶牛乳腺炎仍然以抗生素治療為主[3]。然而，隨著金黃色葡萄球菌和鏈球菌抗生素耐藥菌株的大量增加以及消費(fèi)者對(duì)無(wú)抗生素牛奶的需求，使用抗生素治療和控制奶牛乳腺炎受到嚴(yán)格限制。因此，研究和開(kāi)發(fā)有效的疫苗來(lái)預(yù)防奶牛乳腺感染越來(lái)越引起人們的關(guān)注。目前人們研究奶牛乳腺炎疫苗主要是亞單位疫苗，并且多種抗原蛋白融合誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用優(yōu)于單一抗原蛋白[4]。奶牛乳腺炎由多種致病菌引起，單一抗原亞單位疫苗無(wú)法滿足奶牛乳腺炎免疫預(yù)防需要，奶牛乳腺炎疫苗應(yīng)當(dāng)包含多種致病菌的抗原。但是由于表達(dá)抗原蛋白的載體容量有限，無(wú)法同時(shí)表達(dá)多個(gè)抗原蛋白。表位是有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的基本成分，一般T 細(xì)胞表位為8～16 個(gè)氨基酸的線性短肽，線性B 細(xì)胞表位多為6～9 個(gè)氨基酸短肽。表位串聯(lián)而制成的表位疫苗具有能夠容納多個(gè)抗原表位、預(yù)防多種病原感染的優(yōu)勢(shì)，且具有安全、穩(wěn)定、高產(chǎn)、可以選擇性地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答類型[5]。以往研究表明[6-7]，金黃色葡萄球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白A（FnBPA）參與金黃色葡萄球菌的早期黏附，能夠誘導(dǎo)良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答；另?yè)?jù)報(bào)道[8-9]，使用重組的停乳鏈球菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶C（GapC）進(jìn)行免疫，可以對(duì)停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和乳房鏈球菌提供交叉保護(hù)。進(jìn)一步研究表明[10]，GapC 蛋白的 1 至 150 位的氨基酸序列（GapC1-150）可誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生與GapC 全蛋白相同的抗無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析顯示，這三種鏈球菌的GapC 蛋白的1 至150 位氨基酸同源性高達(dá)94%。

為了探索能夠誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，且能夠同時(shí)預(yù)防金黃色葡萄球菌和鏈球菌引起的奶牛乳腺炎的表位疫苗，前期以金黃色葡萄球菌FnBPA的 CD4+T 細(xì)胞表位 FnBPA488-505和 B 細(xì)胞表位FnBPA352-364、FnBPA763-772構(gòu)建了多表位疫苗 FTB1B2；以停乳鏈球菌GapC 的CD4+T 細(xì)胞表位GapC63-77和B 細(xì)胞表位 GapC30-36、GapC97-103構(gòu)建了多表位疫苗GTB1B2，并證明這兩個(gè)多表位疫苗均能誘導(dǎo)良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，且能抑制金黃色葡萄球菌及停乳鏈球菌在免疫小鼠各器官的定殖量。實(shí)驗(yàn)將表位疫苗FTB1B2 和GTB1B2 串聯(lián)，通過(guò)小鼠模型評(píng)估多表位疫苗的免疫原性和保護(hù)效果，為設(shè)計(jì)研究預(yù)防金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染的通用型奶牛乳腺炎多表位疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

金黃色葡萄球菌Newman、停乳鏈球菌LS0312、重組菌株 BL21（DE3）/pGEX-6p-1（+）/FTB1B2、BL21（DE3）/pGEX-p-1（+）/GTB1B2 、BL21（DE3）/pGEX-p-1（+）/FT、BL21（DE3）/pGEX-p-1（+）/GT 由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。6～8 周齡雌性SPF BALB/c 小鼠購(gòu)遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購(gòu)自TaKaRa 寶生物工程有限公司；Goat anti-mouse IgG-HRP 及弗氏佐劑購(gòu)自Sigma 公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物公司；CCK-8 購(gòu)自同仁化學(xué)研究所；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）及青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自GIBCO 公司；GST-binding-resin 純化柱購(gòu)自天地人和生物科技有限公司；小鼠IFN-γ、IL-4 和IL-17A預(yù)包被ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 表位疫苗的設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)室前期篩選了FnBPA 的一個(gè)CD4+T 細(xì)胞表位FnBPA488-505（FT）和GapC 的一個(gè)CD4+T 細(xì)胞表位GapC63-77（GT），并且實(shí)驗(yàn)已經(jīng)構(gòu)建了FnBPA 多表位肽FTB1B2 和GapC 多表位肽GTB1B2。使用GSGSGS 作為蛋白 Linker，串聯(lián) FT、GT，構(gòu)成 FGT 多肽；串聯(lián)FTB1B2、GTB1B2，構(gòu)成FG 多肽。使用DNA－works 將表位肽的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成核苷酸序列并進(jìn)行密碼子優(yōu)化。在序列的上下游分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成基因。

1.3.2 重組表位原核表達(dá)載體的鑒定

將合成含有目的基因的重組質(zhì)粒分別命名為pGEX-6P-1（+）-FGT、pGEX-6P-1（+）-FG。將合成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，提取重組質(zhì)粒后，使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)含有目的基因的重組質(zhì)粒37 ℃酶切3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將鑒定正確的重組菌株等體積加到50%甘油溶液中，混勻后凍存于-80 ℃。

1.3.3 重組表位的表達(dá)純化及多肽的合成

活化重組菌株 BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/FGT、BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/FG、BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/FT、BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/GT、BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/FTB1B2 和 BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/GTB1B2，1∶100 轉(zhuǎn)接至 Amp+LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)至 OD600為 0.6～0.8，加入終濃度 1 mM·mL-1的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，超聲破碎后，使用GST-binding-resin 純化柱純化重組蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE 分析，將目標(biāo)蛋白裝到透析袋中，于PBS 中4 ℃過(guò)夜透析，將蛋白稀釋或濃縮至 1 mg·mL-1，放在-80 ℃冰箱備用。由上海楚肽生物有限公司合成FT、GT、FTB1B2和GTB1B2 多肽。

1.3.4 小鼠免疫接種及攻毒

將6～8 周齡的雌性BALB/c 小鼠隨機(jī)分為8 組，每 組 10 只 小 鼠 。 純 化 的 FT、GT、FGT、GTB1B2、FTB1B2、FG 和GST 蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻乳化，對(duì)小鼠后腿部肌肉注射免疫接種，免疫劑量為100 μg·只-1。初次免疫后3 周，將蛋白與弗氏不完全佐劑混勻乳化，免疫接種小鼠。加強(qiáng)免疫后2周，每組選取3 只小鼠腔注射1×108CFU 的停乳鏈球菌LS0312；每組選取3 只小鼠腹腔注射2×109CFU 的金黃色葡萄球菌Newman，攻毒后48 h 檢測(cè)小鼠各組織臟器的細(xì)菌定殖情況。

1.3.5 分離小鼠的脾淋巴細(xì)胞

加強(qiáng)免疫后一周，每組取3 只，無(wú)菌取脾臟，在200 目尼龍網(wǎng)上研磨脾臟，使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，收集脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并稀釋成1×106mL-1備用。

1.3.6 檢測(cè)多表位疫苗誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖

將分離得到的小鼠脾淋巴細(xì)胞加入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 100 μL 細(xì)胞，分別用 FT 與 GT 混合物、FTB1B2 多肽和 GTB1B2 多肽，2 μg·孔-1刺激各免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞，以5 μg ConA 作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌PBS 刺激作為陰性對(duì)照，以完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處樣品的吸光度。

1.3.7 檢測(cè)多表位疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞因子水平

將分離得到的小鼠脾淋巴細(xì)胞加入到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL 細(xì)胞，分別用FTB1B2 多肽、GTB1B2 多肽刺激各免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞，每孔40 μg，以無(wú)菌PBS 緩沖液刺激作為陰性對(duì)照。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h 后，4 ℃離心收集上清。使用預(yù)包被的小鼠IFN-γ ELISA 檢測(cè)試劑盒、鼠IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒和鼠IFN-γ ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-4 和IL-17A 的含量。

1.3.8 間接ELISA 法檢測(cè)多表位疫苗誘導(dǎo)的血清IgG 水平

加強(qiáng)免疫后2 周，每組取3 只小鼠，摘除眼球取血，使用無(wú)菌EP 管收集血液，血液37 ℃靜置1 h 后4 ℃過(guò)夜，次日5 000 g 離心30 min，吸出上層血清。以GTB1B2 多肽和FTB1B2 多肽作為檢測(cè)抗原，使用間接ELISA 法檢測(cè)各免疫組小鼠血清中的IgG 水平。

1.3.9 檢測(cè)免疫小鼠器官中的細(xì)菌定殖

使用Newman 菌株和LS0312 菌株攻毒48 h 后，每組取3 只小鼠，摘除并研磨小鼠的肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，連續(xù)10 倍比稀釋，取50 μL 涂布于TSA 或BHI 固體培養(yǎng)基平皿，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算小鼠各臟器的金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌定殖數(shù)。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用OriginPro 8.0 和SPSS 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，“ *”表示 P＜0.05，“ **”表示 P＜0.01，“***”表示 P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 重組多表位肽質(zhì)粒的鑒定

對(duì)合成的含有FGT、FG 目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行提取，使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示，分別在126 bp 和312 bp 處可見(jiàn)目的條帶。

圖1 多表位肽質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of multi-epitope peptide plasmids by double digestion

2.2 重組多表位蛋白的表達(dá)及純化結(jié)果

重組菌株 BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/FGT、BL21（DE3）/pGEX-6P-1（+）/FG 經(jīng) IPTG 誘導(dǎo) 4 h，使用GST 標(biāo)簽蛋白純化柱純化后，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。結(jié)果如圖2 所示，超聲后大部分重組蛋白保留在上清液中，在31 KDa 左右處可見(jiàn)重組FGT 蛋白，36 KDa處發(fā)現(xiàn)重組的FG 蛋白，與預(yù)期蛋白大小基本一致。

圖2 重組表位蛋白的表達(dá)與純化的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified multi-epitope peptides

2.3 多表位疫苗誘導(dǎo)的特異性淋巴細(xì)胞增殖

為了評(píng)價(jià)多表位疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測(cè)。加強(qiáng)免疫后一周，分離各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞，分別用FT 與GT混合物、FTB1B2 多肽、GTB1B2 多肽刺激后，使用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果如圖3 所示，F(xiàn)TB1B2多肽能刺激FT、FGT、FTB1B2 和FG 免疫組小鼠淋巴細(xì)胞增殖；GTB1B2 多肽能刺激 GT、FGT、GTB1B2 和FG 組小鼠淋巴細(xì)胞增殖；FT 和GT 混合肽能同時(shí)刺激 FT、GT、FGT、GTB1B2、FTB1B2 和 FG 免疫組小鼠淋巴細(xì)胞的增殖，并且GT 和FGT 免疫組淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于其他表位疫苗組（P＜0.05）。

2.4 多表位疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞因子水平

為了鑒定多表位疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平及類型，通過(guò)間接ELISA 方法檢測(cè)各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外受到FTB1B2 和GTB1B2 多肽刺激后分泌的細(xì)胞因子水平。結(jié)果如圖4 所示，受到FTB1B2 刺激后，F(xiàn)T 和 FGT 免疫組分泌的 IFN-γ 和IL-17A 水平顯著高于 GST 對(duì)照組，F(xiàn)TB1B2 和 FG 免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-4 和IL-17A水平高于其他免疫組（P＜0.01）；各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞受到GTB1B2 多肽刺激后，GT 和FGT 組分泌的IFN-γ 和 IL-17A 水平顯著高于 GST 對(duì)照組，GTB1B2 和 FG 免疫組分泌的 IFN-γ、IL-4 和 IL-17A均顯著高于其他免疫組（P＜0.01）。

圖3 表位疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果Fig.3 Epitope vaccine-induced lymphocyte proliferation results

圖4 多表位疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞因子水平Fig.4 Epitope vaccine-induced lymphocyte proliferation results

2.5 多表位疫苗誘導(dǎo)的血清IgG 水平

為了分析表位疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的特異性IgG水平，加強(qiáng)免疫后兩周，取各免疫組小鼠血清，分別以FTB1B2 和GTB1B2 多肽作為包被抗原檢測(cè)IgG抗體水平。小鼠血清的特異性IgG 抗體水平如圖5所示，F(xiàn)G 免疫組小鼠血清中的FTB1B2 抗體水平低于FTB1B2 組，但是顯著高于其他免疫組：FG 免疫組小鼠血清中的GTB1B2 抗體水平顯著高于其他免疫組但低于GTB1B2 組。

圖5 表位疫苗誘導(dǎo)的血清特異性IgG 抗體水平Fig.5 Specific IgG antibody levels in sera induced by epitope-vaccines

2.6 免疫小鼠器官中的細(xì)菌定殖

為了評(píng)價(jià)表位疫苗免疫接種后產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用，小鼠加強(qiáng)免疫接種后兩周，分別以最大耐受劑量的 S.dysgalactiae LS0312 和 S.aureus Newman 對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，48 h 后通過(guò)多器官細(xì)菌定殖數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)表位疫苗的免疫保護(hù)作用。從金黃色葡萄球菌定殖情況來(lái)看，F(xiàn)T、FGT、FTB1B2 和 FG 免疫組小鼠各臟器中的細(xì)菌定殖數(shù)顯著低于GST 對(duì)照組，F(xiàn)G 免疫組小鼠臟器中的細(xì)菌定殖數(shù)顯著低于FT 和FGT免疫組但高于 FTB1B2 免疫組（P＜0.001）；從 S.dysgalactiae 定殖情況看，GTB1B2 和FG 免疫組小鼠各臟器中的S.dysgalactiae 定殖數(shù)顯著低于其他免疫組，而FG 免疫組小鼠臟器中的細(xì)菌定殖數(shù)顯著高于GTB1B2 免疫組（P＜0.001）。盡管 FG 表位疫苗抑制小鼠臟器中S.aureus 或S.dysgalactiae 定殖效果要低于FTB1B2 或GTB1B2，但是FG 表位疫苗能夠同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和S.dysgalactiae 起到抑制作用。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 免疫小鼠器官中的S.aureus 和S.dysgalactiae 定殖結(jié)果Fig.6 Colonization of S.aureus and S.dysgalactiae in the immunized mouse organs

3 討論

能夠引起奶牛乳腺炎的致病菌種類繁多，但金黃色葡萄球菌和鏈球菌（主要是無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌）感染所占奶牛乳腺炎病例比例很高，可高達(dá)75%[11]。因此，預(yù)防奶牛乳腺炎的理想疫苗應(yīng)該能夠同時(shí)預(yù)防金黃色葡萄球菌感染和鏈球菌感染。但是由于表達(dá)載體容量限制，無(wú)法同時(shí)表達(dá)多個(gè)抗原蛋白。選用兩種病原菌的多個(gè)抗原研究制備奶牛乳腺炎多抗原表位疫苗對(duì)預(yù)防金黃色葡萄球菌感染或鏈球菌感染無(wú)疑具有重要意義。

以往研究表明[12-15]，細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗金黃色葡萄球菌與鏈球菌感染中發(fā)揮著重要的作用，且在表位疫苗構(gòu)建中加入T 細(xì)胞表位則可以提高表位疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用。因此，在研究前期研究金黃色葡萄球菌FnBPA 的多表位疫苗FTB1B2 和停乳鏈球菌GapC 的多表位疫苗GTB1B2 時(shí)，就分別引入了CD4+T 細(xì)胞表位，并證明了CD4+T 細(xì)胞表位能夠提高多表位疫苗的效果。研究進(jìn)一步將前期構(gòu)建的多表位疫苗 FTB1B2 和 GTB1B2 用 GSGSGS 柔性 Linker進(jìn)行串聯(lián)制備了新的多表位疫苗FG。同時(shí)還構(gòu)建了由 FnBPA CD4+T 細(xì)胞表位FT 和GapC CD4+T 細(xì)胞表位GT 構(gòu)成的CD4+T 細(xì)胞表位疫苗FGT 作為對(duì)照。從細(xì)胞因子結(jié)果可以看出，CD4+T 細(xì)胞表位疫苗FGT 能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生IFN-γ 和IL-17A，即TH1和TH17 型應(yīng)答，但誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力并未隨著T 細(xì)胞表位數(shù)量的增加而增強(qiáng)。FTB1B2、GTB1B2 和FG 免疫小鼠后都能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IFN-γ、IL-4 和IL-17A，盡管FG 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子水平要低于FTB1B2 和GTB1B2，但FG 能誘導(dǎo)針對(duì)兩種病原菌抗原表位肽的細(xì)胞免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答在抗金黃色葡萄球菌與鏈球菌感染中同樣不可或缺，表位疫苗的IgG 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G 免疫組血清中的FTB1B2 抗體水平或GTB1B2 抗體水平低于FTB1B2和GTB1B2 免疫組，但是FG 能同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)兩種表位肽的IgG 抗體。FGT 與 FT、GT 相比，抑制金黃色葡萄球菌或停乳鏈球菌定殖的效果基本一致，并顯著低于其他表位疫苗免疫組。FG 表位疫苗誘導(dǎo)小鼠抑制金黃色葡萄球菌或停乳鏈球菌器官定殖作用弱于FTB1B2 或GTB1B2 表位疫苗，但是FG 表位疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠同時(shí)抑制金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌器官定殖作用。以上說(shuō)明多表位疫苗FG 誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答以及抑制細(xì)菌在內(nèi)臟器官定殖作用均弱于多表位疫苗FTB1B2或GTB1B2，但一個(gè)多表位疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌兩種病原的免疫預(yù)防作用。

大多數(shù)的表位疫苗設(shè)計(jì)都是將T 細(xì)胞表位放在多表位疫苗的N 端，將B 細(xì)胞表位放在C 端[16-17]，此前構(gòu)建好的多表位疫苗FTB1B2 與GTB1B2 都是將CD4+T 細(xì)胞表位放在了各自的N 端。而實(shí)驗(yàn)是將FTB1B2 與GTB1B2 直接以Linker 按此順序串聯(lián)，并沒(méi)有在進(jìn)一步優(yōu)化T 細(xì)胞表位和B 細(xì)胞表位的順序。再有，報(bào)道的多表位疫苗常包含 3～4 個(gè)表位[16，18]，而研究的FG 由6 個(gè)表位構(gòu)成，從結(jié)果可以看出，隨著抗原表位的增多，表位疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用會(huì)顯著下降。因此，表位數(shù)量、各表位的順序、表位間的連接以及表位的性質(zhì)等是否會(huì)對(duì)其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用造成了一定的影響有待進(jìn)一步研究。研究對(duì)小鼠進(jìn)行了兩次免疫，增加免疫次數(shù)是否會(huì)提高免疫保護(hù)效果值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，研究構(gòu)建的FG 多表位能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，并能同時(shí)較好地抑制攻毒小鼠器官中金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌的定殖。