含CC31 畢赤酵母工程菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的效果

張萌萌，李天陽(yáng)，姜寧，張愛(ài)忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319）

隨著抗生素的禁用以及蛋白質(zhì)飼料的緊缺，尋找新的抗生素替代品以及開(kāi)發(fā)新的蛋白質(zhì)飼料生產(chǎn)方式成為研究的熱點(diǎn)，利用微生物進(jìn)行飼料的發(fā)酵可以產(chǎn)生較多的微生物代謝小分子以及高蛋白產(chǎn)品[1]。固態(tài)發(fā)酵就是一種常用的微生物生產(chǎn)高蛋白飼料的手段[2]。原料經(jīng)過(guò)微生物進(jìn)行的固態(tài)發(fā)酵后，其含有的多糖類化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等一些大分子物質(zhì)代謝為可以直接吸收運(yùn)用的小分子物質(zhì)，同時(shí)可以在一定程度上降低原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，使發(fā)酵后的原料更易被動(dòng)物機(jī)體消化和吸收[3]。劉紀(jì)成等[4]采用復(fù)合菌劑以花生秸稈為底料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)粗蛋白含量提高了53.39%，粗灰分和粗纖維分別降低了20.10%和57.97%。張仲卿等[5]在簡(jiǎn)單破碎的玉米秸稈上接種混合真菌后發(fā)現(xiàn)纖維素和木質(zhì)素含量普遍下降，分別降低了36.80%和28.87%。申春莉等[6]利用靈芝菌絲發(fā)酵豆渣發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白和氨基酸態(tài)氮由發(fā)酵前 2.03 mg·g-1和 1.16 mg·g-1顯著上升到11.01 mg·g-1和 9.88 mg·g-1。固態(tài)發(fā)酵還可以生產(chǎn)生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如：激素、生物堿、酶等[7]。劉瀟等[8]使用枯草芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)核桃粕多肽含量可達(dá)243.97 mg·g-1。錢靜亞等[9]采用米曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后檢測(cè)到極具活性的木質(zhì)素降解酶，其含量可以達(dá)到2.08 U·g-1ds。

近些年來(lái)，利用酵母菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵改善飼料品質(zhì)的研究已有較多的報(bào)道，Mandal 等[10]利用魚腸中分離的畢赤酵母菌（GU939629）進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵單寧酶含量可達(dá)0.82±0.024 U·g-1ds，單寧含量降低94.10%。孫宏等[11]利用釀酒酵母進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)原料中粗蛋白、總酚、維生素B2和低分子量肽含量顯著提高。雖有較多的研究證實(shí)酵母菌具有改善飼料品質(zhì)的功能，但其發(fā)酵底物和發(fā)酵的工藝不盡相同，致使產(chǎn)品的質(zhì)量各不相同，使用效果參差不齊，生產(chǎn)上的差異嚴(yán)重制約了酵母類添加劑的推廣和實(shí)際的應(yīng)用。因此，試驗(yàn)選用含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌為試驗(yàn)菌種，以豆粕和麥麩為發(fā)酵底物，以小分子蛋白質(zhì)為評(píng)價(jià)指數(shù)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)擬合小分子蛋白濃度（Y）與接種量（X1）、含水量（X2）的方程，以期為酵母菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高功能性蛋白含量的飼料提供合理的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料和菌種

豆粕、麥麩均購(gòu)自黑龍江大慶市大慶禾豐八一農(nóng)大動(dòng)物科技有限公司。

含抗菌肽CC31 巴斯德畢赤酵母重組工程菌為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所保存。根據(jù)雜合抗菌肽的分子設(shè)計(jì)原理，實(shí)驗(yàn)室利用家蠅抗菌肽Cec Md 和林蛙抗菌肽Chensirin 的序列作為親本肽序列，通過(guò)消減和替換的方式設(shè)計(jì)了具有抗菌潛力的雜合肽CC31[12]，通過(guò)巴斯德畢赤酵母工程菌進(jìn)行表達(dá)，得到含抗菌肽CC31 巴斯德畢赤酵母重組工程菌。

1.2 培養(yǎng)基

優(yōu)化后 BSM 培養(yǎng)基：85% H3PO426.7 ml·L-1、CaSO4·2H2O 0.94 g·L-1、K2SO418.2 g·L-1、KOH 4.13 g·L-1、MgSO4·2H2O 14.9 g·L-1、甘油 30 g·L-1、葡萄糖 30 g·L-1、（NH4）2SO415 g·L-1、酵母浸出物 10 g·L-1。

1.3 固態(tài)發(fā)酵飼料的制備

1.3.1 畢赤酵母種子菌液制備

將含抗菌肽CC31 酵母重組工程菌劃線YPD 固體平板（含 Zeocin 50 μg·mL-1），30 ℃恒溫培養(yǎng)。選取單一的菌落接種到50 mL 優(yōu)化BSM 液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 rpm 震蕩培養(yǎng)54 h。將上述種子液按照10%的量轉(zhuǎn)接于新的含有500 mL 優(yōu)化BSM 液體培養(yǎng)基的 2 L 搖瓶中，30 ℃，200 rpm·min-1震蕩培養(yǎng)42 h 作為種子液。

1.3.2 篩選最佳發(fā)酵底物粒度

取180 g 豆粕與20 g 麥麩，粒度水平分別為40～60 目、60～80 目、80 目以上，加入等量滅菌蒸餾水，再加入等量發(fā)酵菌液，充分混合均勻，維持pH 自然值，將袋中充滿空氣，每個(gè)水平重復(fù)3 次，每天（0～8 d）每個(gè)水平隨機(jī)抽取3 袋，測(cè)定小蛋白菌體濃度，確定最佳發(fā)酵粒度。

1.3.3 篩選最佳接種量和含水量

在最佳發(fā)酵粒度的基礎(chǔ)上，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1、表2）篩選接種量和含水量，利用DPSV7.05 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次逐步回歸分析。

表1 因素水平表Table 1 The factor and level table of uniform design

表2 試驗(yàn)表Table 2 The test table of uniform design

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 小分子蛋白含量的測(cè)定

利用真空冷凍干燥機(jī)（Delta1-24LSC，德國(guó)Christ）凍干發(fā)酵豆粕，置于組織粉碎機(jī)（LMLW-320/2 型，荷蘭Laarmann）充分粉碎。稱取2 g 樣品振蕩混合于40 mL PBS，靜置過(guò)夜，3 000 r·min-1離心 30 min，取離心后的上清液轉(zhuǎn)移100 000 濾管，再次進(jìn)行5 000 r·min-1離心2 h，棄上清液，剩余部分轉(zhuǎn)移30 000 濾管后再次進(jìn)行 5 000 r·min-1離心 2 h，棄上清液，然后使用碧云天BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)其蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，具體步驟參照試劑盒使用說(shuō)明。

1.4.2 回歸方程建立

以接種量（X1）、含水量（X2）為自變量，并通過(guò)固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)定所得發(fā)酵產(chǎn)物中的小分子蛋白濃度（Y）為因變量，建立回歸方程。

1.4.3 Tricine-SDS-PAGE 檢測(cè)

將65%硫酸銨溶液等體積加入上述超濾后的菌液中低溫?cái)嚢枋沟鞍壮浞殖恋?，低? ℃下進(jìn)行4 000 r·min-1離心10 min，取沉淀后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 檢測(cè)。

1.4.4 粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量測(cè)定

粗蛋白（CP） 含量測(cè)定使用凱氏定氮法（GB5511-85），參照Van Soest 分析體系中提供的方法采用纖維分析儀（ANKOM 200/220，美國(guó)）測(cè)定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）的含量[13]。

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)酵粒度的篩選

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵后的豆粕中小分子蛋白濃度逐漸提高（圖1），后期趨于平穩(wěn)。選用的40～60 目發(fā)酵底物在前5 d 時(shí)蛋白濃度迅速提高，其增加速度高于其他目數(shù)底物；60～80 目發(fā)酵底物蛋白濃度提高較為緩慢，后期趨于平穩(wěn)；80 目以上發(fā)酵底物在前5 d 蛋白濃度提高較快，但后期處于下降狀態(tài)，逐漸低于40～60 目發(fā)酵底物蛋白濃度。通過(guò)發(fā)酵時(shí)間和蛋白濃度含量進(jìn)行綜合分析都得出40～60 目可以最為最佳發(fā)酵粒度。

圖1 粒度對(duì)蛋白濃度的影響Fig 1 Effect of particle size on protein concentration

2.2 含水量和接種量條件的篩選與回歸模型的建立

通過(guò)對(duì)接種量和含水量的篩選優(yōu)化，測(cè)得蛋白濃度如表3 所示。

接種量（X1）和含水量（X2）為自變量，測(cè)得發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白濃度（Y），擬合回歸曲線。采用DPSV7.05 軟件均勻設(shè)計(jì)模塊對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸分析，得到回歸模型為：

R2=0.99，F(xiàn) 值為 31.69，P 值為 0.13，得出回歸方程線性關(guān)系良好。利用所得公式預(yù)測(cè)接種量為9.85%，含水量為51.22%，小分子蛋白濃度可以達(dá)到最高為 148.99 mg·L-1。

表3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 The scheme and the results of uniform design

2.3 擬合曲線的驗(yàn)證和小分子蛋白Tricine-SDSPAGE

依據(jù)擬合曲線最優(yōu)含水量和接種量為參考，選用10%的接種量，50%的含水量時(shí)，分別重復(fù)3 次試驗(yàn)，檢測(cè)后得到小分子蛋白濃度可達(dá)156.23 mg·L-1，與預(yù)測(cè)值相比較發(fā)現(xiàn)誤差僅為4.63%，說(shuō)明建立的擬合曲線預(yù)測(cè)發(fā)酵結(jié)果。對(duì)濃縮后的小分子蛋白進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 驗(yàn)證，圖2 顯示蛋白條帶與目的蛋白條帶相吻合，發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物包含所需要的抗菌肽CC31，且含量相對(duì)較高，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵可以為抗菌肽的開(kāi)發(fā)運(yùn)用提供新的有效途徑。

圖2 CC31 分子分離效果的Tricine-SDS-PAGEFig.2 The analysis of Tricine-SDS-PAGE for CC31

2.4 發(fā)酵后 CP、NDF 和 ADF 變化

通過(guò)與原料相比較，發(fā)酵后CP 含量得到明顯的提高，NDF 和ADF 含量的變化幅度較小，說(shuō)明含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵主要改變蛋白含量，對(duì)NDF 和ADF 含量影響較低。

表4 畢赤酵母菌對(duì)發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 4 Effect of pichia pastoris on the nutrition of fermented soybean meal（dry matter basis）

2.5 畢赤酵母固態(tài)發(fā)酵的豆粕形態(tài)

通過(guò)擬合曲線進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵后形態(tài)如圖3。與原料相比，發(fā)酵后的豆粕色澤暗黃，顆粒感更加明顯，顆粒度遠(yuǎn)大于原料豆粕，手感較為滑膩，質(zhì)地較軟，有一定的彈性，氣味為一股微酸豆味，同時(shí)含有酵母菌味。

圖3 發(fā)酵豆粕形態(tài)（左側(cè)為畢赤酵母發(fā)酵料 右側(cè)為原料）Fig.3 The morphology of fermented soybean meal

3 討論

3.1 發(fā)酵粒度對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

目前固態(tài)發(fā)酵的影響因素探究主要集中在溫度、水分等條件，對(duì)發(fā)酵底物顆粒的大小研究的相對(duì)較少。Farinas[14]在固態(tài)發(fā)酵使用中指出底物或載體的選用應(yīng)著重考慮原料的成本以及可用性，同時(shí)其他特性如顆粒大小等也應(yīng)作為重點(diǎn)的選擇。原料顆粒的大小關(guān)系到發(fā)酵菌種與發(fā)酵空間中氧氣的結(jié)合程度，較小底物顆粒的累積容易造成發(fā)酵原料內(nèi)氧含量的降低，需要靠通風(fēng)或攪拌提高基質(zhì)內(nèi)氧氣的含量，但攪拌和翻動(dòng)次數(shù)的增加，極易損傷菌絲，加速基質(zhì)內(nèi)水分的流失，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受限甚至死亡；底物顆粒較大使基質(zhì)內(nèi)留有足夠的間隙，原料與空氣的接觸度相對(duì)增加，但容易造成發(fā)酵不完全，發(fā)酵后顆粒硬度大[15]。管軍軍等[16]研究得出發(fā)酵底物粒度的增加可以增加基質(zhì)內(nèi)間隙，但發(fā)酵后底物硬度相對(duì)增加；而細(xì)小粒度底物發(fā)酵后顆粒硬度降低，由于原料間隙相對(duì)較小互相堆積，造成發(fā)酵后底物整體體積收縮。合適的發(fā)酵粒度有助于得到更好的發(fā)酵產(chǎn)物。試驗(yàn)表明，40～60 目的豆粕底物發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于其他目數(shù)，說(shuō)明40～60 目發(fā)酵料能滿足酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中的需氧量，較好的完成發(fā)酵的過(guò)程。

3.2 接種量和含水量對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

接種量與含水量的配比可以直接決定發(fā)酵底物的品質(zhì)。合適的接種量可以加速基質(zhì)內(nèi)菌種的生長(zhǎng)與繁殖，加快發(fā)酵的進(jìn)行，防止雜菌的污染，提高底物中蛋白質(zhì)的含量。底物含水量是進(jìn)行發(fā)酵的決定性因素，直接影響微生物的生長(zhǎng)速度及其代謝能力。較高的含水量將造成底物氣體流通性降低，底物顆粒產(chǎn)生板結(jié)，同時(shí)易滋生雜菌影響發(fā)酵品質(zhì)；較低的含水量，底物吸水程度受限，膨脹度下降，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給受到限制，菌體生長(zhǎng)與繁殖受到抑制[17]。因此，選擇恰當(dāng)?shù)慕臃N量與含水量在一定程度上可以改善發(fā)酵的品質(zhì)和發(fā)酵的效率。試驗(yàn)得出，選用畢赤酵母工程菌作為發(fā)酵菌株，在底物50%的含水量，10%的接種量情況下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中小分子蛋白含量可以達(dá)到 156 mg·L-1。Chi 等[18]研究得出，選用合適的發(fā)酵菌種和發(fā)酵條件在一定程度上可以提高發(fā)酵后豆粕中生物活性物質(zhì)。吳正可等[19]通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵的溫度、含水量以及接種量后發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌和釀酒酵母和枯草芽孢桿菌（比例1∶3∶2）的復(fù)合菌進(jìn)行菜籽粕固態(tài)發(fā)酵，可以有效降解菜籽粕硫甙含量，提高多肽和總酸含量，改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。張佳斌等[20]研究得出發(fā)酵底物的所處溫度、菌種的接種量以及底物含水量可以直接決定枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。在合適的菌種條件下，優(yōu)化發(fā)酵的溫度、含水量以及接種量可以直接提高發(fā)酵底物營(yíng)養(yǎng)成分的含量，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的水平，改善飼料的品質(zhì)，提高其適口性。

3.3 發(fā)酵前后原料品質(zhì)的變化

豆粕因較高的蛋白質(zhì)和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，被畜牧行業(yè)廣泛的用作各種動(dòng)物的蛋白飼料原料，但較高含量的抗?fàn)I養(yǎng)因子也限制了豆粕營(yíng)養(yǎng)的利用程度。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)利用微生物的分解和轉(zhuǎn)化能力可以消除豆粕中大部分的抗?fàn)I養(yǎng)因子，生成被動(dòng)物直接吸收利用的可溶性多肽、未知的促生長(zhǎng)因子等一系列物質(zhì)[21]。吝常華等[22]利用單菌（解淀粉芽孢桿菌）和混菌（解淀粉芽孢桿菌∶植物乳桿菌∶釀酒酵母=9∶3∶2）固態(tài)發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)明顯提高小肽、粗蛋白、粗灰分、粗脂肪含量，在一定程度上可以改善豆粕的品質(zhì)。羅遠(yuǎn)琴等[23]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及其復(fù)合菌發(fā)酵棉粕發(fā)現(xiàn)酸溶蛋白、棉籽肽以及總游離氨基酸含量得到提高，顯著改善棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，復(fù)合菌發(fā)酵后有濃郁的酒香味，在一定程度上更能提高其適口性。于新穎等[24]研究發(fā)現(xiàn)粗壯脈紋孢菌進(jìn)行菜籽粕固態(tài)發(fā)酵粗蛋白、可溶性蛋白、氨基酸和類胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，粗纖維、單寧、植酸以及硫甙含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，有效解決了菜籽粕未經(jīng)處理用于飼料原料的安全問(wèn)題。Taliercio 等[25]和Kim[26]的研究指出發(fā)酵后的豆粕在一定限度上可以有效降低致敏性，降低對(duì)動(dòng)物的危害。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵可以提高豆粕原料的蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵后質(zhì)地更加柔軟，且伴隨一定的彈性，氣味為一股微酸豆味，更容易被畜禽所采食，是一種不可多得的生物飼料。

4 結(jié)論

（1）含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌最佳固態(tài)發(fā)酵的底物顆粒度為40～60 目。

（2）小分子蛋白濃度擬合曲線：Y=113.874 5+0.915 5 X1+1.195 2 X2-0.046 5 X1·X1-0.116 7 X·2X2，R2=0.99，通過(guò)曲線預(yù)測(cè)X1值為9.85%，X2值為51.22%時(shí)，小分子蛋白濃度達(dá)到最大值（Y）為148.99 mg·L-1。

（3）含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵能有效的提高小分子功能性蛋白含量，進(jìn)而提高飼料原料粗蛋白含量。