滴度及注射方式對2型腺相關(guān)病毒載體表達(dá)效果的影響

賈俊濤，王 昆，潘 登，李 強(qiáng)，杜晨光,*

(1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭014109；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北 石家莊 050000;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

對有關(guān)發(fā)育、學(xué)習(xí)、行為和能量調(diào)控等相關(guān)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的探索是生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，其相關(guān)問題可以通過對某個特定神經(jīng)元或核團(tuán)的人為干擾或研究某一分子在神經(jīng)回路中的影響來得到一定的解答。高度特異性和高效的方法是支撐這些研究成功的基礎(chǔ)。腺病毒家族由不具有包膜的30～38 kb線性DNA組成[1]。根據(jù)其凝集特點(diǎn)可以將57個血清型分為A～G類[2]。由不同的血清型衍生而來的各種腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated viral vector,AAV) 是一種可用于靶向和操縱神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定神經(jīng)元亞型的強(qiáng)力工具[3]。在使用這種工具之前，有些問題應(yīng)當(dāng)重視，其包括但不僅限于：(1)如何運(yùn)送AAV至指定區(qū)域；(2)使用何種基因調(diào)控元件；(3)選擇何種血清型[4]。研究表明，腦立體定位注射是運(yùn)送AAV至指定神經(jīng)元或核團(tuán)的常用方式[5]；突觸啟動子(synapsin promoter)等強(qiáng)力啟動子則是增強(qiáng)AAV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)性的必備元件之一[6]；2型腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated viral vector serotype 2,AAV2)因其神經(jīng)元特異性，長期以來被用于神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)研究當(dāng)中[7]。因此，在神經(jīng)學(xué)研究中，選擇具有較強(qiáng)啟動子的AAV2運(yùn)載外源基因、通過腦立體定位注射到指定核團(tuán)則有利于試驗(yàn)的順利進(jìn)行。本試驗(yàn)選擇AAV2-CMV-EGFP對照載體進(jìn)行研究正是基于以上原因。

通過對外源的轉(zhuǎn)錄、翻譯，AAV可將特異神經(jīng)元跨突觸信號傳遞情況直觀反映出來[8]。這樣的試驗(yàn)結(jié)果大大方便了人們對不同神經(jīng)核團(tuán)之間信號傳導(dǎo)的研究(包括不同腦半球之間的信號溝通)，但也體現(xiàn)出另外一個問題：即如何保證外源基因隨載體進(jìn)入目標(biāo)神經(jīng)元后的表達(dá)周期內(nèi)，病毒不會因擴(kuò)散至相鄰的神經(jīng)核團(tuán)帶來試驗(yàn)數(shù)據(jù)的干擾？為了驗(yàn)證這種情況是否存在，我們在考慮參考文獻(xiàn)[4]提出的3個基本問題的基礎(chǔ)上，利用對照試驗(yàn)中常用的AAV2-CMV- EGFP(1.3×1011mg/L)對3周內(nèi)病毒的擴(kuò)散區(qū)域進(jìn)行了檢測；同時，驗(yàn)證了不同滴度和注射方式下，AAV能否在注射區(qū)域附近局限性表達(dá)，期望可以為AAV相關(guān)技術(shù)在獸醫(yī)研究應(yīng)用中的普及提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)試驗(yàn)使用的小鼠為C57BL/6雄性小鼠(6周,20～23 g)，購自北京維通利華公司。小鼠飼養(yǎng)在12/12 h周期的環(huán)境下(光照時間為07：00至19：00)。按照《內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物使用和護(hù)理指南》的道德標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)(批準(zhǔn)號SYCK2014-002)。腦立體定位前2 h，移除小鼠的水和食物。

1.2 腺相關(guān)病毒載體腦立體定位注射選擇Dil Stain (D3911,ThermoFisher)用于確定注射位點(diǎn)。使用1%～3%異氟烷進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，0.3%異氟烷用于呼吸麻醉的維持。呼吸后固定于全自動腦立體定位儀(Neurostar,StereoDrive-DM)，根據(jù)圖譜所示位置進(jìn)行定位(stereotaxic coordinates of the mouse hypothalamus[9])。相應(yīng)位置打孔后，利用微量注射器將AAV2-CMV-EGFP(HAV1001,漢恒生物)注射于RPa (from Lambda:anterior-posterior (AP):-2.2 mm,mediolateral(ML):+0.0 mm,dorsoventral(DV):-5.5 mm,圖1)、延髓中部(from Lambda:AP:-2.2 mm,ML:+0.0 mm,DV:-3.0 mm,圖2)。普通注射:0.25 μL/min注射4 min，停針2 min；壓力注射:以0.1 μL/min，注射10 min，停針10 min。無菌條件縫合傷口皮膚，術(shù)后注射40萬單位青霉素抗菌，單獨(dú)飼養(yǎng)3～4 d自愈。

1.3 測定EGFP熒光表達(dá)部位定位注射3周后，使用蠕動泵進(jìn)行心肺灌注。預(yù)先使用預(yù)冷的生理鹽水灌注2 min,后轉(zhuǎn)為4%多聚甲醛(pH=7.4,Sigma-Aldrich)灌注20 min取材。4℃環(huán)境下使用4%多聚甲醛固定6 h，再用30%蔗糖進(jìn)行脫水，直至沉降到試管底部。

使用冰凍切片機(jī)(Slee Medical,Germany)以20 μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片，腦片按不同區(qū)域置于含0.01 mol/L PBS (pH 7.4)的12孔板。4℃環(huán)境下，使用飄片法(Free-floating)加入 0.4%TritonX-100(Sigma-Aldrich)于300 r/min恒溫孵育器(Eppendorf,ThermoMixerTMC)上清洗10 min。用1 mg/L DAPI(Sigma-Aldrich )進(jìn)行核酸染色5 min。拍照使用Nikon C2 PLUS Confocal(Nikon，Japan) 成像系統(tǒng)在其對應(yīng)的405 nm (DAPI)、488 nm (EGFP)、561 nm (Dil Stain)以及647 nm (檢測假陽性)波段下進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 高病毒滴度下的擴(kuò)散情況為研究AAV在核團(tuán)注射3周后的侵染效果，試驗(yàn)首先選用1.3×1011mg/L 這一較高滴度進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，經(jīng)普通注射方式，該滴度雖然有效地在第3周時表達(dá)了病毒載體所攜帶的EGFP熒光蛋白基因，但并不局限于延髓RPa區(qū)域及臨近區(qū)域。在下丘腦室旁核(paraventricular nucleus,PVN) 區(qū)域及其周圍，較多的特異性熒光信號被發(fā)現(xiàn)(圖1)。同樣，這種廣泛的表達(dá)情況也存在于四腦室周圍的孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)區(qū)域(圖1)。延髓中縫蒼白核 (raphe pallidus nucleus,RPa)區(qū)域及其周圍相較于前腦PVN區(qū)域，可見更為清晰的熒光信號(圖1)。

這一結(jié)果顯示了AAV在1.3×1011mg/L 滴度下可有效在3周內(nèi)由延髓RPa區(qū)域侵染至前腦PVN區(qū)域，這達(dá)到了利用腺病毒進(jìn)行遠(yuǎn)距離跨神經(jīng)元示蹤的要求。但是，同樣也提出了另外一個問題，如果要使用腺病毒進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部基因敲除或特定區(qū)域的激活、上調(diào)，這種大范圍、多核團(tuán)的外源基因表達(dá)結(jié)果顯然不符合試驗(yàn)設(shè)計的要求。

AⅠ.下丘腦PVN及其周邊區(qū)域熒光表達(dá)狀況；AⅡ.下丘腦PVN陰性結(jié)果；BⅠ.NTS區(qū)域熒光表達(dá)狀況；BⅡ.NTS區(qū)域陰性結(jié)果；CⅠ.RPa區(qū)域熒光表達(dá)狀況；CⅡ.RPa陰性結(jié)果

2.2 低滴度下2種不同腦立體定位注射方式的對比除降低注射滴度外，注射方式可能也會影響到AAV表達(dá)情況。為了盡可能將病毒載體局限于某個神經(jīng)核團(tuán)周圍，較低劑量的AAV(1.3×108mg/L)被注射在延髓區(qū)域(圖2A)。當(dāng)以0.25 μL/min速度注射4 min、停針2 min的普通注射方式進(jìn)行定位注射后，AAV在第3周的表達(dá)較弱、熒光值相對較低，難以與熒光背景進(jìn)行區(qū)分(圖2B)。當(dāng)以0.1 μL/min速度注射10 min、停針10 min的壓力注射方式進(jìn)行定位注射后，AAV在第3周的表達(dá)狀況得到了一定的好轉(zhuǎn)，熒光信號更加清晰(圖2C)。結(jié)果表明，采用0.1 μL/min速度注射10 min，停針10 min 的方式進(jìn)行注射，相比較之前的試驗(yàn)結(jié)果(圖1)，腺病毒在腦內(nèi)的表達(dá)范圍被明顯限制(圖2D～F)。

2.3 病毒載體EGFP表達(dá)結(jié)果及其非特異性熒光情況在使用較低滴度(1.3×108mg/L) 和壓力注射等方式后，可將病毒在3周內(nèi)的侵染范圍限制在局部區(qū)域(圖3)并獲得較好的熒光蛋白表達(dá)結(jié)果。此外，在使用EGFP(488 nm波長激發(fā))具有較清晰結(jié)果的掃描參數(shù)進(jìn)行成像的過程中，637 nm 激光通道未見明顯的非特異性熒光信號。由于AAV的熒光信號常與其他通道信號共同使用以表明病毒的工作狀態(tài)(如敲除，或特異性神經(jīng)元調(diào)控)。因此，這一結(jié)果預(yù)示在AAV和其他波段熒光信號共表達(dá)的試驗(yàn)設(shè)計中，使用低滴度、壓力注射的方式對獲得清晰可靠的試驗(yàn)結(jié)果具有一定的積極作用。

3 討論

目前，AAV配合Cre-Loxp重組系統(tǒng)在神經(jīng)元的在體功能研究中被廣泛應(yīng)用。利用以Cre-Loxp為首的重組系統(tǒng)發(fā)展而來的DREADDs技術(shù)可通過Gq、Gi和Gs(如hM3Dq、hM4Di和GsD)信號傳導(dǎo)途徑，在體內(nèi)環(huán)境下，對多種細(xì)胞進(jìn)行中遠(yuǎn)程和非侵入性控制，達(dá)到激活、抑制和調(diào)節(jié)GPCR信號傳導(dǎo)途徑以及神經(jīng)傳遞的目的[10-11]。而AAV依靠其安全性高、侵染性強(qiáng)、表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)為這一技術(shù)的推廣做出了巨大貢獻(xiàn)。如若由此進(jìn)一步思考，那么保證AVV有效侵染和表達(dá)的區(qū)域集中于目標(biāo)核團(tuán)就成為了利用DREADDs對特定神經(jīng)元調(diào)控成功與否的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒在高濃度情況下，其3周的擴(kuò)散范圍幾乎可以從延髓區(qū)域擴(kuò)散至前腦下丘腦區(qū)域。這樣的擴(kuò)散速率和覆蓋范圍顯然有利于使用AAV對特定神經(jīng)元進(jìn)行全腦的定位，為研究特定的神經(jīng)通路和神經(jīng)連接提供幫助[12]。但是，如果試驗(yàn)?zāi)康亩ㄎ辉谔囟ㄉ窠?jīng)核團(tuán)，如標(biāo)定和激活弓狀核(arcuate nucleus,ARC)區(qū)域的刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related peptide,AgRP)神經(jīng)元[13]，那么限制病毒在注射核團(tuán)周圍就成為了數(shù)據(jù)是否穩(wěn)定的關(guān)鍵。

A.注射部位(DAPI藍(lán)色，Dil 綠色)；B.0.25 μL/min速度注射4 min，停針2 min方式注射3周后結(jié)果；C.0.1 μL/min速度注射10 min，停針15 min方式注射3周后結(jié)果；D.壓力注射3周后PVN區(qū)域EGFP熒光表達(dá)；E.壓力注射3周后注射區(qū)域附近EGFP熒光表達(dá)；F.壓力注射3周后RPa區(qū)域EGFP熒光表達(dá)

A．病毒載體注射3周后，EGPF表達(dá)狀況；B.488 nm激光激發(fā)下EGFP的局部表達(dá)；C.637 nm激光激發(fā)下病毒載體非特異性熒光狀況

本試驗(yàn)中，采用降低病毒滴度和采用壓力注射的方式來限制病毒的擴(kuò)散范圍和確保病毒載體的高效表達(dá)。當(dāng)病毒滴度降為1.3×108mg/L時，病毒的擴(kuò)散范圍和表達(dá)效果受到了一定的減弱(圖2B)，但是這種表達(dá)因其外源基因表達(dá)量較低，難以充分發(fā)揮出腺病毒高表達(dá)效率的特點(diǎn)。因此，在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，采用了壓力注射的方式，期望以較低的注射速度和較長的停留時間使得注射部位可以有較多的病毒載體存在。相比普通核團(tuán)注射方式，這種注射方式可以使得病毒載體的表達(dá)效果得到一定的提升，并且病毒載體在3周后的擴(kuò)散范圍也基本停留在注射核團(tuán)附近。因此初步認(rèn)定，降低病毒滴度至1.3×108mg/L并配合壓力注射的方式，可以使得AAV所攜帶的外源基因在延髓具有高表達(dá)和區(qū)域性的特點(diǎn)。此外，鑒于AAV中的EGFP基因在應(yīng)用過程中存在一定的假陽性問題，且高滴度下尤為明顯[14]，我們在488 nm和647 nm激發(fā)波長下使用相同的成像參數(shù)進(jìn)行了掃描，結(jié)果顯示在得到較好的外源基因表達(dá)結(jié)果的參數(shù)下，647 nm激發(fā)波長下的熒光結(jié)果(相比488 nm激發(fā)波長)沒有出現(xiàn)明顯的假陽性現(xiàn)象。

綜上所述，在AAV有效性得到保障、外源基因片段對載體干擾性較小的情況下，選擇較低滴度的腺病毒(1.3×108mg/L)并結(jié)合壓力注射的方式可以在一定程度上保證外源基因的高效和區(qū)域性表達(dá)，且沒有明顯的假陽性現(xiàn)象。