牛傳染性鼻氣管炎疫苗的研究進展

李東麗，葛桂陽，劉 藝，郜艷雪，徐 寧，欒美慧，時 坤，李健明，冷 雪*，杜 銳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；3.教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室/吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室,吉林 長春 130118)

牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)又被稱為“紅鼻病”或“壞死性鼻炎”，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)即牛皰疹病毒1型(BoHV-1)感染所引起的一種高度接觸性傳染病。IBRV是存在于牛體內(nèi)的一種可導(dǎo)致牛出現(xiàn)呼吸困難、高熱和流產(chǎn)等癥狀的皰疹病毒[1]。IBRV即牛皰疹病毒1型(bovine herpes virus type 1，BoHV-1)，是皰疹病毒科的成員，可編碼73個蛋白[2]，其中g(shù)B、gC、gD和gE可誘導(dǎo)宿主發(fā)生免疫應(yīng)答。IBRV可在三叉神經(jīng)建立潛伏感染[3]，組織嗜性廣，可感染呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和眼結(jié)膜等[4]，并能夠垂直傳播。臨床上患病肉牛育肥率會大幅度降低，患病母牛繁殖率可顯著下降，且嚴重影響奶牛的產(chǎn)奶率，對全世界養(yǎng)牛業(yè)都存在著巨大的沖擊。19世紀50年代在美國首次發(fā)現(xiàn)IBRV，我國則于20世紀80年代從新西蘭進口牛中首次分離獲得IBRV[5]。該病在世界范圍內(nèi)均有流行，世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)將其列為B類疫病，亦屬于我國二類動物疫病。我國是IBRV感染率相對較高的國家，2013年之前我國IBRV感染率為32%，2013年以后升至43%[6]，目前主要通過疫苗免疫的手段來防控或根除此病。因此，現(xiàn)主要介紹IBR滅活疫苗和弱毒疫苗2種常規(guī)疫苗和亞單位疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗和病毒活載體疫苗4種基因工程疫苗的研究現(xiàn)狀及優(yōu)缺點，以期為IBR疫苗的研究與開發(fā)提供參考。

1 常規(guī)疫苗

1.1 滅活疫苗IBR滅活疫苗即IBRV滅活后與合適佐劑共同制成的疫苗。ROMERA等[7]用β-半乳糖苷酶替代gE基因，將其制成減毒活疫苗和滅活疫苗，研究表明2種制劑均可產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，且病毒的釋放量減少，但是滅活疫苗的免疫效果不及減毒活疫苗。KAMARA等[8]制備含有氫氧化鋁凝膠(algel)和油性佐劑(montanide)的IBR滅活疫苗，其中用β-丙內(nèi)酯(BPL)對滴度為108.37TCID50/mL的IBRV進行滅活，這2種滅活疫苗均可誘導(dǎo)較好的抗體應(yīng)答，是制備滅活疫苗佐劑的選擇之一。據(jù)報道，將磺胺脂環(huán)糊精加入角鯊?fù)樗芤喝閯┲?SL-CD/S/W)作為佐劑制備的IBR滅活疫苗效果好，且該佐劑將含水抗原懸浮液與即用型佐劑配方混合可產(chǎn)生非常穩(wěn)定的乳液，因此，該佐劑在制備IBR疫苗中占重要地位[9-10]。雖然IBR滅活疫苗具有較好的安全性，但由于IBR滅活疫苗存在免疫期短、免疫原性較差、不能在體內(nèi)增殖(基本不引起細胞免疫)等缺點，因此，滅活疫苗不是根除IBR最有效的疫苗。

1.2 弱毒疫苗弱毒疫苗即人工致弱或自然篩選的弱毒株經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗。冷雪等[11]用IBRV LN01/08株連繼傳70代獲得IBRV LNM致弱疫苗，研究表明該弱毒疫苗的免疫期長達12個月，后備母牛免疫后未出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎及木乃伊胎,1月齡犢牛及6～8月齡牛無異常臨床癥狀，病毒分離數(shù)及排毒時間相較于強毒感染低。據(jù)報道，日本研制的“優(yōu)質(zhì)改良疫苗”在安全方面有很大突破，但是免疫牛的局部黏膜會出現(xiàn)弱毒增殖的現(xiàn)象[12]，不能達到徹底根除該病的效果。D'OFFAY等[13]將分離的6個IBRV野毒株進行了全基因組測序，3種分離物(2種呼吸道和1種胎兒)被鑒定為疫苗衍生的分離株，該研究表明IBR弱毒疫苗和野生型病毒之間的重組可以在自然條件下發(fā)生并引起疾病，這一結(jié)論體現(xiàn)了弱毒疫苗的不安全性。弱毒疫苗免疫效果優(yōu)于滅活疫苗，但是大多數(shù)弱毒疫苗基本上均通過肌肉注射的方式進行免疫，易造成減毒不充分而引起母牛流產(chǎn)的現(xiàn)象。另外，弱毒疫苗免疫效果亦受運輸、保存條件限制等多種因素的影響。

雖然弱毒疫苗存在長期散毒、潛伏感染、無法區(qū)分野毒感染和疫苗免疫等安全性缺陷，但是常規(guī)疫苗的研制和生產(chǎn)相對容易，而且有分析表明接種傳統(tǒng)疫苗可使懷孕母牛因受IBRV攻擊產(chǎn)生流產(chǎn)的風(fēng)險降低60%左右[14]。因此，全球IBR常規(guī)疫苗的使用較為普遍。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，常規(guī)疫苗的缺陷會得到改進。

2 基因工程疫苗

2.1 亞單位疫苗亞單位疫苗主要誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫，可以改善抑制潛伏感染的情況，一般與佐劑配合使用來提高其免疫原性。IBRV誘導(dǎo)強烈的病毒特異性CD8 T細胞反應(yīng)。HART等[15]鑒定出4種抗原為ICP4、ICP22和CIRC及1種包被蛋白UL49，對CD8 T細胞株表位特異性分析表明以上蛋白是IBRV免疫牛CD8 T細胞應(yīng)答的主要靶點，是亞單位疫苗的主要候選抗原。TRUDEL等[16]將IBRV膜蛋白純化后吸附在糖苷奎爾上與免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)制成IBR亞單位疫苗，將其免疫IBRV抗體陰性的犢牛，與免疫商業(yè)減毒疫苗相比表現(xiàn)出高水平的免疫誘導(dǎo)，表明其作為亞單位疫苗的潛力。IBRV中的糖蛋白gB、gC和gD具有免疫原性，其中g(shù)D是免疫原性最好的可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的糖蛋白，負責(zé)病毒在宿主細胞內(nèi)的滲透，同時參與病毒的吸附和膜融合，可抑制病毒的復(fù)制，所以IBRV gD基因亞單位疫苗的應(yīng)用更廣泛[17-18]。CASTRUCCI等[19]研究了8種商業(yè)疫苗(滅活疫苗、改良弱毒疫苗、亞單位疫苗、基因缺失疫苗等)的效果，其中改良活疫苗和基因缺失疫苗預(yù)防效果較好，而亞單位疫苗不能對免疫牛起到全面臨床保護，且接種后犢牛的病毒傳播持續(xù)幾天，表明亞單位疫苗存在的免疫效力問題。RANKIN等[20]選擇頸部肌肉免疫的方法分別將截短分泌形式的糖蛋白D(tgD)和不同劑量的明礬、未甲基化CpG基序(CpG ODN)、明礬和CpG ODN兩者組合接種小牛，結(jié)果顯示接種含CpG ODN的tgD產(chǎn)生的免疫應(yīng)答更強、更持久，同時引起的局部組織反應(yīng)更溫和，且顯著減少鼻內(nèi)病毒攻擊后病毒排毒的時間，表明該佐劑的有效性較高。IBR亞單位疫苗的缺點在于無法在體內(nèi)復(fù)制，并且接種量大，制作成本高，因此對于其廣泛推廣具有較大限制。

2.2 DNA疫苗DNA疫苗又被稱為核酸疫苗或者基因疫苗，是基因工程技術(shù)在疫苗研究方面的一項重大突破。DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比具有效果更加穩(wěn)定、易于構(gòu)建和生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，并且可誘導(dǎo)持久的細胞和體液免疫。IBRV的gD糖蛋白是制備DNA疫苗較好的選擇之一，CHOWDHURY等[21]利用gD糖蛋白構(gòu)建DNA疫苗后免疫水牛，可誘導(dǎo)水牛產(chǎn)生特異性和保護性的免疫反應(yīng)。LANGELLOTTI等[22]研究ISA25、ISA206和Cliptox等3種佐劑對于IBR DNA疫苗的作用，結(jié)果表明以上3種佐劑均可誘導(dǎo)特異性體液和細胞免疫應(yīng)答，可作為IBR DNA疫苗的有效佐劑。有報道稱細胞因子、趨化因子和共刺激分子作為分子佐劑可用于調(diào)節(jié)DNA疫苗，且抗原和佐劑在免疫過程中始終在一起有利于疫苗免疫，同時免疫途徑可影響分子佐劑的效果[23]。QUATTROCCHI等[24]研究了分別加入佐劑ESSAI 903110和MontanideTM1113101的含有IBRV gD序列的DNA疫苗，結(jié)果顯示含有佐劑MontanideTM1113101的DNA疫苗可提高細胞免疫，并且能夠減少病毒的排出。PETRINI等[25]為檢測DNA疫苗對犢牛的安全性及有效性，分別注射4種疫苗：pVAX-tgD、pVAX-tgD與pVAX-48CpG共免疫、pVAX-UbiLacl-tgD-L、pVAX-UbiLacl-tgD-1與pVAX-48CpG共免疫，結(jié)果顯示只有pVAX-tgD與pVAX-48CpG共免疫的疫苗在接種后56 d產(chǎn)生體液免疫。CASELLI等[26]用歐洲Cooper型BHV-1分離株(Ield strain 97/1TN)的擴增產(chǎn)物作為DNA模板獲得野生型(gB/gD)和截短形式的糖蛋白基因(gBt/gDt)，并分別克隆到pVAX載體中，研究表明，截短的gBt/gDt疫苗通常比其野生型gB/gD疫苗誘導(dǎo)的以中和抗體的存在為特征的體液應(yīng)答更加有效。近幾年，大多數(shù)關(guān)于佐劑對于DNA疫苗影響的研究表明DNA疫苗佐劑的選擇仍有一定局限性，且DNA疫苗效力低，因此，IBR DNA疫苗的大范圍使用依然不理想，不適用于IBR感染率較高的國家或地區(qū)，并且關(guān)于其體液免疫效果仍需深入研究。

2.3 基因缺失疫苗隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，IBR基因缺失疫苗已成為該病疫苗研究的主要方向之一?；蛉笔б呙缱钪饕奶攸c是由于其某一相關(guān)毒力基因部分或者完全缺失，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體與自然感染產(chǎn)生的抗體有所不同[27]，可用于區(qū)分自然感染牛和免疫接種牛?；蛉笔б呙鐟{借其毒力較弱、毒力返強的可能性低和潛伏感染的可能性低等優(yōu)點，已經(jīng)在歐洲普遍使用[28]。

2.3.1未插入外源基因的IBR基因缺失疫苗 糖蛋白gE是IBRV最主要的功能蛋白之一，與gB、gC、gD相比抗原性較差，但是gE可以在病毒表面進行高水平表達，影響病毒在感染細胞中的釋放而降低病毒的傳播。據(jù)報道，重復(fù)使用滅活和減毒的gE缺失標記疫苗，尤其在冬季對接種疫苗的牛群進行適當(dāng)管理可縮短根除IBRV的時間[29]。SILVA等[30]研究IBRV gE缺失滅活疫苗發(fā)現(xiàn)其有效性較好，皮質(zhì)類固醇給藥試驗發(fā)現(xiàn)雖然該疫苗引起的再活化現(xiàn)象較輕，但不能阻止病毒的潛伏感染。胸腺激酶TK是IBRV主要毒力基因中的一員，是其復(fù)制的非必需因子，因此很多學(xué)者將TK基因作為IBR基因缺失疫苗研究的重點。早在1999年，張桂紅等[31]就針對該基因構(gòu)建了IBRV TK基因缺失株，通過切除TK基因中的347 bp片段，獲得該基因缺失突變株。CHOWDHURY等[32]通過鼻內(nèi)接種的方法比較其構(gòu)建的三基因缺失突變的IBR疫苗(缺失UL49.5腔內(nèi)殘區(qū)30～32個氨基酸和胞質(zhì)尾部殘區(qū)80～96個氨基酸、gE胞質(zhì)尾部殘區(qū)和US9全基因)和gE基因缺失疫苗的保護效果，結(jié)果顯示2種疫苗均可對接種IBRV的小牛起到保護作用，并且三基因突變的IBR疫苗至少可以比gE基因缺失疫苗提前3 d清除IBRV。另外，接種三基因突變IBR疫苗組IFN濃度明顯升高，IFN反應(yīng)更迅速，即該疫苗介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答更好。

2.3.2插入外源基因的IBR基因缺失疫苗 IBRV有較大的基因組，且含有g(shù)C、gE、gG和TK等非必需基因，可以將1個或者多個外源基因插入其非必需基因位點后進行表達制成多價疫苗。李繼昌等[33]制備了IBRV的通用轉(zhuǎn)移載體pSdTK-CMB，可以在該載體內(nèi)插入牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)等。REN等[34]將口蹄疫病毒(FMDV)株(O/China/99)的VP1基因插入IBRV基因組的gE基因中，成功構(gòu)建出重組病毒IBRV/gE-/VP1， 重組病毒IBRV/gE-/VP1可誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生抗IBRV和FMDV VP1蛋白的抗體，研究表明重組病毒IBRV /gE-/VP1有可能被開發(fā)成FMDV/IBRV二價疫苗。BATRA等[35]評估了IBRV作為溶血性曼氏桿菌免疫原載體的潛力，用外膜蛋白PlpE代替糖蛋白gC，攜帶嵌合Lkt(公認的在BHS 溶血性曼氏桿菌引起肺炎的毒力因子)-plpE基因的載體疫苗，編碼溶血性曼氏桿菌Lkt的中和表位與溶血外膜蛋白PlpE的免疫顯性暴露區(qū)，研究表明其是用于免疫大角羊(BHS)的合適載體，但是產(chǎn)生的抗體不足以保護BHS免受溶血性曼氏桿菌攻擊，用嵌合插入物的額外試驗對于開發(fā)更有效的疫苗是必需的。

IBR基因缺失疫苗與合適佐劑共同免疫可增加疫苗的免疫效果，但是對基因缺失疫苗的安全性存在質(zhì)疑，針對基因缺失疫苗可能引起懷孕母牛流產(chǎn)、向外排毒等情況，進一步優(yōu)化基因缺失疫苗是當(dāng)前研究的首要任務(wù)。

2.4 病毒活載體疫苗病毒活載體疫苗是近幾年疫苗領(lǐng)域研究的熱點之一，病毒活載體疫苗可誘導(dǎo)細胞免疫、體液免疫以及黏膜免疫，病毒活載體疫苗的應(yīng)用可大大降低養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟損失，達到一針多防的效果。IBRV中的糖蛋白gB、gC、gD具有免疫原性，其中g(shù)D是制備亞單位疫苗和基因缺失疫苗的常用糖蛋白，近幾年，gD也成為IBR活載體疫苗的研究熱點之一。DONOFRIO等[36]根據(jù)牛皰疹病毒4(BoHV-4)可容納大量外來基因和幾乎無致病性和致癌性等生物學(xué)特性，將其作為基因遞送載體，使用MuA轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)位，產(chǎn)生表達IBRV的免疫原性糖蛋白D(gD)的重組BoHV-4，并將該重組病毒免疫兔后，可產(chǎn)生高水平的針對IBRV的中和抗體。KHATTAR等[37]用新城疫病毒(NDV)疫苗株LaSota作為疫苗載體，制備了rLaSota/gDFL(表達gD而沒有任何修飾)和rLaSota/gDF(表達了一種嵌合gD，其中胞外域gD融合了NDV融合F糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾)2種重組病毒，結(jié)果表明NDV可作為IBR疫苗的載體，由于只產(chǎn)生部分保護，所以可能需要增加免疫次數(shù)。目前，IBR病毒活載體疫苗的研制相較于其他IBR疫苗研究較少，相信在不久的將來該疫苗會彌補其他IBR疫苗的不足，為IBR的防控和根除提供有效的幫助。

3 我國近年IBR研究和應(yīng)用疫苗情況

IBR對養(yǎng)牛業(yè)的危害嚴重，國外已研制了多種疫苗用于該病的防控[19]。而我國IBR疫苗的研究相對起步較晚，且近年來才有相關(guān)疫苗上市，如由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和金宇保靈生物藥品有限公司等聯(lián)合研制的牛病毒性腹瀉/黏膜病、IBR二聯(lián)滅活疫苗(NMG株+LY株)、北京生泰爾科技股份有限公司和北京華夏興洋生物科技有限公司等聯(lián)合研制的IBR滅活疫苗(C1株)，分別于2016年和2019年獲批新獸藥證書。此外，還有一些相關(guān)產(chǎn)品進入臨床試驗階段，如牛病毒性腹瀉/黏膜病、IBR二聯(lián)滅活疫苗(1型，NM01株+LN01/08株)、IBR活疫苗(LNM株)和IBR、副流感3型二聯(lián)滅活疫苗(C1株+HB0株)。除上述常規(guī)疫苗外，IBR基因工程疫苗的研究也取得了一定的進展。魏鑫[38]用分離的IBRV NMHS-1株構(gòu)建gD亞單位疫苗進行免疫家兔試驗，結(jié)果表明該疫苗有很好的免疫原性。楊姣[39]對IBRV gG-/TK-雙基因缺失疫苗進行安全性試驗，結(jié)果表明該疫苗安全性良好，且肌肉注射途徑可誘導(dǎo)更高的免疫水平；對IBRV gN-/TK-/gG-三基因缺失重組株進行兔體試驗，結(jié)果表明該疫苗具有較好的免疫原性。穆艷霞[40]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功高效地構(gòu)建了IBRV gE缺失株，并對其生物學(xué)特性進行分析，結(jié)果表明gE基因的改變和缺失不影響病毒復(fù)制，且毒力減弱。以上研究為IBR基因工程疫苗的研究奠定試驗基礎(chǔ)，并具有重要的參考價值。

4 展望

IBR是目前我國牛傳染病中感染率較高的一種傳染病，有研究表明孕酮可通過增加IBRV潛伏期重新激活的頻率，在一定程度上促進了牛體內(nèi)IBRV的傳播[41]。IBR還可與牛病毒性腹瀉-黏膜病等病毒發(fā)生混合感染，增加養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟損失。目前并無有效藥物治療IBR，針對該病毒最有效的措施即接種疫苗。雖然滅活疫苗和弱毒疫苗應(yīng)用較早，在IBR的防控中發(fā)揮了重要作用，但是這2種疫苗存在免疫原性差、運輸不方便等問題。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，IBR亞單位疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗和病毒活載體疫苗這4種基因工程疫苗的研發(fā)將彌補常規(guī)疫苗的安全性等問題，其中IBR基因缺失疫苗因其能夠降低病毒的致病性且制成疫苗后能夠與野毒株進行鑒別診斷成為近幾年研究的主流方向，相信隨著基因工程技術(shù)的蓬勃發(fā)展和新型佐劑的開發(fā)，定會提高疫苗的安全性及免疫保護效果，為研制安全有效的IBR疫苗奠定基礎(chǔ)，從而為進一步根除IBR發(fā)揮重要作用，助力養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。