畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中的空氣顆粒物

馬振華，張喜慶，劉繼軍，梁小軍，李文才，高云航*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院，寧夏 銀川750002；4.德惠市畜牧總站，吉林 德惠130300)

畜禽養(yǎng)殖業(yè)是我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中的重要支柱產(chǎn)業(yè)，更是我國經(jīng)濟體系中不可或缺的一環(huán)。近年來，隨著在產(chǎn)業(yè)鏈中引進互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)與更為科學(xué)的飼養(yǎng)管理技術(shù)，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)呈現(xiàn)出快速發(fā)展的態(tài)勢[1]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，截止到2017年底，我國養(yǎng)牛量9 039萬頭，養(yǎng)羊量30 232萬只，肉豬年出欄量70 202萬頭，極大地滿足了人們生活中對動物制品的需求[2]。與此同時，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)也正在面臨著巨大的疫病防控壓力，自2018年非洲豬瘟在我國首次出現(xiàn)以來，我國養(yǎng)豬業(yè)遭受了極大的經(jīng)濟損失，其他動物疫病也呈現(xiàn)散發(fā)狀態(tài)，當(dāng)前疫情防控形勢依然嚴(yán)峻[3]。因此，應(yīng)把防范疫病的傳播排在首要位置。疾病的傳播途徑有很多種，但在養(yǎng)殖環(huán)境中，空氣顆粒物這種肉眼不可見的傳播介質(zhì)往往被忽視，其通常攜帶有病原微生物，給人和動物帶來危害，造成不可挽回的經(jīng)濟損失。例如，1981年法國暴發(fā)口蹄疫，病毒通過空氣傳播導(dǎo)致英格蘭口蹄疫的暴發(fā)[4]；2001年，美國境內(nèi)出現(xiàn)炭疽感染致多人死亡事件，而空氣顆粒物是其主要傳播途徑[5]；此外，高濃度的空氣顆粒物會導(dǎo)致動物肺部損傷以及機體代謝紊亂[6]。

對空氣顆粒物進行深入的研究，在多個方面都具有重要意義。一方面，通過研究畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物的特征，有助于分析某些疾病的傳播機制，找到更為有效的疫病防控措施，對我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有深遠意義；另一方面，對于保障長期在養(yǎng)殖場環(huán)境中的工作人員健康也是至關(guān)重要；此外，通過實驗室進行動物試驗等對環(huán)境顆粒物的研究，了解致病機制，為臨床醫(yī)療領(lǐng)域提供理論依據(jù)。因此，對于畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物的深入研究是很有必要的?，F(xiàn)分析了目前畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物的研究動態(tài)，概述了幾種相關(guān)的研究技術(shù)與方法，以期為完善畜禽養(yǎng)殖業(yè)的疫病防控措施，改善養(yǎng)殖環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物的概述

空氣顆粒物是成分多樣的混合物，其粒徑大小一般從幾納米到幾十微米不等，能夠較長時間的懸浮于空氣中[7]。大量研究表明，畜禽舍內(nèi)具有復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu)，空氣顆粒物中的微生物水平要遠遠高于外界環(huán)境[8]。因此，現(xiàn)主要論述的是畜禽舍內(nèi)空氣顆粒物本身的生物學(xué)特性，以及對環(huán)境內(nèi)生物健康的影響。

當(dāng)微生物與懸浮在空氣中的固態(tài)或液態(tài)顆粒物相結(jié)合，形成相對穩(wěn)定的膠體分散系時，我們可將其稱之為“微生物氣溶膠”[9]。不同種類的微生物與空氣顆粒物結(jié)合也可稱之為細(xì)菌氣溶膠、真菌氣溶膠以及病毒氣溶膠等。微生物憑借膠體分散系的相對穩(wěn)定性，以其為介質(zhì)進行傳播，是引發(fā)動物患病的重要因素。當(dāng)空氣顆粒物的動力學(xué)直徑小于2.5 μm時，我們也可以將其稱為“PM2.5”。PM2.5的粒徑更小，除了會攜帶致病微生物傳播疾病以外，還能深度侵入肺部，對呼吸系統(tǒng)造成一定的損害[10]。因為空氣顆粒物具有良好的微生物承載性，以及相對容易侵入呼吸系統(tǒng)，意味著空氣顆粒物在疾病傳播過程中具有不可忽視的作用。

1.1 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物的來源在養(yǎng)殖場環(huán)境中，空氣中懸浮顆粒物的來源有多種。較為常見的有以下幾種：動物身體表面的皮屑、排出的糞便、污染的飼料與墊料、飼養(yǎng)舍內(nèi)過道的灰塵、排污口的污水等，都會隨著動物與飼養(yǎng)人員的活動過程將其揮散在空氣中。黃凱等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在喂料、清糞時，會引起舍內(nèi)空氣顆粒物濃度升高；沈丹等[12]也發(fā)現(xiàn)，雞舍空氣顆粒物主要來源于飼料、糞便和地面揚塵等。在北方的冬季，飼養(yǎng)環(huán)境較為封閉，空氣流通受限，懸浮在空氣中的顆粒物往往存在時間更久、濃度更大，這些粒徑較小的顆粒物即使沉降下來也會很容易的又飄散到空氣中，更難以清除，因此很容易導(dǎo)致疾病的傳播與反復(fù)發(fā)生[13]。

1.2 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物的危害空氣顆粒物所造成的危害更多是取決于附著在顆粒物上的微生物。從空氣顆粒物中很容易檢測到各種真菌、細(xì)菌、芽孢等，在長時間的接觸過程中，導(dǎo)致了養(yǎng)殖場動物與工作人員感染疾病，其中如牛結(jié)核等人獸共患病對工作人員的健康威脅更為嚴(yán)重。鐘召兵等[14]研究發(fā)現(xiàn)，雞舍中每天約有6.1×105CFU的氣載細(xì)菌可分別進入人和動物的肺部，危害相對較大。PM2.5因其動力學(xué)直徑較小，能夠相對容易的隨呼吸進入肺臟深部，引起呼吸系統(tǒng)的疾病。很多研究均證實了PM2.5會導(dǎo)致過敏性鼻炎、呼吸系統(tǒng)免疫損傷、支氣管上皮細(xì)胞損傷、甚至是癌癥的發(fā)生。如JEONG等[15]發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露于呼吸系統(tǒng)后，小鼠的肺和肝臟中出現(xiàn)了明顯的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。長期存在于養(yǎng)殖環(huán)境中的空氣顆粒物應(yīng)得到管理人員的重視，需采取科學(xué)的方法，如定期對畜禽舍進行合理的通風(fēng)、消毒等措施，以消除或削弱這種對健康的威脅[16]。

1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國外對于環(huán)境空氣顆粒物的研究相對較早，除了對其理化性質(zhì)、來源解析、影響因素等方面提供了豐富的研究方法外，在其對動物機體的損傷與致病機制等方面也有較深入的研究。例如，QIN等[17]發(fā)現(xiàn)，暴露在高濃度的PM2.5環(huán)境中會引起人類咽部的微生物組成發(fā)生變化；QIAN等[18]研究了豬舍空氣顆粒物誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的機制；此外，MONTOYA等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子。他們的一些研究思路與方法值得我們?nèi)W(xué)習(xí)參考。

目前，國內(nèi)對于空氣顆粒物的研究較多的是以城市街道、污水處理廠等人類公共場所以及畜禽養(yǎng)殖環(huán)境為研究對象，分析其空氣顆粒物的無機組成成分、微生物群落結(jié)構(gòu)、內(nèi)毒素含量等。任艷芹[20]研究發(fā)現(xiàn)，典型城市中，總懸浮顆粒物(TSP)中多環(huán)芳烴(PAHs)總濃度在冬季比夏季高出5～10倍，煤燃燒、交通排放和生物質(zhì)燃燒是這些有機物的主要來源；沈美艷等[21]在鴨舍環(huán)境中檢測到氣載需氧菌濃度可達7.24×103CFU/m3，氣載金黃色葡萄球菌濃度可達0.56×103CFU/m3，氣載真菌濃度可達1.66×103CFU/m3；鐘召兵等[22]研究了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MSMS)與鱟試驗(LAL)在檢測畜禽舍空氣內(nèi)毒素中的應(yīng)用效果及相關(guān)性，結(jié)果顯示這2種方式均檢測到動物舍空氣中內(nèi)毒素濃度超過了對大多數(shù)動物和人體有威脅的閾限值1.0×103EU/m3。由于我國在空氣顆粒物方面的研究稍晚，許多問題還未進行深入的研究，例如對養(yǎng)殖場空氣中抗性基因等問題的研究還相對較少，存在著較大發(fā)展空間。

2 研究方法概述

2.1 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物的收集方法對畜禽養(yǎng)殖環(huán)境空氣中的顆粒物進行收集是試驗操作的第一步，因此該操作過程是否合理往往影響著整個試驗數(shù)據(jù)結(jié)果的科學(xué)性。常見的收集方法一般有以下幾種。

2.1.1自然沉降法 原理是空氣中的顆粒物在重力的作用下，沉落到無菌的培養(yǎng)皿上，該方法出現(xiàn)時間最早。與其他方法相比，這種收集方法對于微生物的分析是最簡便的，也是最為快速的，但因其容易受到環(huán)境因素的影響，很難達到量化的水平，只能用于對空氣顆粒物進行簡單粗略的估測[23]。

2.1.2撞擊式采樣法 這種方法的原理是通過氣泵的抽吸作用，將環(huán)境空氣通過孔徑篩選，并撞擊到收集介質(zhì)上，收集介質(zhì)常分為固體型與液體型。最為常用的固體撞擊式采樣器，是將28 L/min的恒定氣流量通過各級篩孔撞擊到培養(yǎng)基上[24]，這種采樣方法的優(yōu)點是既可以對空氣顆粒物進行快速收集，同時還可以對顆粒物進行粒徑篩選，方便對采樣空氣體積進行量化計算；AGI液體撞擊式采樣器以無菌水或緩沖液為收集介質(zhì)，以12.5 L/min的恒定氣流量通過，但收集效率不及Anderson-6級空氣采樣器。

2.1.3過濾式采樣法 其原理是在環(huán)境空氣抽吸過濾膜的過程中，顆粒物直接阻留在濾膜上，是收集大氣PM2.5的常用方法，TSP大氣綜合采樣器屬于這種采樣方法。濾膜的材質(zhì)通常為玻璃纖維、聚碳酸酯、明膠、特氟龍等，在使用前需要在馬弗爐中進行滅菌操作。FERGUSON等[25]對這幾種濾膜的收集效果進行了評估，結(jié)果顯示使用玻璃纖維的濾膜收集PM2.5的效果最好。

2.1.4其他方法 如離心式采樣法、靜電場采樣法等，原理是利用離心力、直流電場等作用于空氣顆粒物并進行收集。這類采樣方法具有采集效率高、收集量大等特點，但也容易受到采集量不穩(wěn)定，采集范圍與采集條件的限制[26]。

2.2 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物成分鑒定分析

2.2.1非生物成分分析 將畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中空氣顆粒物收集后，一般會從顆粒物粒徑大小、重金屬含量、有機與無機物種類含量等方面對非生物成分進行鑒定分析。采用顆粒物檢測儀、高效液相色譜等技術(shù)，將分析結(jié)果與國家環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)比對，我們可以初步地判斷該環(huán)境中對動物與人類有哪些危害[27]。

2.2.2氣載微生物鑒定分析 一般需要進行菌群多樣性分析、菌群豐度計算、致病菌的分離鑒定等研究；此外對可能產(chǎn)生氣載微生物的源頭采樣，比對分析菌群多樣性與菌群豐度，進而追溯微生物來源；通過改變環(huán)境條件，分析氣載微生物菌群結(jié)構(gòu)變化，以尋找改善動物舍空氣質(zhì)量的方法。例如：許光素等[28]對污水處理廠細(xì)菌氣溶膠進行了群落結(jié)構(gòu)分析。試驗上一般是將收集到的氣載微生物經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)與菌落計數(shù)；提取DNA與PCR擴增，通過凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物后進行高通量測序；根據(jù)測序結(jié)果確定微生物種類并進行統(tǒng)計學(xué)分析。這些研究對減少氣溶膠的產(chǎn)生與切斷疾病的傳播途徑具有重要的指導(dǎo)意義，為實際應(yīng)用中的疫病防控措施提供新的思路。

2.2.3氣載耐藥菌以及耐藥基因鑒定分析 大量研究表明，許多養(yǎng)殖戶因促使動物快速生長等目的，濫用抗生素，造成動物制品中藥殘含量過高、誘導(dǎo)養(yǎng)殖環(huán)境中大量的抗生素耐藥菌的產(chǎn)生[29]。耐藥菌的長期存在，對養(yǎng)殖環(huán)境的危害不言而喻。其研究方法一般是對氣載細(xì)菌進行分離培養(yǎng)與藥敏試驗、利用熒光定量PCR技術(shù)對耐藥基因進行定量檢測等。柳敦江[30]對雞舍內(nèi)的氣載金黃色葡萄球菌進行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)有78.5%的菌株對青霉素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。研究空氣中耐藥菌及耐藥基因的存在情況，對獸醫(yī)臨床用藥的選擇提供方向，防止耐藥菌的產(chǎn)生造成不必要的經(jīng)濟損失。

2.2.4氣載內(nèi)毒素的研究與分析 內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁破碎后產(chǎn)生的物質(zhì)，其主要成分是脂多糖(LPS)，會對動物與人體產(chǎn)生危害，導(dǎo)致機體發(fā)熱、代謝性酸中毒甚至休克[31]。因此，針對氣載內(nèi)毒素的研究同樣具有較大意義。溫暖家[32]優(yōu)化了氣載內(nèi)毒素的采集與檢測方法。內(nèi)毒素檢測方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MSMS)與鱟試劑檢測法(LAL)，其中鱟試劑檢測法因其方便快速，價格低廉等特點，成為最為常用的檢測方法。

2.3 空氣顆粒物致病機制的研究與分析研究表明，空氣顆粒物會引起動物的呼吸系統(tǒng)疾病，因此近幾年國內(nèi)外也把視線放在了對空氣顆粒物的致病機制的研究上。通過建立動物體內(nèi)體外PM2.5暴露模型，結(jié)合生物學(xué)檢測技術(shù)，探究空氣顆粒物對組織與細(xì)胞的影響，進而尋找出致病機制。

2.3.1試驗動物及體外細(xì)胞攻毒 同時在宏觀與微觀上來了解空氣顆粒物對機體的影響，需要在體內(nèi)攻毒與體外細(xì)胞攻毒2個方面著手。動物在畜禽舍環(huán)境中，空氣顆粒物會直接作用于呼吸系統(tǒng)，因此為模擬真實情況，對于體內(nèi)攻毒常常選擇呼吸系統(tǒng)給藥。如LI等[33]將顆粒物先進行超聲震蕩處理，再利用氣溶膠發(fā)生器稀釋顆粒物，通過自動吸入裝置作用于小鼠呼吸道，以此模擬真實環(huán)境。丁世彬等[34]將小鼠經(jīng)乙醚麻醉后，采用氣管滴注的方式，將事先處理好的PM2.5懸液滴入小鼠氣管，以探究PM2.5對呼吸道的損傷。顆粒物的劑量與濃度需要根據(jù)小鼠的呼吸量與體質(zhì)量合理計算，經(jīng)過慢性與反復(fù)作用后，觀察試驗動物體征情況，收集動物血液、組織、肺臟灌洗液等，以進行下一步的生化分析[35]。對于體外細(xì)胞攻毒試驗，需將顆粒物稀釋液作用于適宜的細(xì)胞系，如肺組織巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞等。暴露完成后，收集細(xì)胞與上清液，以進一步評估細(xì)胞的損傷與凋亡情況、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平與免疫反應(yīng)情況等[36]。在實際研究中，我們需要根據(jù)不同的研究目的來選擇合適的攻毒方法，以達到對真實環(huán)境更加科學(xué)的模擬。

2.3.2組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)檢測 空氣顆粒物對動物機體損傷情況的評估，常用到病理切片技術(shù)與HE染色來觀察組織增生或損傷情況；對于細(xì)胞的損傷情況則選擇掃描電鏡或共聚焦顯微鏡來觀察。如王鳳卓[37]通過對大鼠肺組織切片的觀察，發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露一段時間后，肺間質(zhì)內(nèi)可見組織細(xì)胞吞噬微量的碳末沉積，肺泡間隔增厚，以及不同程度的炎性細(xì)胞浸潤等，表明PM2.5對肺泡具有明顯的損傷作用。此外，利用ELISA方法檢測炎性因子水平，如白介素、INF-γ等，以反映機體的免疫應(yīng)答情況。張麗鳳[38]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5致使肺泡灌洗液、血清和肺組織中的炎性因子IL-4、IL-17A及氧化損傷標(biāo)志物的含量升高，表明小鼠氣道在PM2.5的作用下產(chǎn)生了過敏性炎癥。還可以利用免疫組化分析巨噬細(xì)胞含量、MTT法檢測細(xì)胞活力、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例、熒光探針法測定細(xì)胞內(nèi) ROS 水平等，來進一步詳細(xì)探究空氣顆粒物對細(xì)胞的損傷情況。WANG等[39]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞在PM2.5的作用下，試驗組與對照組相比，細(xì)胞活力明顯低于對照組，細(xì)胞內(nèi)ROS水平卻明顯高于對照組，表明PM2.5能夠引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡；類似的，周維[40]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡比例、DNA損傷水平等都隨PM2.5濃度增加而升高，這說明PM2.5不僅會損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且對DNA也同樣會產(chǎn)生一定的損傷。類如上述指標(biāo)的測定都在不同方面闡述并驗證了空氣顆粒物能夠在細(xì)胞水平上對動物機體產(chǎn)生危害。

2.3.3相關(guān)基因與蛋白表達水平檢測 空氣顆粒物在引起機體損傷的過程中，往往伴隨著相關(guān)基因與蛋白表達水平的上調(diào)與下調(diào)。通過同時設(shè)置對照組與抑制組的方式，來比較分析差異性表達的基因與蛋白，進而研究空氣顆粒物對機體在分子水平上的致病信號機制。對于檢測損傷相關(guān)的基因與蛋白表達情況主要是qPCR技術(shù)與Western blot技術(shù)的應(yīng)用。WANG等[41]在體內(nèi)和體外試驗中發(fā)現(xiàn)，PM2.5通過激活Notch1信號途徑，誘導(dǎo)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時促進了“癌癥干細(xì)胞”特性的出現(xiàn)；ZHOU等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在PM2.5和冷應(yīng)激的共同作用下，使CD4+T細(xì)胞IL-4基因啟動子的組蛋白乙?；皆黾?，從而加重了小鼠哮喘；NING等[43]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中miRNA的異常表達，這可能與PM2.5誘發(fā)的肺癌相關(guān)通路表達異常相關(guān)。在分子水平上的此類研究，說明改善畜禽養(yǎng)殖場環(huán)境的空氣質(zhì)量對保障人類與動物健康具有重要意義，除此之外，在人類呼吸道疾病的診斷與治療上也具有參考價值。

3 展望

空氣質(zhì)量是畜禽養(yǎng)殖環(huán)境評測的一項重要指標(biāo)，因此對空氣顆粒物的研究是非常有價值的。從近幾年的相關(guān)文獻來看，未來對畜禽養(yǎng)殖環(huán)境空氣顆粒物的研究，會由研究空氣顆粒物本身及氣載微生物組成結(jié)構(gòu)，逐漸向研究其致病機制以及尋找改善養(yǎng)殖環(huán)境空氣質(zhì)量的方法過渡。隨著國家相關(guān)部門對養(yǎng)殖環(huán)境的空氣質(zhì)量愈發(fā)重視，我國目前在此方面的研究水平上較國外雖有一定差距，但相信這種差距會逐漸縮小，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)也會因此受益。