抗核抗體譜IgG檢測酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒的臨床試驗(yàn)

王思英，楊湘越

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，福建 福州 350005；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第900醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350001）

抗核抗體譜是人體各種核成分抗體的統(tǒng)稱，這些抗體主要針對細(xì)胞核中的抗原成分。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血液中存在大量的抗核抗體譜，不具有種屬和器官特異性，可與各種細(xì)胞核發(fā)生反應(yīng)[1]。現(xiàn)已證實(shí)抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）對很多自身免疫性疾病有診斷價(jià)值[2]，是系統(tǒng)性風(fēng)濕性疾病的重要診斷標(biāo)志物[3-5]，如紅斑性狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、混合性結(jié)締組織病、原發(fā)性干燥綜合征和多發(fā)性肌炎-皮肌炎等[6]。目前批準(zhǔn)上市的抗核抗體檢測試劑盒較多，且在臨床醫(yī)院得到了廣泛使用，但基層醫(yī)院因成本等原因大多沒有條件開展。為推廣國產(chǎn)抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（ELISA）的應(yīng)用，本研究以蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的抗核抗體篩查試劑盒（注冊證號：蘇械注準(zhǔn)20152401357）和INOVA Diagnostics，Inc.生產(chǎn)的抗核糖體P 蛋白抗體檢測試劑盒（注冊證號：國械注進(jìn)20142406218）為對照試劑，以EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG生產(chǎn)的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（ELISA）（注冊證號：國械注進(jìn)20162400117）為第三方試劑，對歐蒙（杭州）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司作為申請人申請的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法，擬注冊）進(jìn)行臨床驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 標(biāo)本來自2017 年11 月至2018 年3 月本院常規(guī)檢測的剩余血清樣本，在≤-20 ℃的低溫條件下長期保存，且樣本信息完整。歐蒙（杭州）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司作為申請人申請的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）臨床試驗(yàn)，已通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第900醫(yī)院的倫理審查，并批準(zhǔn)同意。臨床試驗(yàn)前申請人已與本臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)簽署協(xié)議確定合作關(guān)系，協(xié)議內(nèi)容與本試驗(yàn)用體外診斷試劑信息相符，且明確各方的職責(zé)分工。根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，本試驗(yàn)所評價(jià)試劑盒屬于二類體外診斷試劑，臨床試驗(yàn)的總血清樣本數(shù)至少200 例，100 例同源血漿樣本，由兩家醫(yī)院完成，本機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)其中的110 例有效血清樣本及58 例有效同源血漿。樣本分組為疾病組[來自系統(tǒng)性紅斑狼瘡、夏普綜合征（MCTD）、干燥綜合征、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、皮肌炎/多肌炎等患者的樣本]，疾病分類見相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7-10]，其中血清83例、血漿32例，對照組為健康人群，其中血清27名、血漿26名。

1.2 方法 本臨床試驗(yàn)采用對照試驗(yàn)和雙盲法設(shè)計(jì)，將同一樣本用待評價(jià)試劑（批號CE161229YA）、對比試劑（1 批號為MB00001，2批號為037532）及第三方試劑（批號E170823AH）進(jìn)行檢測。將待評價(jià)試劑檢測結(jié)果與對比試劑及第三方試劑結(jié)果進(jìn)行比較，評價(jià)待評價(jià)試劑與對比試劑及第三方試劑的符合率和一致性。

該產(chǎn)品用于體外半定量檢測人血清或血漿中抗下述抗原的 IgG 類自身抗體：dsDNA、組蛋白、核糖體 P 蛋白、nRNP、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1和著絲點(diǎn)。試劑盒中每個(gè)微孔板條含8個(gè)可拆分的包被有上述混合抗原的微孔。第1次溫育時(shí)，已稀釋患者樣本在微孔中反應(yīng)。如果樣本陽性，特異性IgG（也包括IgA 和IgM）與抗原結(jié)合；為檢測結(jié)合的抗體，加入酶標(biāo)抗人IgG抗體（酶結(jié)合物）進(jìn)行第2次溫育。然后加入酶底物，發(fā)生顏色反應(yīng)。對比試劑和第三方試劑操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示。兩種診斷試驗(yàn)的一致性用符合率和Kappa值表示。Kappa值＞0.75，為一致性好；Kappa值0.40～0.75，為一致性一般；Kappa值＜0.40，為一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 待評價(jià)試劑與對比試劑檢測結(jié)果比較 待評價(jià)試劑與對比試劑1 檢測結(jié)果陽性符合率為49%，陰性符合率為98%，總符合率為67%，Kappa值為0.40，表明待評價(jià)試劑盒與對比試劑盒1 血清檢測結(jié)果符合性不佳，見表1。待評價(jià)試劑與對比試劑2檢測結(jié)果陽性符合率為100%，陰性符合率為70%，總符合率為71%，Kappa值為0.08，表明待評價(jià)試劑盒與對比試劑盒2 血清檢測結(jié)果符合性不佳，見表2。待評價(jià)試劑與對比試劑1 和對比試劑2 檢測結(jié)果陽性符合率為49%，陰性符合率為98%，總符合率為67%，Kappa值為0.40，表明待評價(jià)試劑盒與對比試劑盒1和對比試劑盒2綜合檢測結(jié)果的符合性不佳，見表3。待評價(jià)試劑與第三方試劑檢測結(jié)果陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，總符合率為100%，Kappa值為1.00。表明待評價(jià)試劑盒與第三方試劑盒檢測血清的檢測結(jié)果符合性很好，見表4。待評價(jià)試劑與對比試劑和第三方試劑檢測結(jié)果陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，總符合率為100%，Kappa值為1.00，見表5。待評價(jià)試劑血清與同源血漿檢測結(jié)果陽性符合率為100%，陰性符合率為97%，總符合率為98%，Kappa值為0.96，表明待評價(jià)試劑盒血清與同源血漿檢測結(jié)果符合性良好，見表6。

表1 待評價(jià)試劑與對比試劑1檢測結(jié)果比較Table 1 Comparison of test results between reagent to be evaluated and comparison reagent 1

表2 待評價(jià)試劑與對比試劑2檢測結(jié)果比較Table 2 Comparison of test results between reagent to be evaluated and comparison reagent 2

表3 待評價(jià)試劑與對比試劑1和對比試劑2檢測結(jié)果比較Table 3 Comparison of the test results of the reagent to be evaluated with the comparison reagent 1 and the comparison reagent 2

表4 待評價(jià)試劑與第三方試劑檢測結(jié)果比較Table 4 Comparison of test results of reagents to be evaluated and third-party reagents

表5 待評價(jià)試劑與對比試劑和第三方試劑檢測結(jié)果比較Table 5 Comparison of the test results of the reagent to be evaluated with the comparison reagent and the third-party reagent

表6 待評價(jià)試劑血清與同源血漿檢測結(jié)果比較Table 6 Comparison of detection results of serum to be evaluated reagent and homologous plasma

2.2 在110 例有效檢測血清樣本中，待評價(jià)試劑與對比試劑1和對比試劑2綜合結(jié)果間共出現(xiàn)36例不一致結(jié)果，經(jīng)過第三方試劑檢測，待評價(jià)試劑與對比試劑/第三方試劑的結(jié)果完全相符。綜合所有檢測結(jié)果，認(rèn)為待評價(jià)試劑盒與對比試劑/第三方試劑血清檢測結(jié)果符合性良好。待評價(jià)試劑盒血清與同源血漿不符合的1 份樣本的檢測結(jié)果在cutoff 值附近，因此會(huì)因?yàn)閱未螜z測的不同而導(dǎo)致結(jié)果的偏差，不足以否定待評價(jià)試劑對于血清樣本和血漿樣本檢測能力一致的結(jié)論。

3 討論

朱華強(qiáng)等[6]研究表明，ANA 陽性見于各類AID 中，即ANA陽性并不僅見于SLE患者血清中，也可在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和非風(fēng)濕性疾病患者中發(fā)現(xiàn)，如肝病、甲狀腺疾病、傳染病和惡性疾病，在老年人中也可發(fā)現(xiàn)[5]。因此，基層的篩查顯得尤為重要?？购丝贵w譜檢測試劑大量應(yīng)用于自身免疫性疾病或健康者或基層醫(yī)院的篩查費(fèi)用較昂貴（尤其使用進(jìn)口試劑時(shí)），因此，推廣國產(chǎn)試劑有利于降低成本費(fèi)用，這也是本試驗(yàn)的研究意義。但是由于方法學(xué)的局限性，目前間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）仍被認(rèn)為是測定ANA的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[11]。

本臨床試驗(yàn)采用待評價(jià)試劑盒與對比試劑/第三方試劑比較的方法評估待評價(jià)試劑的性能。通過比較待評價(jià)試劑與對比試劑之間的預(yù)期用途，發(fā)現(xiàn)待評價(jià)試劑[抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）]與對比試劑1[抗核抗體篩查試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）]比較，多用于核糖體P 蛋白這一類自身抗體的檢測，因此增加了對比試劑2（抗核糖體P蛋白抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法））與對比試劑1聯(lián)合使用作為對比試劑進(jìn)行性能評估。最終不符合的樣本，采用第三方試劑進(jìn)行檢測作為最終結(jié)果用于分析。同時(shí)，本臨床試驗(yàn)增加了待評價(jià)試劑盒與第三方試劑盒的性能對比作為性能評價(jià)的補(bǔ)充評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到目前市場上占有率最高的同類產(chǎn)品為EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG生產(chǎn)的抗核抗體譜IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法），本臨床試驗(yàn)中有必要將待評價(jià)試劑的性能與目前最廣泛使用的產(chǎn)品進(jìn)行性能比較，因此，選擇EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG 生產(chǎn)的產(chǎn)品作為第三方試劑盒，并且選擇采用第三方試劑盒將所有待檢測樣本進(jìn)行檢測。

本研究結(jié)果顯示，終待評價(jià)試劑盒與對比試劑/第三方試劑的血清檢測陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，總符合率為100%，kappa值為1.00。待評價(jià)試劑盒檢測血清與同源血漿檢測陽性符合率為100%，陰性符合率為97%，總符合率為98%，kappa 值為0.96。檢測結(jié)果可見待評價(jià)試劑盒與對比試劑/第三方試劑血清檢測結(jié)果符合性良好，且待評價(jià)試劑盒檢測血清與同源血漿檢測結(jié)果符合性良好。本試驗(yàn)選擇對比試劑及第三方試劑均為目前國內(nèi)已上市的同類產(chǎn)品并且均在醫(yī)療機(jī)構(gòu)有一定使用，產(chǎn)品性能較受認(rèn)可。待評價(jià)試劑盒與其檢測結(jié)果符合性良好說明有一定的推廣價(jià)值。本試驗(yàn)過程中，由申請單位指派的臨床監(jiān)察員定期對試驗(yàn)單位進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)查訪問，以保證試驗(yàn)方案的所有內(nèi)容都得到嚴(yán)格遵守和填寫試驗(yàn)資料的正確。參加試驗(yàn)人員經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)，統(tǒng)一記錄方式與判斷標(biāo)準(zhǔn)。整個(gè)臨床試驗(yàn)過程均在嚴(yán)格操作下進(jìn)行。在臨床試驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理階段均有相應(yīng)的數(shù)據(jù)管理措施。參與臨床試驗(yàn)的單位實(shí)驗(yàn)室建立實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和質(zhì)量控制程序保證了本試驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠性。

綜上所述，本試驗(yàn)中的待評價(jià)試劑與對比試劑/第三方試劑的檢測結(jié)果有良好的一致性，提示有較好的臨床適用性。