p53在層流剪切應(yīng)力下對EPCs分化及功能的影響*

王美月， 賀燕婷， 于 潔， 崔曉棟， 成 敏， 張曉蕓

（濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053）

目前心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）占據(jù)人類死因的首位［1］，內(nèi)皮損傷與修復(fù)的失衡導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙是眾多心血管疾病的主要原因［2］。內(nèi)皮損傷可通過損傷部位附近內(nèi)皮細胞的局部遷移和增殖，或通過祖細胞的動員并加入損傷部位來修復(fù)。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）存在于循環(huán)系統(tǒng)中，當(dāng)血管產(chǎn)生損傷時，EPCs由骨髓動員到受損部位，通過增殖并向內(nèi)皮細胞分化參與受損血管的內(nèi)皮修復(fù)，在參與及維持血管的正常功能中起著重要作用［3-4］。EPCs 因為其較高增殖、遷移以及血管形成能力成為了再生心血管醫(yī)學(xué)治療內(nèi)皮損傷以及缺血性損傷的有效工具及重要靶點［5］。

剪切應(yīng)力（shear stress，SS）是由血管壁上血液流動產(chǎn)生的流體動力，在維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中起著重要作用［6-7］。文獻及我們前期的實驗表明，血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力能對EPCs 分化及血管修復(fù)能力起調(diào)節(jié)作用，穩(wěn)定的層流剪切應(yīng)力（laminar shear stress，LSS）會促進內(nèi)皮祖細胞向內(nèi)皮細胞分化并增強其血管修復(fù)能力［8-9］，但具體機制并不十分明朗。

p53 在細胞內(nèi)的生物學(xué)功能主要是對外界各類應(yīng)激原產(chǎn)生應(yīng)答，啟動損傷的DNA 修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定，因此p53 曾被稱為“基因組衛(wèi)士”。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)p53 還參與眾多細胞的分化與轉(zhuǎn)分化。Lin 等［10］的實驗表明，LSS 可以通過p53 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的凋亡，維持血管內(nèi)皮的穩(wěn)定。LSS 是否能夠通過p53 調(diào)節(jié)EPCs 的功能及分化尚未見報道。本研究主要探討了LSS 通過p53 對EPCs 功能及分化的影響，以期探尋潛在的生物靶點分子。

材料和方法

1 主要試劑和材料

SD 大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁殖中心，許可證號為SCXK（魯）2019-0003。EGM-2MV 培養(yǎng)基（Lonza）；M199 培養(yǎng)基和Trizol 試劑（Invitrogen）；纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Histopaque-1083 淋巴細胞分離液和FITC-UEA-1（Sigma）；0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（Hyclone）；Matrigel（BD）；pifithrin-α（Selleck）；DiI-Ac-LDL（上海懋康生物科技有限公司）；vWF 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；CCK-8 檢測試劑盒（Dojindo）、EdU 檢測試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；熒光定量PCR 試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；抗p-p53 抗體、抗p53 抗體、抗CD31 抗體和抗vWF 抗體（Abcam）；抗CD45抗體（Cyagen）；抗血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor recep?tor 2，VEGFR2）抗體（Cell Signaling Technology）。

2 主要方法

2.1 骨髓單個核細胞分離、培養(yǎng)與晚期EPCs 的鑒定 將大鼠頸椎脫臼處死，置于75%乙醇中浸泡10 min，然后將大鼠四肢剪下，放在含有75%乙醇的平皿中，超凈工作臺中剃去肌肉組織，剪去四肢長骨兩端骨骺，反復(fù)吹打直至骨髓腔變白。將獲得的細胞懸液離心、清洗并重懸，加到密度梯度離心液上方，離心后吸取中間層云霧狀細胞，用PBS 清洗3 次，最后一次清洗完畢之后加入EGM-2 培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，5 d 后換液，以后每隔3 d 更換培養(yǎng)液。本實驗采用晚期EPCs（3～4代細胞）作為研究對象。

待細胞傳代至3 代以后，將細胞消化接種至24孔板中。將DiI-Ac-LDL 按5 mg/L 加入24 孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，培養(yǎng)液吸出，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，按500 mg/L 加入FITCUEA-1置于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，PBS清洗，熒光顯微鏡下拍照。采用流式細胞術(shù)檢測晚期EPCs 細胞表面標(biāo)志物CD45、CD31、vWF及VEGFR2的表達。

2.2 實驗分組 選取3～5 代的大鼠EPCs，分為：（1）LSS 組：施加12 dyn/cm2的LSS 處理細胞，檢測相關(guān)指標(biāo)；（2）LSS+pifithrin-α 組：在培養(yǎng)基中加入pifithrin-α（10 μmol/L）并施加12 dyn/cm2的LSS 處理細胞，檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.3 LSS 的加載 LSS 系統(tǒng)（Flexcell）由蠕動泵、流室系統(tǒng)、儲液瓶及導(dǎo)管組成。將細胞接種于用FN 打底的專用載玻片上，待細胞生長至80%左右將其放于無菌處理的流動腔系統(tǒng)中，連接裝置。蠕動泵帶動培養(yǎng)基構(gòu)建層流剪切應(yīng)力裝置，通過計算機控制力學(xué)加載系統(tǒng)，設(shè)置12 dyn/cm2的LSS 作用于細胞。整個裝置置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

2.4 Western blot實驗 細胞經(jīng)不同處理之后，取下載玻片，放在4 孔板中，PBS 洗2 次，將殘余PBS 用吸水紙吸凈；加入蛋白裂解液裂解細胞，蛋白收集完之后用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，進行蛋白定量。用5%濃縮膠以及10%的分離膠進行蛋白樣品的分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上封閉，分別用抗pp53（1∶500，兔源）和p53（1∶1 000，兔源）、β-actin（1∶2 000，兔源）的Ⅰ抗孵育過夜，次日用1× TBST 洗5次，加入Ⅱ抗（1∶2 000，羊抗兔）孵育，在ECL 化學(xué)發(fā)光儀上顯影并記錄數(shù)據(jù)。

2.5 RT-qPCR 細胞經(jīng)不同條件處理之后，用PBS洗2次，吸去殘余液體，加入1 mL Trizol裂解細胞，提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用RT-qPCR 法擴增相應(yīng)的目的基因，將GAPDH 作為參照，引物序列見表1。以2-ΔΔCt公式計算相關(guān)基因的相對表達改變。

2.6 流式細胞術(shù) 胰酶消化收集細胞，PBS 洗2次，1 500 r/min 離心5 min，棄上清；加入抗CD31（或CD45）抗體室溫孵育1 h，洗滌后加入熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，4℃避光孵育1 h，PBS再次洗滌后上機檢測；vWF（或VEGFR2）染色時，先用4%多聚甲醛中固定10 min，離心，加入0.2%的吐溫破膜，而后洗滌加入vWF（或VEGFR2）I 抗室溫孵育1 h，加入熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，4℃孵育1 h，上機檢測。

2.7 ELISA 檢測 收集流槽系統(tǒng)中的上清，置于凍干機凍干20 h，取出凍干粉末，加2 mL 的培養(yǎng)基溶解，4℃、1 000×g 離心20 min，取上清檢測，具體步驟按照大鼠血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒操作。

2.8 體外成管能力檢測 將預(yù)冷24 h 的Matrigel基質(zhì)膠按每孔80 μL 的量接種到96 孔板中，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中膠化1 h，將處理后的EPCs按每孔2×104的細胞量接種到已固化處理的基質(zhì)膠上，顯微鏡下觀察不同時點細胞體外成管形成情況。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 細胞遷移 胰酶消化細胞并制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度至3×104。在Boyden 小室的下室加滿培養(yǎng)液，中間放8 μm 濾膜，上室懸空滴加200 μL 細胞懸液，蓋上蓋玻片，將小室放于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。取下濾膜，用棉簽輕輕擦去上層未完全遷移的細胞，反向放置在12 孔板中，1×PBS 清洗，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI 染核15 min，避光保存，在熒光顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)細胞遷移量。

2.10 CCK-8 法檢測細胞活力 將處理組的EPCs用胰酶消化，按每孔2×104細胞量加入96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對數(shù)生長期時取出，加入CCK-8 檢測緩沖液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm 處檢測每孔的A 值，計算細胞活力。

2.11 EdU 染色法檢測細胞增殖 將不同處理之后的細胞，消化制成細胞懸液，按每孔1×104個細胞量接種于96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至對數(shù)生長期時，按1∶1 000 的比例每孔加入100 μL 的EdU 溶液，培養(yǎng)2 h 后棄培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，加入4%多聚甲醛固定液，固定30 min，棄固定液，每孔加入50 μL 的2 g/L 的甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液，PBS 清洗3 次，每孔加入100 μL 的0.5% Triton-X 孵育10 min，1×PBS 洗1次，每孔加入100 μL 的1× Apollo?染色反應(yīng)液，避光孵育30 min，棄染色液，加入100 μL 的甲醇，清洗1～2 次，1×PBS 洗1 次，加入100 μL 的DAPI 染色液，避光染色15 min，棄染色液，1×PBS洗，熒光顯微鏡下觀察并根據(jù)EdU 顯色和細胞核熒光量，計算細胞增殖率。

2.12 細胞黏附的檢測 經(jīng)過不同處理的細胞消化，制成細胞懸液。按每孔2×104個細胞量加入12孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，取出后PBS洗3次，洗去未貼壁細胞，顯微鏡下拍照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。以上實驗均獨立重復(fù)3 次以上，實驗數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來表示，兩組數(shù)據(jù)采用Student t檢驗分析，多組實驗數(shù)據(jù)采用多因素方差分析（oneway ANOVA）處理數(shù)據(jù)，以P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EPCs的鑒定

晚期EPCs形態(tài)呈鵝卵石樣或紡錘形（圖1A），具有血管形成能力（圖1B）；DiI-Ac-LDL及FITC-UEA-1熒光染色后，呈染色雙染陽性的細胞認為是正在分化的EPCs（圖1C）。流式細胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示，晚期EPCs中CD31、vWF以及VEGFR2內(nèi)皮標(biāo)志分子表達呈陽性，CD45表達陰性（圖1D）。

2 LSS對EPCs中p53及p-p53蛋白水平的影響

12 dyn/cm2的層流剪切應(yīng)力作用于EPCs 后，Western blot 檢測p-p53 和總p53 的蛋白水平。結(jié)果顯示LSS 作用3 h 后，p53 總蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，6 h 與12 h 后總p53 蛋白表達量有明顯升高（P＜0.01），見圖2A。p-p53 蛋白水平在LSS 處理30 min 和1 h 后增加，在30 min 時升高最明顯（P＜0.01），見圖2B。

3 p53在層流剪切應(yīng)力促EPCs分化中的作用

與單純的LSS 相比，LSS+pifithrin-α 組內(nèi)皮標(biāo)志分子CD31 和vWF 的mRNA 表達降低（P＜0.01），見圖3A。CD31 蛋白表達量較單純LSS 組也明顯下降，但流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示LSS處理對EPCs上vWF蛋白的表達量無影響，見圖3B。鑒于vWF 為分泌型蛋白，我們進一步檢測了流槽液上清中vWF 的分泌情況，結(jié)果顯示LSS+pifithrin-α組上清液中vWF較單純LSS組明顯降低（P＜0.01），見圖3C。

4 p53在LSS對EPCs增殖及活性影響中的作用

Figure 1. Identification of late EPCs. A：the morphological changes of late EPCs（scale bar=200 μm）；B：the ability of tube forma?tion（scale bar=200 μm）；C：fluorescence staining of FITC-UEA-1 binding and DiI-Ac-LDL uptaking（scale bar=20 μm）；D：the expression of CD31，vWF，VEGFR2 and CD45 detected by flow cytometry.圖1 晚期EPCs的鑒定

Figure 2. Effects of LSS on the protein levels of p-p53 and p53. A：effect of LSS on the protein levels of p53 at 0，3，6 and 12 h；B：effect of LSS on the protein levels of p-p53 at 0，10 min，30 min，1 h and 2 h. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs 0 h group.圖2 LSS對p-p53以及p53蛋白水平的影響

與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組的EdU 陽性率增高（P＜0.05），見圖4A；CCK-8 細胞活力實驗也顯示，其細胞活力增加（圖4B），與EdU 實驗結(jié)果一致。以上檢測結(jié)果均顯示，LSS+pifithrin-α 組EPCs 的增殖活性高于單純LSS組。

5 p53 在LSS 對EPCs 黏附、遷移和成管能力影響中的作用

EPCs 的黏附、遷移和成管是決定其內(nèi)皮修復(fù)的基本能力。我們前期研究顯示，LSS 可促進EPCs 黏附、遷移和體外成管能力。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組EPCs 的黏附（圖5A）、遷移（圖5B）和成管能力（圖5C）均降低。

Figure 3. Role of p53 in differentiation of EPCs under LSS. A：the mRNA expression of CD31 and vWF after pretreatment with pifithrin-α under LSS；B：the protein expression of CD31 and vWF in EPCs treated with pifithrin-α under LSS；C：the pro?tein level of vWF in medium after pretreatment with pifithrin-α under LSS. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs static group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LSS group.圖3 p53在LSS促EPCs分化中的作用

Figure 4. The effect of p53 on proliferation of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on proliferation of EPCs under LSS tested by EdU staining（scale bar=50 μm）；B：effect of pifithrin-α on viability of EPCs under LSS tested by CCK-8 assay. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.圖4 p53在LSS下對EPCs增殖的影響

討 論

當(dāng)血管發(fā)生損傷時，EPCs 通過骨髓動員到血液循環(huán)當(dāng)中，進而趨化、黏附到損傷部位，并向內(nèi)皮細胞分化，代替損傷或者發(fā)生凋亡的內(nèi)皮細胞，參與受損血管內(nèi)皮的修復(fù)［11］。文獻表明，EPCs 存在2 種類型，分別為早期與晚期內(nèi)皮祖細胞，早期EPCs 增殖能力較弱，以分泌功能為主，表達有干細胞標(biāo)記分子，如CD133 等；而晚期EPCs 增殖能力較強，表達內(nèi)皮標(biāo)志分子VEGFR2、CD31 及vWF 等，并可受局部內(nèi)環(huán)境影響，轉(zhuǎn)化為成熟的內(nèi)皮細胞，維持血管發(fā)生與血管生成。近期研究表明，EPCs 尤其是晚期EPCs 可作為心血管疾病中的內(nèi)皮功能的標(biāo)志物，并且在臨床細胞移植治療中具有廣闊的前景［12］。

Figure 5. Effect of p53 on adhesion，migration and tube-forming ability of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on adhesion of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）；B：effect of pifithrin-α on migration ability of EPCs under LSS（scale bar=50 μm）；C：effect of pifithrin-α on tube formation of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.圖5 p53在LSS下對EPCs黏附、遷移和成管能力的影響

剪切應(yīng)力是血流在血管內(nèi)皮表面流動所產(chǎn)生的物理應(yīng)力，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞眾多重要蛋白的表達及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中起著重要作用［13］。文獻［8］及我們的前期實驗結(jié)果表明［9，14］，剪切應(yīng)力作為一種內(nèi)在的物理因素，可以引起EPCs分化及功能改變，即LSS促進EPCs 向內(nèi)皮分化（內(nèi)皮標(biāo)志分子表達增加），遷移，黏附以及血管生成能力增強，進而影響體內(nèi)血管再內(nèi)皮化。但也有實驗表明，EPCs 在某些異常情況下，也可以向間質(zhì)細胞進行轉(zhuǎn)分化。我們前期的實驗結(jié)果表明，振蕩剪切應(yīng)力（oscillating shear stress，OSS；模擬體內(nèi)的擾動流）可以促進EPCs向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，提示EPCs 在不同環(huán)境中具有雙向分化潛能。

在過去的40 年里，眾多研究證實了p53 是強大的“基因組守護者”，而近年來研究顯示，p53 還參與細胞代謝、表觀遺傳調(diào)控、細胞多能性維持、衰老調(diào)節(jié)，也有研究表明p53 的表達升高會對細胞起保護作用，故越來越多的數(shù)據(jù)顯示p53 是一個全能的“細胞守護者”，而不僅僅是“基因組守護者”［15-16］。當(dāng)細胞受到刺激時，p53 通過磷酸化、乙?；胺核鼗确g后修飾，從而導(dǎo)致一系列的反應(yīng)。磷酸化是穩(wěn)定p53 及增強其轉(zhuǎn)錄活性的重要因素，充當(dāng)了快速打開以及關(guān)閉p53 功能的分子開關(guān)的角色［17］。部分實驗數(shù)據(jù)顯示，p53 還參與多種細胞的分化與轉(zhuǎn)分化過程［18-19］。本研究中，我們對EPCs施加12 dyn/cm2的LSS，結(jié)果顯示LSS 能夠增加p-p53 及p53 總蛋白的水平。pifithrin-α 是一種p53 的阻斷劑，也可降低核p53 的穩(wěn)定性，抑制p53 依賴性的p53 應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。本實驗中使用p53 阻斷劑pifithrin-α（10 μmol/L）阻斷p53 的作用后，發(fā)現(xiàn)與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組的EPCs 分化程度降低。內(nèi)皮分化標(biāo)記分子CD31 和vWF mRNA 表達較LSS 組明顯降低；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然CD31 蛋白表達較LSS 組明顯降低，與mRNA 表達的結(jié)果一致，但vWF蛋白變化的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。因為vWF為分泌型蛋白，我們進一步檢測了上清中vWF的變化，ELISA 檢測結(jié)果顯示，LSS+pifithrin-α 組流槽液中vWF蛋白的分泌量與LSS組相比明顯降低。

本實驗結(jié)果顯示，p53 在LSS 促內(nèi)皮祖細胞分化中起著調(diào)控作用，抑制p53 功能后，LSS 引起的EPCs成血管、遷移及黏附能力下降，但其增殖能力增強，后者可能與p53 調(diào)控細胞衰老的機制相關(guān)［20］。結(jié)合我們近期研究，即擾動流剪切應(yīng)力可以通過下調(diào)p53的表達促進EPCs 向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化［21］，我們推測，p53 可能在EPCs 的分化與轉(zhuǎn)分化中起到“分子開關(guān)”的作用，即p53 可以在LSS 作用下調(diào)節(jié)EPCs 的功能，促進EPCs 向內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化，而在OSS 作用下促進EPCs向間質(zhì)細胞分化。

綜上所述，LSS 可能通過促進p53 的磷酸化，入核后發(fā)揮啟動子的作用，促進EPCs 向內(nèi)皮細胞分化，進而影響EPCs 各種功能。p53 分子生物學(xué)功能多樣，本實驗中p53 分子在入核后發(fā)揮的具體作用以及機制我們?nèi)匀徊幻鞔_，目前正在進行深入研究。