Toll樣受體4介導(dǎo)的自噬減輕糖基化高密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡*

王曉旭， 田 華， 于 飛， 閆京銳， 劉慶華， 潘天琦，焦 鵬， 秦樹存△， 姚樹桐△

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3第二附屬醫(yī)院，山東泰安271000；4山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250355］

以動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病是糖尿病患者的主要并發(fā)癥，其發(fā)病率是非糖尿病患者的4～8 倍［1］。糖尿病患者體內(nèi)的蛋白質(zhì)等大分子的氨基與葡萄糖的醛基反應(yīng)生成晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end product，AGE），可導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙［2］，并通過活化巨噬細(xì)胞、上調(diào)氧化低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）受體表達(dá)和增強(qiáng)ox-LDL的攝取參與AS 泡沫細(xì)胞的形成［3］。血脂異常，尤其ox-LDL 被認(rèn)為是AS 發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而LDL 不僅易被氧化修飾，而且在高糖環(huán)境中可被糖基化修飾，形成糖基化LDL（glycosylated LDL，gly-LDL），并在AGE 受體（receptor for AGE，RAGE）和清道夫受體介導(dǎo)下被巨噬細(xì)胞大量攝取形成泡沫細(xì)胞［2，4-5］。高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）是一種抗AS 血漿脂蛋白，具有膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎、抗氧化等功能。糖尿病患者體內(nèi)糖基化HDL（glycosylated HDL，gly-HDL）水平較正常人顯著升高，使其抗AS 作用顯著減弱，并可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡，但其機(jī)制尚未完全闡明。

近年來研究證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在AS 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，并與自噬存在著交互作用。本課題組前期證實(shí)，自噬通過抑制C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑減輕ox-LDL 所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡［6-7］，但是gly-HDL 是否通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及自噬在其中的作用和分子機(jī)制尚不清楚。本項(xiàng)工作通過體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，探討gly-HDL 對(duì)自噬和cas?pase-12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的影響及其相互關(guān)系，并觀察Toll 樣 受 體4（Toll-like receptor 4，TLR4）在其中的作用，以進(jìn)一步闡明gly-HDL 導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的機(jī)制，為糖尿病AS 的發(fā)病機(jī)制及防治提供參考資料。

材料和方法

1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endo?thelial cells，HUVECs）購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。羧甲基賴氨酸（car?boxymethyl lysine，CML）ELISA 試 劑 盒 購 自Blue?Gene；DMEM 高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；RIPA 裂解液購自Solarbio；小鼠抗人TLR4 和兔抗人caspase-12 抗體分別購自eBioscience 和Abcam；兔抗人beclin-1 和微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-as?sociated protein 1 light chain 3，LC3）抗體購自Cell Signaling Technology；雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和兔抗β-actin 抗體購自Sig?ma；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和抗小鼠IgG 以及Alexa Fluor 488 標(biāo)記驢抗兔II 抗分別購自北京中杉金橋和Molecular Probes；MTT 和AnnexinV-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡測定試劑盒分別購自Genview 和南京凱基公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒和PVDF 膜分別購自Pierce 和Millpore；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 HDL 的提取與糖基化［8］健康人新鮮血漿HDL（1 063～1 210 g/L）采用序列超速離心法分離，在含1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的磷 酸鹽緩 沖液（phosphatebuffered saline，PBS；pH 7.4）中4℃透析，過濾除菌。將正常HDL（2 g/L）與50 mmol/L 葡萄糖在含有2 mmol/L EDTA 并充入氮?dú)獾腜BS 中無菌避光條件下37℃孵育7 d，然后在含有1 mmol/L EDTA 的PBS（pH 7.4）中充分透析以去除游離葡萄糖。另取HDL在不含糖的相同條件下處理作為正常對(duì)照。采用ELISA 法測定CML 的含量反映HDL 的糖基化程度。gly-HDL 中CML 水平［（197.9±56.9）ng/（g protein）］顯著高于HDL［（55.5±10.8）ng/（g protein）］，表明gly-HDL制備成功。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 HUVECs 用含10%胎牛 血 清、1×105U/L 青 霉 素 和100 mg/L 鏈 霉 素 的DMEM 高糖培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機(jī)分為如下6 組：（1）正常對(duì)照（control）組：培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；（2）正常HDL 組：培養(yǎng)液中加入100 mg/L的HDL；（3）gly-HDL 組：培養(yǎng)液中加入不同濃度（25、50 和100 mg/L）的gly-HDL；（4）自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理組（gly-HDL+rapamycin 組）：培養(yǎng)液中先加入1 μmol/L rapamycin 預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L gly-HDL；（5）自噬抑制劑3-MA 預(yù)處理組（gly-HDL+3-MA 組）：培養(yǎng)液中先加入2 mmol/L 3-MA 預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L gly-HDL；（6）抗TLR4單抗預(yù)處理組（gly-HDL+ TLR4 Ab 組）：培養(yǎng)液中先加入5 mg/L 抗TLR4 單抗預(yù)處理30 min，再加入100 mg/L gly-HDL。加入HDL 或gly-HDL 后繼續(xù)培養(yǎng)24 h 并收集細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞活力和LDH 測定 將細(xì)胞接種于96 孔板，按分組加藥處理后，依據(jù)既往報(bào)道的MTT分析方法檢測細(xì)胞活力［6］。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其吸光度（A）值占對(duì)照組A 值的百分比表示。培養(yǎng)液LDH 活性，需留取培養(yǎng)液上清液按照試劑盒說明書操作。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)分組加藥處理后，按照試劑盒說明書收集并重懸于500 μL binding buffer 中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 室溫避光孵育15 min。細(xì)胞凋亡率用流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）分析測定。總細(xì)胞凋亡率（%）=［早期凋亡率（Annexin V+/PI-）+晚期凋亡率（Annexin V+/PI+）］×100%。

2.5 Western blot分析 細(xì)胞經(jīng)分組加藥處理后，按照既往報(bào)道的方法［7］提取各組細(xì)胞蛋白，經(jīng)蛋白定量，凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，使用5%脫脂奶粉封閉，分別用兔抗beclin-1、caspase-12、TLR4 和β-ac?tinⅠ抗抗體4℃孵育過夜，洗膜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)Ⅱ抗孵育2 h。免疫條帶用ECL 法顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海歐翔科學(xué)儀器有限公司，Chemi Q4800mini 型）進(jìn)行圖像采集，采用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absor?bance，IA）值，以靶蛋白/β-actin IA 值的比值反映靶蛋白相對(duì)水平。

2.6 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測LC3 表達(dá) 將細(xì)胞接種于放有無菌蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞經(jīng)分組加藥處理后，PBS 潤洗3 次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 潤洗，0.1% Triton-X 100 室溫處理4 min，10%驢血清封閉，滴加1∶100 稀釋的兔抗LC3 抗體，4℃過夜。PBS 潤洗后，滴加Alexa Fluor 488 標(biāo)記的驢抗兔Ⅱ抗（1∶1 000），37℃孵育30 min，并以DAPI復(fù)染細(xì)胞核（藍(lán)色），PBS 充分潤洗后，抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡（Nikon）下觀察，LC3 陽性表達(dá)呈綠色，呈顆粒狀聚集表明發(fā)生自噬反應(yīng)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 雷帕霉素和3-MA 對(duì)gly-HDL 誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響

與正常對(duì)照組HUVECs 比較，gly-HDL 處理組自噬關(guān)鍵分子beclin-1 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與gly-HDL 處理組比較，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素進(jìn)一步上調(diào)beclin-1表達(dá)，而自噬抑制劑3-MA 可拮抗gly-HDL對(duì)beclin-1 的誘導(dǎo)作用（P＜0.05），見圖1A。gly-HDL 處理組細(xì)胞損傷明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞活力減弱、LDH 漏出增加（P＜0.01），雷帕霉素可顯著減輕gly-HDL 所造成的細(xì)胞活力降低和LDH 漏出（P＜0.05），而3-MA則進(jìn)一步加重gly-HDL 所造成的細(xì)胞損傷和LDH 漏出（P＜0.05），見圖1B、C。

2 雷帕霉素和3-MA 對(duì)gly-HDL 誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

gly-HDL組相比正常對(duì)照組凋亡率顯著增加（P＜0.01）；雷帕霉素預(yù)處理組較gly-HDL 組細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.05），而3-MA 預(yù)處理組凋亡率則較gly-HDL組顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

3 雷帕霉素和3-MA 對(duì)HUVECs 中caspase-12 表達(dá)的影響

Figure 1. Effects of rapamycin and 3-MA on the injury of HUVECs induced by gly-HDL. The cells were pretreated with or without ra?pamycin（1 μmol/L）or 3-MA（2 mmol/L）for 1 h and then stimulated with gly-HDL（100 mg/L）for 24 h. A：the protein level of beclin-1 determined by Western blot；B：cell viability determined by MTT assay；C：LDH activity in the media.Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.圖1 雷帕霉素和3-MA對(duì)gly-HDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響

Figure 2. Effects of rapamycin and 3-MA on apoptosis of HUVECs induced by gly-HDL. Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.圖2 雷帕霉素和3-MA對(duì)gly-HDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

caspase-12 作為介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑的重要分子之一，可通過檢測caspase-12 剪切活化形式（cleaved caspase-12）來顯示caspase-12 的活化程度。結(jié)果顯示，cleaved caspase-12在gly-HDL組較正常對(duì)照組水平顯著增加（P＜0.05），雷帕霉素預(yù)處理組cleaved caspase-12的水平較gly-HDL 組顯著減少（P＜0.05），而3-MA 預(yù)處理組cleaved caspase-12 的水平則較gly-HDL組進(jìn)一步上調(diào)（P＜0.05），見圖3。

4 gly-HDL 上調(diào)HUVECs 中TLR4 表達(dá)并激活自噬

與對(duì)照組相比，gly-HDL 顯著上調(diào)TLR4 和be?clin-1 的表達(dá)，尤其以100 mg/L 濃度處理組最顯著（P＜0.01），同時(shí)可顯著促進(jìn)自噬標(biāo)志分子LC3聚集、顆?；≒＜0.01）；100 mg/L HDL 處理組beclin-1 和TLR4的表達(dá)與對(duì)照組比較未見顯著差異，見圖4。

5 TLR4 中和抗體抑制gly-HDL 誘導(dǎo)的HUVECs自噬

TLR4 中和抗體預(yù)處理組較gly-HDL 組beclin-1表達(dá)有所降低（P＜0.05），見圖5A；且與gly-HDL處理組比較，TLR4中和抗體預(yù)處理組LC3顆?；潭葴p弱（P＜0.01），見圖5。

Figure 3. Effects of rapamycin and 3-MA on caspase-12 expression in HUVECs. The cells were treated as described in Figure 1，and then the protein levels of caspase-12 were evaluated by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs gly-HDL group.圖3 雷帕霉素和3-MA對(duì)HUVECs中caspase-12表達(dá)的影響

Figure 4. gly-HDL up-regulated TLR4 expression and activated autophagy in HUVECs. The HUVECs were treated with the indicated dose of gly-HDL and HDL（100 mg/L）for 24 h. A：the protein levels of TLR4 and beclin-1 were analyzed by Western blot；B：the protein level of LC3-II was analyzed by Western blot；C：immunofluorescence experiments showed LC3 la?beled by Alexa Fluor 488（green）and nuclei visualized by DAPI（blue）. Representative fluorescence images were photo?graphed by a laser scanning confocal microscope and autophagosomal puncta per cell were quantified. Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 gly-HDL上調(diào)HUVECs中TLR4表達(dá)并激活自噬

Figure 5. Anti-TLR4 antibody inhibited gly-HDL-induced autophagy in HUVECs. The cells were preincubated with 5 mg/L of TLR4 neutralizing antibody（TLR4 Ab）for 30 min and then treated with 100 mg/L gly-HDL for 24 h. Beclin-1 level（A）and LC3 puncta（B）were determined by Western blotting and immunofluorescence experiments，respectively. Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs gly-HDLgroup.圖5 TLR4中和抗體抑制gly-HDL誘導(dǎo)的HUVECs自噬

討 論

自噬是細(xì)胞將受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器運(yùn)輸至溶酶體進(jìn)行自我消化降解的過程，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制之一［9］。文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病患者血漿中自噬標(biāo)志物自噬相關(guān)基因7（autophagy-associated gene 7，ATG-7）和beclin-1 的水平明顯高于健康人［10］，且ATG-7敲除小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)目和胰島素分泌量減少［11-12］，繼而發(fā)生高血糖；LDLR-/-且巨噬細(xì)胞ATG-5缺陷小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，活性氧生成明顯增多，加速了AS 斑塊的進(jìn)展［13］，表明自噬功能失調(diào)與糖尿病及AS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ox-LDL 和AGE 均可觸發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)，而自噬水平的上調(diào)可減輕ox-LDL 和AGE 所誘導(dǎo)的LDH 漏出和內(nèi)皮素表達(dá)，提示自噬的發(fā)生可減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，gly-HDL處理后的HUVECs 自噬標(biāo)志分子beclin-1 和LC3-II上調(diào)且LC3 顆?；黠@，表明HDL 糖基化修飾后可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬；且gly-HDL 所誘導(dǎo)的HU?VECs 損傷和凋亡可被自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素減弱，而被自噬抑制劑3-MA 進(jìn)一步加重，提示自噬在一定程度上可以減輕gly-HDL 所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡導(dǎo)致血管內(nèi)膜完整性被破壞，有利于氧化、糖基化修飾脂蛋白進(jìn)入內(nèi)膜下，刺激炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血栓形成，加速粥樣斑塊進(jìn)程，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS 發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)。越來越多研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AS 的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［15］，尤其CHOP 和caspase-12 介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與AS 早期和晚期整個(gè)發(fā)展過程，并在易損斑塊的形成和破裂進(jìn)而導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生中具有重要作用［16］。本課題組前期研究表明，晚期糖基化白蛋白［17］、糖尿病患者的ox-LDL［18］都可通過激活caspase-12途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，gly-HDL 處理組caspase-12 活性和HUVECs 凋亡率均較對(duì)照組顯著增加，提示caspase-12 可介導(dǎo)gly-HDL 所誘導(dǎo)的HUVECs凋亡。

近年來研究表明，自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在交互作用，并參與AS 的發(fā)生發(fā)展［20］。自噬可在一定程度上減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和功能，減輕細(xì)胞損傷和凋亡［21］。在小鼠缺血/再灌注腎損傷模型中，腎小管上皮細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）及CHOP 和caspase-12 等表達(dá)明顯增多，自噬誘導(dǎo)劑可抑制以上蛋白的表達(dá)，并減少細(xì)胞凋亡，而自噬抑制劑氯喹或3-MA 則進(jìn)一步上調(diào)CHOP 和caspase-12 表達(dá)，加重了細(xì)胞凋亡［22］。本課題組既往研究證實(shí)，3-MA可促進(jìn)ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和CHOP 上調(diào)，而雷帕霉素則拮抗了ox-LDL 所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-MA 可加重gly-HDL 所誘導(dǎo)的HUVECs 損傷及凋亡，并進(jìn)一步增強(qiáng)caspase-12活性，而雷帕霉素則減輕了細(xì)胞損傷及凋亡，抑制了caspase-12 活化，提示自噬可以通過拮抗caspase-12 所介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑來減輕gly-HDL所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

TLR4 是調(diào)控炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)分子，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［23］。除了微生物、內(nèi)毒素等配體外，TLR4 還可識(shí)別輕度和重度氧化修飾的LDL 等致AS 因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)的蓄積［24-26］。TLR4缺乏可抑制泡沫細(xì)胞形成，減少ApoE-/-小鼠炎癥因子表達(dá)［27］。本課題組既往研究證實(shí)，TLR4 可介導(dǎo)輕度氧化修飾的LDL 所導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，進(jìn)而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并在ox-HDL 所誘導(dǎo)的CHOP 信號(hào)途徑活化進(jìn)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用［28］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，gly-HDL 處理HUVECs 24 h 后，TLR4表達(dá)顯著上調(diào)，而給予TLR4中和抗體預(yù)處理拮抗其生物活性，則可明顯抑制gly-HDL 所誘導(dǎo)的beclin-1上調(diào)和LC3 顆粒化，提示gly-HDL 可能是通過上調(diào)TLR4 來誘導(dǎo)HUVECs 自噬反應(yīng)的，而對(duì)于TLR4 在其中的具體分子機(jī)制正在深入研究中。

綜上所述，本體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TLR4 介導(dǎo)gly-HDL 所誘導(dǎo)的HUVECs 自噬反應(yīng)，而一定程度的自噬可減輕gly-HDL 所誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，其機(jī)制可能與抑制caspase-12 所介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑有關(guān)。