溫腎活血方對(duì)RCS 大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的影響

向圣錦，竇仁慧，姜小涵，李柏村，李佳

原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一種主要與基因缺陷相關(guān)的感光細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮變性，從而引起夜盲、進(jìn)行性視野縮小、視力下降、眼底特征性改變的遺傳性眼病。RP 在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為1/3000～1/5000，是目前尚無(wú)有效的預(yù)防和治愈的一種致盲性眼病[1-2]。中醫(yī)藥治療RP 有著悠久的歷史，一些藥物臨床與實(shí)驗(yàn)研究均被證實(shí)對(duì)本病有一定療效[3-4]?，F(xiàn)在中醫(yī)學(xué)逐漸總結(jié)和認(rèn)識(shí)到肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛、清陽(yáng)不升和血瘀脈澀是RP 的重要病機(jī)[5]。臨證中，課題組應(yīng)用溫腎活血方（熟地黃、枸杞子、菟絲子、熟附子、肉桂、紅參、當(dāng)歸等）為主加減治療腎陽(yáng)不足型RP，收效尚可。同時(shí)對(duì)歷代治療RP 的方劑配伍和臨床用藥規(guī)律總結(jié)發(fā)現(xiàn)，自近代醫(yī)家以來(lái)，應(yīng)用滋陰補(bǔ)腎兼活血化瘀或溫補(bǔ)腎陽(yáng)兼活血祛瘀法治療RP 的報(bào)道亦越來(lái)越多，在提高視力、改善視野方面具有可靠療效[6]。為進(jìn)一步明確溫腎活血方治療本病的療效機(jī)理，本研究以皇家外科學(xué)院(royal college surgeons,RCS)大鼠為研究對(duì)象，觀察中藥溫腎活血方對(duì)RCS 大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的影響，以探討豐富溫腎活血方治療RP的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

RCS(rdy-/-，p-/-)大鼠，SPF 級(jí)（購(gòu)自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)：201910067）；正常SD 大鼠，SPF 級(jí)（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)：201614068）。RCS 大鼠按4 雌2 雄進(jìn)行交配得到純合子胎鼠RCS 24 只（雌雄各半）；SD 大鼠8 只，雌雄各半，鼠齡2 周齡。所有大鼠均飼養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和無(wú)菌蒸餾水喂養(yǎng)，自由飲食，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫22～25℃；予以12 h/12 h 的晝夜節(jié)律，光照時(shí)間6:00～18:00，每3～4 d 更換一次墊料。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

溫腎活血方（熟地黃、枸杞子、菟絲子、熟附子、肉桂、紅參、當(dāng)歸等）。上述藥物按原方購(gòu)買(mǎi)三九制藥有限公司濃縮中藥配方顆粒，按體表?yè)Q算系數(shù)換算后配置成相應(yīng)濃度后，真空包裝，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。TUNEL 凋亡熒光染色試劑盒（普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司）；Caspase-3 抗體（艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司）、Bcl-2、Bax（美國(guó)Thermo Fisher 公司），Trizol RNA 提取試劑盒（美國(guó)Life Technologies Corporation），M-MLV Reverse Transcriptase cDNA 第一鏈合成試劑盒（美國(guó)Invitro-gen 公司）。Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher 公司）。CRM-440 切片機(jī)，日本SAKURA 公司；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司，Axio Observe Z1 全自動(dòng)倒置熒光光學(xué)顯微鏡。無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿等（北京化學(xué)試劑公司）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)股份有限公司）。

1.3 分組及給藥

16 只RCS 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為溫腎活血方組（以下簡(jiǎn)稱治療組）和模型組，每組8 只，雌雄各半；同時(shí)設(shè)8 只SD 大鼠為正常對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組）。自2 周齡開(kāi)始喂藥。

（1）治療組：予溫腎活血方中藥濃縮顆粒劑灌胃，灌胃濃度按中藥濃縮顆粒10.29 g/kg 體重計(jì)算，初始灌胃量為0.5 ml/次，每日2 次，1 周后（出生3 周）改為1.0 ml，每日1 次。

（2）模型組和對(duì)照組：給予0.9%生理鹽水灌胃，方法及頻次同中藥組。

3 組均于開(kāi)始治療后28 d 隨機(jī)選取6 只大鼠處死，進(jìn)行相應(yīng)操作和各個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定。

1.4 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)

水合氯醛麻醉過(guò)量處死各組大鼠，快速取出右眼眼球置于4%多聚甲醛中固定48 h，然后組織脫水、石蠟包埋，每組隨機(jī)選擇3 只眼球沿冠狀面行4μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色（HE 染色）后于100 倍光學(xué)顯微鏡下觀察視盤(pán)兩側(cè)各150 μm 視網(wǎng)膜各層形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化并拍照。

1.5 TUNEL 法檢測(cè)感光細(xì)胞凋亡

取材時(shí)間和方法同上，制作視網(wǎng)膜石蠟包埋切片。按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。切片DAPI 復(fù)染后熒光顯微鏡下觀察，自視盤(pán)向鋸齒緣方向連續(xù)取3 個(gè)視野，500 μm/視野，記錄每個(gè)視野中染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及感光細(xì)胞總數(shù)，抽樣6 張不同切片，計(jì)算平均感光細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞計(jì)數(shù)采用3YPixel-PRO 分析軟件，感光細(xì)胞凋亡率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/感光細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 免疫組化測(cè)定大鼠視網(wǎng)膜凋亡蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2 表達(dá)

常規(guī)脫蠟、復(fù)水組織切片；根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求,對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理；3%H2O2去離子水孵育10 min，用來(lái)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS 沖洗2 min×3 次；滴加Caspase-3、Bax、Bcl-2 單克隆抗體，室溫或37℃孵育1～2h 或4℃過(guò)夜，PBS 沖洗2 min×3 次；滴加試劑Polymer Helper，室溫或37℃孵育20 min，PBS 沖洗2 min×3 次；滴加試劑聚氧化酶兔抗大鼠IgG,室溫或37℃孵育20 min，PBS 沖洗2 min×3 次；應(yīng)用DAB 溶液顯色；自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片；光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。用Image Plus Pro 6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)相關(guān)凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行定量分析。每只大鼠取3 張不連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選取6 處視野，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的平均密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來(lái)表示。3 組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法，組內(nèi)兩兩比較應(yīng)用LSD-t 檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化

治療后28 d，對(duì)照組SD 大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整，外核層感光細(xì)胞排列緊密整齊，其外側(cè)依次可見(jiàn)感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)與外節(jié)。模型組RCS 大鼠視網(wǎng)膜外核層均較正常組明顯變薄，細(xì)胞排列疏松，欠整齊；外層感光細(xì)胞數(shù)明顯減少，其余結(jié)構(gòu)基本正常。治療組大鼠視網(wǎng)膜外核層亦較正常組變薄，感光細(xì)胞數(shù)量明顯減少；但與模型組比較視網(wǎng)膜更厚，感光細(xì)胞層數(shù)較后者為多，細(xì)胞排列也較為整齊（圖1）。

2.2 各組大鼠TUNEL 法檢測(cè)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡情況

圖1 治療前后各組大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)改變（HE 染色×400）。1A 對(duì)照組治療前；1B 模型組治療前；1C 治療組治療前；1D 對(duì)照組治療后；1E模型組治療后；1F 治療組治療后

治療后28 d，對(duì)照組大鼠在視網(wǎng)膜外核層偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，但模型組和治療組大鼠視網(wǎng)膜外核層陽(yáng)性染色細(xì)胞較正常組均明顯增多，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，但治療組外核層陽(yáng)性染色細(xì)胞較模型組少（圖2）。對(duì)照組、模型組、治療組感光細(xì)胞凋亡率分別為（12.15±3.83）%、（50.78±6.36）%、（33.53±6.26）%。3組之間經(jīng)單因素方差分析，外核層細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=71.58，P=0.000）。與模型組比較，治療組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少（t=4.74，P=0.001）

2.3 各組RCS大鼠視 網(wǎng)膜Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)

在治療后28d，對(duì)照組SD大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)形態(tài)規(guī)則，排列整齊，在視網(wǎng)膜外層可見(jiàn)少量Caspase-3、Bax 蛋白分散表達(dá)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平較高。模型組和治療組RCS大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂萎縮變薄，病灶集中在外層視網(wǎng)膜，Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)在視網(wǎng)膜內(nèi)外層均可見(jiàn)，但Caspase-3表達(dá)水平較對(duì)照組高，Bax 表達(dá)則同樣較低；而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平則在視網(wǎng)膜各層均較對(duì)照組低（圖3）。3組間比較，Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)水平（F=59.37，P=0.000）；Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)水平（F=31.35，P=0.000），均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax 陽(yáng)性表達(dá)水平（F=1.69，P=0.190），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，治療組Caspase-3表達(dá)顯著減少（t=2.36，P=0.040），Bcl-2 表達(dá)顯著增多（t=3.15，P=0.010），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 治療后28d 各組視網(wǎng)膜Caspase-3、Bax 及Bcl-2 表達(dá)比較(×400)。3A-3C分別代表對(duì)照組、模型組、治療組Caspase-3蛋白表達(dá)情況；3D-3F 分別代表對(duì)照組、模型組、治療組Bax 蛋白表達(dá)情況；3G-3I分別代表對(duì)照組、模型組、治療組Bcl-2 蛋白表達(dá)情況。Caspase-3、Bax、Bcl-2均呈綠色染色，陽(yáng)性表達(dá)（白箭頭）

3 討論

RP 屬于中醫(yī)學(xué)“高風(fēng)內(nèi)障”“高風(fēng)雀目”“陰風(fēng)障”范疇。歷代醫(yī)家多認(rèn)識(shí)到元陽(yáng)（腎陽(yáng)）不足在本病發(fā)病中具有重要作用。《目經(jīng)大成》[7]認(rèn)為該病的病機(jī)為元陽(yáng)不足，陽(yáng)不勝陰所致，曰：“至晚不見(jiàn)，曉則復(fù)明，蓋元陽(yáng)不足致病”“人而陽(yáng)不勝陰，則氣必下陷，陽(yáng)氣下陷，則陰氣升騰，縱有火光月色，終不能睹”?！秾徱暚幒穂8]認(rèn)為該病“蓋元陽(yáng)不足致病，或曰既陽(yáng)不足”。因此，先天稟賦不足，元陽(yáng)不足，命門(mén)火衰；陽(yáng)虛日久，必?fù)p及陰，陰陽(yáng)俱衰，陰陽(yáng)不濟(jì)，陽(yáng)氣不能為用。同時(shí)，陽(yáng)虛無(wú)以鼓動(dòng)血行，目中脈絡(luò)瘀阻，氣滯血瘀。李傳課教授團(tuán)隊(duì)研究證實(shí)RP 證候具有虛中夾瘀的特點(diǎn)[9]?！堆劭平痃R》[10]認(rèn)為該病是由于“陽(yáng)光不足，腎陰虛損，乃陽(yáng)微陰盛”所致。因此，先天稟賦不足，命門(mén)火衰，陽(yáng)虛日久，陽(yáng)損及陰，陰陽(yáng)不濟(jì)。同時(shí)，陽(yáng)虛無(wú)以鼓動(dòng)血行，目中脈絡(luò)瘀阻，氣血瘀滯是本病的重要病機(jī)[5,11]，治療當(dāng)溫腎助陽(yáng)、補(bǔ)腎填精，兼以益氣活血。溫腎活血方選用杜仲、菟絲子并配以大熱之熟附子、肉桂溫補(bǔ)腎陽(yáng)，枸杞子、熟地黃滋補(bǔ)腎陰、益精明目，陰陽(yáng)雙補(bǔ)，并可陰中求陽(yáng)，共補(bǔ)腎中真精元陽(yáng)，具體較好的補(bǔ)腎明目功效。由于眼居高位，配以紅參大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)后天以資先天，并助腎中陽(yáng)氣蒸騰，直達(dá)病所；當(dāng)歸、川芎活血化瘀通絡(luò)。諸藥合之，共奏溫補(bǔ)腎陽(yáng)、活血明目之功，切中元陽(yáng)不足、脈絡(luò)瘀阻之病機(jī)。

RCS 大鼠是一種較成熟的視網(wǎng)膜退化性病變動(dòng)物，因視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬光感受器細(xì)胞外節(jié)盤(pán)膜能力缺陷，導(dǎo)致大量的盤(pán)膜碎片堆積，最終導(dǎo)致光感受器細(xì)胞進(jìn)行性變性和凋亡，是一種常染色體隱性遺傳病，具有人類RP 的主要特征，是廣泛用于RP 病因及治療方法研究的經(jīng)典模型鼠[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在出生14 d 時(shí)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常，之后睜眼并接受光線刺激后開(kāi)始視網(wǎng)膜變性，在出生后28 d 可見(jiàn)視網(wǎng)膜明顯變薄，感光細(xì)胞層數(shù)減少，外節(jié)不規(guī)則甚至消失，到42 d 時(shí)視網(wǎng)膜變性進(jìn)一步加重，56 d 時(shí)則視網(wǎng)膜外層光感細(xì)胞完全消失[13]。因此，選擇出生后42 d進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，即在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重階段，評(píng)估溫腎活血方對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用。

目前RP 的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但是大量研究已證實(shí)細(xì)胞凋亡是該病發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制，因此，通過(guò)有效的方法延緩或者抑制感光細(xì)胞的凋亡是治療RP 的關(guān)鍵所在，對(duì)保護(hù)患者的視功能具有重要意義。本研究HE 染色結(jié)果顯示，溫腎活血方治療后，RCS 大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列相對(duì)規(guī)整，視網(wǎng)膜外層感光細(xì)胞層數(shù)以及細(xì)胞核密度較模型組有不同程度改善，說(shuō)明溫腎活血方能使RCS大鼠視網(wǎng)膜保留更多的感光細(xì)胞。同時(shí)，TUNEL 感光細(xì)胞凋亡染色進(jìn)一步證實(shí)，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)程度與外核層變薄的程度具有一致性，溫腎活血方能顯著較少感光細(xì)胞凋亡，且高劑量組較低劑量組可以更顯著降低感光細(xì)胞凋亡率，提示溫腎活血方可以減少RCS 大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜損傷具有一定保護(hù)作用。既往也研究發(fā)現(xiàn)，溫陽(yáng)益氣活血方可以有效抑制RDS 小鼠感光細(xì)胞的凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜外層損傷[4]。結(jié)合本研究結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明溫補(bǔ)腎陽(yáng)、活血通絡(luò)為主的治法可以較好地抑制元陽(yáng)虧虛、脈絡(luò)瘀阻所致RP 患者的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)和延緩視功能下降的目的。

Caspase-3 是外源性凋亡通路和內(nèi)源性凋亡通路激活的Caspase 級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)因子，能夠直接促發(fā)細(xì)胞凋亡，是最重要的凋亡執(zhí)行者，一旦Caspase-3被激活并進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路，感光細(xì)胞凋亡就會(huì)啟動(dòng)[14]。Bcl-2 因子是重要的凋亡抑制因子，現(xiàn)已證實(shí)Bcl-2 可以阻斷感光細(xì)胞的凋亡從而促進(jìn)其存活[15]。為了進(jìn)一步明確溫腎活血方抑制或延緩感光細(xì)胞凋亡的機(jī)制，通過(guò)免疫組化測(cè)定了溫腎活血方對(duì)RCS 大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)的溫腎活血方可以不同程度影響RCS 大鼠視網(wǎng)膜中凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2 的表達(dá)，主要表現(xiàn)為抑制Caspase-3 的表達(dá)，并促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)。由于細(xì)胞凋亡過(guò)程主要發(fā)生在視網(wǎng)膜外層，故凋亡蛋白的表達(dá)主要是由感光細(xì)胞誘導(dǎo)的。因此，溫腎活血方可能主要通過(guò)抑制視網(wǎng)膜Caspase-3 的表達(dá)，并促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)從而減少視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，達(dá)到恢復(fù)和保護(hù)視功能的目的，但溫腎活血方誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡的下游分子機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了溫腎活血方可以抑制RCS 大鼠感光細(xì)胞變性和凋亡的進(jìn)程，對(duì)視網(wǎng)膜變性具有一定的保護(hù)作用，其作用可能與抑制Caspase-3 并促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)有關(guān)，但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。