葛根退赤湯對堿燒傷誘導SD大鼠角膜新生血管的抑制作用

莊家圓 王 方 鄧 杰 洪作權(quán)

1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州貴陽 550001；2.貴州省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院眼科，貴州貴陽 550001

角膜新生血管是指在一些特定的條件下，從角膜緣血管網(wǎng)形成的新生毛細血管逐漸侵入角膜而形成的一種病理改變，是一種常見的眼部病變[1]。臨床上眼部感染性、炎癥性及外傷性疾病均可導致角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的形成，如單純皰疹病毒性角膜炎、翼狀胬肉、眼部外傷等[2-3]。新生的毛細血管不僅會導致視力下降，也是角膜移植術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的高危因素。目前，CNV的確切發(fā)生機制仍不清楚，但有研究證實，血中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與CNV形成的各個步驟，是功能最強的促血管生成因子之一[4]，其家族成員VEGF-A可促進新生血管形成和使血管通透性增加[5]?，F(xiàn)階段，角膜新生血管類疾病無特效的治療手段，部分抗CNV藥物仍處于實驗研究階段，且價格昂貴。葛根退赤湯是王方教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)，結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論匯聚而成，在臨床實踐中療效顯著。本研究采用堿燒傷法誘導斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，SD）大鼠CNV模型，觀察葛根退赤湯對CNV生長的影響，并對外周血中VEGF-A的表達進行檢測，進一步揭示其可能作用機制，以求為中醫(yī)藥治療角膜新生血管類疾病提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40只健康成年的SD大鼠，購自湖南省長沙天勤生物技術(shù)有限公司，SPF級8～10周齡，重150～220 g，雌雄各半。裂隙燈顯微鏡下檢查排除眼前節(jié)病變。

1.1.2 主要試劑及儀器 裂隙燈顯微鏡（ZEISS Inc，Germany，SL-120），臺式高速離心機（德國Epp endorf，5417R），微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐，ST70-2），全 自 動 酶 標 儀（BLOBASE公 司，EL10-A），ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.1.3 藥物及配制 自擬葛根退赤湯，由葛根30 g、赤芍 10 g、防風 10 g、羌活 10 g、黃連 6 g、法半夏 9 g、密蒙花 12 g、黃芩 10 g、柴胡 10 g、茯苓 12 g、石斛 15 g、皂角刺15 g、苦杏仁12 g、炙甘草6 g組成，此實驗用藥采用中藥新綠色智能顆粒，配方顆粒溶解于超純水中。

1.2 方法

1.2.1 堿燒傷法誘導SD大鼠CNV模型 正常對照組不做任何處理；其余各組采用100 g/L水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉。將直徑3 mm圓形單層濾紙片浸泡在1 mol/L NaOH溶液中，貼敷于大鼠角膜中央40 s，立即用無菌生理鹽水充分沖洗結(jié)膜囊1 min，回籠后正常環(huán)境飼養(yǎng)。以角膜基質(zhì)層水腫、混濁明顯、虹膜隱約可見為造模成功。

1.2.2 分組及治療 稱取體重后，隨機分為四組：正常對照組、堿燒傷組、治療低、高劑量組。除對照組外，于造模后第4天分別給予生理鹽水、葛根退赤湯0.69 g/kg及葛根退赤湯1.38 g/kg灌胃，1 d/次，灌胃體積均為10 ml/kg，共14 d。葛根退赤湯，采用中藥新綠色智能顆粒劑，成人用量為每天13.2 g，參照熊遠珍[6]實驗動物與人用藥量中成人與動物給藥等效劑量換算，得出大鼠與成人等效給藥劑量為1.38 g/kg。

1.2.3 角膜炎癥反應(yīng)評分 于第4、8、13天在裂隙燈顯微鏡觀察，采用Ueno等[7]的評分體系，主要包括結(jié)膜充血情況、角膜水腫情況及有無眼內(nèi)滲出或出血。結(jié)膜：無充血記0分；角膜緣血管網(wǎng)輕度充血記1分；中度充血記2分；重度充血伴有血管怒張記3分。角膜：無水腫記0分；角膜輕度水腫記1分；角膜中度水腫記2分；角膜重度水腫記3分。眼內(nèi)滲出或出血：眼內(nèi)有滲出或出血記1分；無記0分。統(tǒng)計每組角膜炎癥反應(yīng)評分平均值進行比較。

1.2.4 CNV生長情況 第 4、8、13天用裂隙燈顯微鏡觀察SD大鼠CNV生長情況，并用數(shù)碼相機拍照記錄。游標卡尺測量自角膜緣生長出的CNV長度。每次測量時以連續(xù)彎曲度最小，朝向角膜中央生長的最長血管的垂直長度為準，使用公式S=C/12×3.14×[r2-（r-l）2][8]計算 CNV 面積。其中S為角膜新生血管面積，C為CNV累計角膜的圓周鐘點數(shù)，r為角膜半徑（SD大鼠角膜平均半徑為3 mm），l為CNV從角膜緣長入角膜的長度（mm）。

1.2.5 角膜組織病理學檢查 將取下角膜置于4%中性緩沖甲醛固定液中浸泡固定，不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯浸泡透明，石蠟包埋。HE染色：入Harris蘇木素液15 min，75%鹽酸酒精分化10 s，1%氨水終止分化。入1%伊紅己醇液2 min。脫水、透明和封片。Olympus光學顯微鏡圖文分析系統(tǒng)拍照。

1.2.6 ELISA檢測VEGF-A 采用股動脈取血法采集大鼠血液，收集于離心管中。所采樣本分批4℃恒溫離心，3000 r 15 min。取上層血清，立即置于-20 ℃冰箱中低溫保存。血清中VEGF-A含量按照ELISA試劑盒檢測方法進行。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有結(jié)果均用（）表示?？傮w均數(shù)間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠各時間點角膜堿燒傷炎癥指數(shù)比較

等同時期內(nèi)，各組大鼠角膜炎癥反應(yīng)情況的比較：第4、8天，隨治療時間延長，炎癥逐漸消退，治療低、高劑量組與堿燒傷組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同時期內(nèi)，治療低、高劑量組，隨治療時間延長，炎癥消退。第8天與第4天比較，第13天分別與第4天、第8天比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 四組大鼠各時間點角膜堿燒傷炎癥指數(shù)比較（±s）

表1 四組大鼠各時間點角膜堿燒傷炎癥指數(shù)比較（±s）

注：與堿燒傷組同時間點比較，*P＜0.05;與治療低劑量組同時間點比較，#P＜0.05；“-”為未做

組別 n 第4天 第8天 第13天 F值 P值對照組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 - -堿燒傷組 10 5.70±0.28 4.60±0.33# 3.20±0.28# 197.917 0.000治療低劑量組 10 5.40±0.28 3.50±0.28* 2.49±0.18* 337.003 0.000治療高劑量組 10 5.10±0.28* 3.20±0.28* 2.10±0.28*# 287.917 0.000 F值 11.250 78.750 48.015 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 四組大鼠各時間點CNV面積比較

除對照組外，各組大鼠CNV均于造模后第3～4天由角膜緣開始，逐漸向角膜中心發(fā)展，隨時間延長呈進行性生長。與堿燒傷組比較，治療低、高劑量組大鼠CNV生長面積較小，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與高劑量組比較，低劑量組大鼠CNV面積相對較大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠CNV

表2 各組大鼠各時間點CNV面積比較（±s，mm2）

表2 各組大鼠各時間點CNV面積比較（±s，mm2）

注：與堿燒傷組同時間點比較，*P＜0.05;與治療低劑量組比較，#P＜0.05；“-”為未做

組別 n 第4天 第8天 第13天 F值 P值對照組 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 - -堿燒傷組 10 12.21±0.79# 20.97±0.82# 23.03±1.34# 316.886 0.000治療低劑量組 10 11.01±0.49* 14.89±0.98* 18.91±1.53* 130.901 0.000治療高劑量組 10 9.45±0.47*# 13.62±0.99*# 15.50±1.37*# 92.592 0.000 F值 51.625 176.404 70.382 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 角膜組織病理學改變

角膜組織切片示：對照組角膜透明。堿燒傷組的角膜上皮細胞層及前彈力層均有大量淋巴細胞浸潤，基質(zhì)層排列疏松，可見大量CNV生成。低劑量組CNV數(shù)量較堿燒傷組減少，高劑量組大鼠角膜的各層結(jié)構(gòu)完整存在，炎癥細胞浸潤數(shù)量明顯減少。見圖2。

圖2 各組大鼠角膜HE染色像（×400）

2.4 ELISA檢測SD大鼠外周血中VEGF-A表達情況

治療14 d后，檢測發(fā)現(xiàn)各組的VEGF-A表達值分別為對照組為（3.35±0.11），堿燒傷組為（5.82±0.23），治療低劑量組為（4.75±0.32），治療高劑量組為（3.85±0.18）。與堿燒傷組比較，治療低劑量組和治療高劑量組的VEGF-A表達均有明顯降低（F=224.794，P＜0.01），且治療高劑量組較低劑量組下降更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

角膜新生血管是病理性的血管組織，其對修復組織損傷有一定的積極作用，但其管腔結(jié)構(gòu)脆弱、功能不全，容易引發(fā)再次出血，造成二次角膜水腫及繼發(fā)的角膜瘢痕化[9-10]，嚴重影響視力，是目前致盲的主要原因。CNV形成是多因素參與的復雜過程，目前研究較多且公認的機制是促血管生成因子和抑制血管生成因子失衡理論[11]。VEGF在血管發(fā)生（從內(nèi)皮細胞形成新的血管）和血管新生（從已有的血管再形成新的毛細血管）過程中均發(fā)揮重要作用，其家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盤生長因子[12-14]。VEGF-A在血管新生中扮演重要角色。對視網(wǎng)膜新生血管形成的研究證實，當血管周圍基質(zhì)微環(huán)境中游離VEGF-A濃度升高并且超過一定閾值時，將誘導一部分內(nèi)皮細胞的極性發(fā)生改變[15]。

王方教授根據(jù)自己多年來對葛根的研究及臨床應(yīng)用心得，筑方葛根退赤湯。以“清熱抑木”為法，以求清熱退赤、活血明目之效。《證治準繩·雜病·七竅門》曰：“神水者，由三焦而發(fā)源，先天真一之氣所化，在目之內(nèi)……”，故方中重用葛根、赤芍為君，以赤芍清熱退赤，葛根生津復神水，以恢復角膜原有的營養(yǎng)供應(yīng)。另外，現(xiàn)代研究證實，單藥葛根中提取的葛根素具有促進側(cè)支循環(huán)、抑制缺血再灌注損傷的作用[16]。本研究觀察了葛根退赤湯灌胃內(nèi)服對堿燒傷誘導SD大鼠CNV影響，結(jié)果表明治療低、高劑量組的角膜炎癥評分和CNV面積比堿燒傷組明顯降低，表明其對CNV有一定的抑制效應(yīng)。進一步實驗證實，在炎癥性CNV中，VEGF-A的表達升高，經(jīng)治療后VEGF-A顯著降低，提示VEGF-A的轉(zhuǎn)錄和表達，可能是CNV形成的關(guān)鍵因素，葛根退赤湯通過抑制VEGF-A的表達，從而抑制CNV生成。

實驗提示葛根退赤湯在抑制角膜新生血管生成中有潛在的應(yīng)用價值，且中醫(yī)藥治療眼部疾病安全可靠、簡便廉效，為中醫(yī)藥治療角膜新生血管提供了一種新的方向。但關(guān)于其具體作用機制，仍有待進一步的研究。