苯丙胺類、氯胺酮、卡西酮類毒品手性分離的研究進展

湯文川, 常 靖, 王元鳳*, 王愛華, 王瑞花

(1. 公安部物證鑒定中心, 北京 100038; 2. 中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)研究院, 北京 100088)

兩個互為鏡像而不能重合的立體異構(gòu)體,稱為對映異構(gòu)體。對映異構(gòu)體的分子中有一個連有4個不同原子或基團的碳原子,叫手性碳原子。對映異構(gòu)體在自然界中普遍存在,并且在生命活動中起到極為重要的作用,例如一些氨基酸和糖類對人體有營養(yǎng)作用,但其對映異構(gòu)體沒有營養(yǎng)價值,甚至對人體會產(chǎn)生副作用。在藥物化學(xué)領(lǐng)域,對映異構(gòu)體的存在也是極為常見的,它們具有極為相似的理化性質(zhì),但是在人體中的作用部位、毒性、代謝過程等方面都存在較為明顯的差異。部分毒品也是如此,例如,對于甲基苯丙胺而言,S-甲基苯丙胺是常見的毒品,主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),而其對映異構(gòu)體R-甲基苯丙胺則主要作用于心血管系統(tǒng),多用于臨床醫(yī)療[1]。因此,正確識別、恰當(dāng)分離有旋光性的毒品及其對映異構(gòu)體,不僅有利于司法領(lǐng)域認定對毒品犯罪的準確定罪、量刑,而且對醫(yī)藥、科研領(lǐng)域也有所裨益。

針對我國司法實踐,本文重點對苯丙胺類、氯胺酮、卡西酮類3類常見毒品的手性色譜分離方法的共性以及手性分離在法醫(yī)毒物學(xué)中的應(yīng)用等研究進展進行綜述,以期對毒品犯罪的司法鑒定工作、相關(guān)醫(yī)藥研究提供參考。

1 3類毒品對映異構(gòu)體的特點

1.1 苯丙胺類

苯丙胺類興奮劑主要以興奮和致幻作用為主,其可以選擇性地作用于腦干以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng),通過使中樞和外周單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平升高,增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動,間接產(chǎn)生藥理和毒理學(xué)作用[2]。苯丙胺類興奮劑為苯丙胺(AM)的衍生物,結(jié)構(gòu)通式見圖1a。除了AM外,苯丙胺類興奮劑還包括甲基苯丙胺(冰毒,MAMP)、3,4-亞甲二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亞甲二氧基乙基苯丙胺(MDEA)、3-甲氧基-4,5-亞甲二氧基甲基苯丙胺(MMDMA)、二甲氧基乙基安非他明(DOET)等?！?018年中國毒品形勢報告》表明,“在240.4萬名現(xiàn)有吸毒人員中,濫用冰毒人員135萬名,占56.1%,冰毒已取代海洛因成為我國濫用人數(shù)最多的毒品”[3]。

圖 1 (a)苯丙胺類興奮劑、(b)氯胺酮和(c)卡西酮類毒品的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of (a) amphetamine-type stimulants, (b) ketamine, (c) cathinones* the chiral carbon atom.

麻黃素、偽麻黃素是合成苯丙胺類毒品的重要原料,這兩種分子均具有手性碳原子。在合成過程中,麻黃素、偽麻黃素的手性碳原子不參與反應(yīng),因而利用這兩種原料合成的苯丙胺類毒品是對映異構(gòu)體[4]。苯丙胺類的對映異構(gòu)體在藥效性、毒性、代謝等方面有較大差異。以MAMP為例,R-MAMP多用于醫(yī)療過程,被用作鼻腔減充血藥物的活性成分,而S-MAMP因其成癮性和濫用趨勢被界定為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的強效興奮劑[5];相比R-MAMP,等劑量的S-MAMP對人體心血管的作用更強[6];當(dāng)攝入外消旋體MAMP 16 h后,可以檢測出S-MAMP在體內(nèi)代謝程度更低[7],由此可見,S-MAMP更容易對人體產(chǎn)生長時間作用。

1.2 氯胺酮

氯胺酮是一種被列管的精神藥品。它具有一定的致幻作用和成癮性,在人體內(nèi)的作用機制較復(fù)雜,能選擇性地阻斷痛覺沖動向丘腦新皮層系統(tǒng)的傳導(dǎo),興奮腦干及邊緣系統(tǒng),引起意識模糊、短暫性記憶缺失,產(chǎn)生夢幻、肌張力增加、血壓上升等癥狀[8]。氯胺酮在我國濫用的情況較為嚴重。根據(jù)《2018年中國毒品形勢報告》,我國濫用氯胺酮的人數(shù)僅次于冰毒和海洛因。氯胺酮的化學(xué)名稱是2-氯苯-2-甲基胺環(huán)己酮,分子中有一個手性碳原子,結(jié)構(gòu)式見圖1b。氯胺酮早在1970年就被作為麻醉劑用于臨床,臨床使用的一般為等量R-氯胺酮和S-氯胺酮的外消旋體混合物。兩種氯胺酮對映異構(gòu)體的麻醉效果有所差異,S-氯胺酮的麻醉效果是R-氯胺酮和外消旋體氯胺酮的2～5倍[9],相比外消旋體和R-氯胺酮,使用S-氯胺酮作為麻醉劑時,產(chǎn)生的副作用更小[10]。依據(jù)以上特點和持續(xù)的臨床研究,近年來一些國家已將S-氯胺酮作為臨床用外消旋體氯胺酮的替代品。此外,近年來氯胺酮的抗抑郁作用引發(fā)了科學(xué)家們的關(guān)注,R-氯胺酮相比S-氯胺酮在抗抑郁藥物領(lǐng)域更有潛力[11]。

1.3 卡西酮類

卡西酮類毒品具有很強的興奮作用。近些年來,卡西酮類毒品在毒品市場中越來越泛濫,尤其是娛樂場所。國內(nèi)外因濫用卡西酮類毒品引發(fā)的中毒、致死案例越來越多[12]?？ㄎ魍强ㄎ魍惗酒分凶顬橹饕囊环N,它也被稱為苯甲酰乙胺或β-酮苯丙胺,是一種單胺類生物堿,存在于阿拉伯茶中,其化學(xué)性質(zhì)與麻黃堿和其他苯丙胺類物質(zhì)類似?？ㄎ魍慕Y(jié)構(gòu)與AM相似,包含一個手性碳原子,但又不同于AM,它有一個酮官能團?？ㄎ魍惗酒肥且钥ㄎ魍姆肿咏Y(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)而衍生出來的一類毒品,結(jié)構(gòu)通式見圖1c。其他常見的卡西酮類毒品有甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮(4-MMC)、3,4-亞甲基二氧吡咯戊酮(MDPV)、4-氟甲卡西酮(4-FMC)、3-氟甲卡西酮(3-FMC)、3,4-二甲基甲卡西酮(3,4-DMMC)等?？ㄎ魍惗酒吩谒幚碜饔蒙吓c苯丙胺類毒品相似,二者在構(gòu)型上的特點也相似,即S構(gòu)型比R構(gòu)型對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用強[13]。甲卡西酮是卡西酮類毒品中常見的一種,是卡西酮的N-甲基衍生物,比卡西酮的藥效強數(shù)倍。Glennon等[14]通過小鼠實驗證實,S-甲卡西酮和R-甲卡西酮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有刺激作用;S-甲卡西酮藥效是R-甲卡西酮藥效的3～5倍,是S-苯丙胺藥效的2倍。

圖 2 “三點手性識別模式”示意圖Fig. 2 Diagram of “three-point chiral recognition model”a. chiral agent; b. one enantiomer; c. the other enantiomer.

2 3類毒品對映異構(gòu)體的手性分離

2.1 色譜法分離對映異構(gòu)體的原理

對映異構(gòu)體的手性分離方法主要分為色譜法和非色譜法兩大類。由于非色譜法不能獲得較純的對映異構(gòu)體,并且操作煩瑣,耗時較長,現(xiàn)已被色譜法逐漸取代。色譜法分離對映異構(gòu)體的原理主要基于Dalgliesh提出的“三點手性識別模式”[15], Pirkle等[16]發(fā)展了“三點手性識別模式”,并較為詳盡地闡釋了對映異構(gòu)體的拆分原理,在對映異構(gòu)體和手性作用物之間存在至少3個相互作用點,其中至少一個作用點應(yīng)為立體化學(xué)作用,另外兩個作用點可以是不同類型的作用力,例如氫鍵、偶極相互作用、電荷轉(zhuǎn)移、配位化合物、位阻排斥、疏水吸引等分子間作用。兩個對映異構(gòu)體與手性作用物之間形成非對映體絡(luò)合物的穩(wěn)定性有差異而得到分離。如圖2所示,手性作用物a與一種待分離的對映異構(gòu)體b形成了3組相互作用點,即A與A′、B與B′和C與C′ 3個作用力。然而,手性作用物a與另一種待分離的對映異構(gòu)體c之間不存在C與C′作用力,因此a與b、a與c形成的非對映分子絡(luò)合物的性質(zhì)不同,可以通過色譜進行分離。

然而,隨著色譜法中手性固定相的不斷發(fā)展,一些較復(fù)雜的手性固定相與待分離的對映異構(gòu)體之間的手性識別機理不能完全用“三點手性識別模式”解釋。隨著研究和認識的不斷深入以及科技的快速發(fā)展,近年來關(guān)于手性識別機理的研究方法主要有熱力學(xué)分析法[17-20],通過計算機建立分子模型模擬手性識別方法[21-24],核磁共振、熒光分析等光譜學(xué)法[25,26]等。

2.2 常見的色譜分析方法

常見的手性藥物分離和檢測方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)、超臨界流體色譜法(SFC)等分離技術(shù),以及上述分離技術(shù)和質(zhì)譜(MS)、紫外光譜(UV)等檢測技術(shù)的聯(lián)用。苯丙胺類、卡西酮類對映異構(gòu)體的色譜分離方法集中使用GC、HPLC和CE,氯胺酮對映異構(gòu)體的色譜分離則大部分使用HPLC和CE。

2.2.1GC

GC是色譜法中發(fā)展較早的一項檢測技術(shù),也是較早應(yīng)用于對映異構(gòu)體分離的檢測技術(shù),其特點是對映異構(gòu)體的分離度、重現(xiàn)性和精度都很高。在具有揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的手性分子分離方面,GC展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。

早期苯丙胺類、甲卡西酮類毒品對映異構(gòu)體使用GC分離的較多,其特點是進樣分析前需使用手性衍生化試劑,這兩類毒品常用的手性衍生化試劑主要有N-三氟乙酰-L-脯胺酰氯(L-TPC)和(+)R-α-甲氧基α-三氟甲基苯乙酸(MTPA)。最初在苯丙胺類、甲卡西酮類毒品的手性分離中,使用L-TPC作為手性衍生化試劑的情況較為普遍,因為酰氯的反應(yīng)性最強,與仲胺、仲羥基也能發(fā)生反應(yīng),但由于L-TPC商品化純度的影響,以及在存放過程中其會發(fā)生消旋化,生成一定比例的另一構(gòu)型對映異構(gòu)體,該雜質(zhì)會影響衍生化產(chǎn)物的純度,使得檢測結(jié)果產(chǎn)生8%～19%的偏差[27]。而MTPA的衍生化效果比L-TPC更好,孟品佳[28]對比了L-TPC和MTPA對苯丙胺類毒品對映異構(gòu)體的分離情況,使用MTPA進行衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性明顯好于L-TPC衍生化產(chǎn)物,并且可以對苯丙胺類毒品的對映異構(gòu)體進行定量分析[29]?？ㄎ魍惗酒穼τ钞悩?gòu)體也能夠使用L-TPC進行手性衍生化,但L-TPC的外消旋化會對部分卡西酮類毒品的手性分離產(chǎn)生影響,Mohr等[30]的研究表明,使用L-TPC進行衍生化會使S-甲卡西酮轉(zhuǎn)化成R-甲卡西酮。與使用L-TPC進行手性衍生化相比,卡西酮類毒品經(jīng)MTPA衍生化后的產(chǎn)物有更好的分離度,能夠在質(zhì)譜中獲得較優(yōu)的離子對[31]。

GC技術(shù)是開發(fā)得較早的一種分離對映異構(gòu)體的色譜技術(shù),但其存在一些固有的局限性,例如:進樣前需進行手性衍生化，使得操作較復(fù)雜;操作溫度相對比較高，使衍生化后的非對映異構(gòu)體之間的相互作用能差別變小,對映異構(gòu)體分離困難[32];柱溫高導(dǎo)致對映異構(gòu)體的選擇性降低等。由于GC技術(shù)進行手性分離時必須使用手性衍生化試劑,手性衍生化試劑的穩(wěn)定性非常重要,如果其中一種對映異構(gòu)體會對手性衍生化試劑產(chǎn)生消旋化的影響,這將導(dǎo)致兩種對映異構(gòu)體衍生化生成的非對映異構(gòu)體出現(xiàn)混淆,從而影響對映異構(gòu)體的正確分離檢測,比如氯胺酮不宜使用常見的脯氨酰類手性衍生化試劑進行衍生就是這個原因[33]。這些局限性導(dǎo)致一部分對映異構(gòu)體不宜通過GC技術(shù)實現(xiàn)分離,目前使用該技術(shù)進行手性分離的研究逐漸減少。

2.2.2HPLC

HPLC是在GC的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項色譜技術(shù),是手性分離領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的色譜方法。相對于GC的局限性,HPLC能夠有效避免因溫度過高對手性分離產(chǎn)生的影響。HPLC可以分為間接法和直接法,其中,間接法是指手性衍生化試劑法,即目標物經(jīng)衍生化處理后再使用HPLC分離;直接法是指直接選用手性固定相或者在流動相中加入手性添加劑。近年來,直接法在手性分離中應(yīng)用較多,適用于多種對映異構(gòu)體的混合分離,該方法還能避免間接法中因添加手性衍生化試劑引入雜質(zhì)對分離檢測帶來的影響。

苯丙胺類、氯胺酮、卡西酮類毒品對映異構(gòu)體的分離檢測廣泛使用了HPLC技術(shù),其中現(xiàn)有文獻中苯丙胺類毒品對映異構(gòu)體的分離研究使用手性固定相法的居多,也有部分采用手性添加劑法,而氯胺酮和卡西酮類則大多數(shù)使用手性固定相法。該3類毒品對映異構(gòu)體使用的手性固定相涉及3種不同類型的手性色譜柱,即蛋白質(zhì)類手性柱、多聚糖類手性柱和大環(huán)抗生素類手性柱。蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu),其亞單位L-氨基酸具有手性特異性,因此可以識別對映異構(gòu)體。由其制成的手性固定相廣泛應(yīng)用于手性藥物的識別檢測,其優(yōu)點是可使用水作為流動相且手性選擇能力較好。多聚糖類化合物(尤其是纖維素和支鏈淀粉)本身具有一定的手性識別能力,其衍生后表現(xiàn)出較好的手性識別能力,使其在手性柱方面得到廣泛應(yīng)用。大環(huán)抗生素類化合物分子具有立體的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、芳香基團、氨基和羥基等活性基團,包含幾個到幾十個手性中心。作為手性固定相,大環(huán)抗生素類化合物具有手性識別能力強、穩(wěn)定性高等優(yōu)點,相體系轉(zhuǎn)化時不發(fā)生老化和變性,在對映異構(gòu)體的分離方面已經(jīng)得到了較好的應(yīng)用[34]。這3類毒品手性分離研究中,使用較多的手性色譜柱類型、手性選擇劑以及使用的流動相總結(jié)見表1。

表 1 苯丙胺類、氯胺酮、卡西酮類毒品對映異構(gòu)體研究中常見手性色譜柱類型、手性選擇劑及相配的流動相

苯丙胺類 使用手性固定相法對苯丙胺類毒品對映異構(gòu)體進行手性分離的研究中,手性固定相的種類主要是大環(huán)抗生素類手性柱和蛋白質(zhì)類手性柱,多糖類手性柱的表現(xiàn)不佳。Castrignanò等[35]對比了Chiralpak CBH、Chirobiotic V和Chirobiotic T 3種手性色譜柱對苯丙胺類毒品對映異構(gòu)體的分離效果。Chiralpak CBH是蛋白質(zhì)類手性柱,通常用來拆分堿性化合物的對映異構(gòu)體,其優(yōu)勢是對包含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的伯胺和仲胺類化合物的手性分離能力較強。Chirobiotic V和Chirobiotic T是大環(huán)抗生素類手性柱,前者的手性選擇劑是萬古霉素,后者的手性選擇劑是替考拉寧,替考拉寧對某些天然和合成氨基酸以及小肽的對映異構(gòu)體分離能力較為突出[36]。3種手性柱中,Chiralpak CBH的總體分離效果略優(yōu)于Chirobiotic V,而Chirobiotic T可以分離某些ChiralpakCBH不能分離的苯丙胺類對映異構(gòu)體。該文獻[35]的方法可以分離廢水中AM、MAMP、MDMA等9種苯丙胺類毒品的18種對映異構(gòu)體,以峰面積對濃度進行線性回歸,每種物質(zhì)線性良好(相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.997),方法平均精密度小于10%,儀器平均精密度小于5%。該方法通過監(jiān)測生物環(huán)境中的毒品廢物,能夠用來跟蹤毒品的合成路徑和使用路徑。張穎怡等[37]對比了Chirobiotic V2和Chiralpak IA-3兩種手性色譜柱,Chirobiotic V2手性柱是新型鍵合型Chirobiotic V手性柱,升級后的手性識別能力增強,而Chiralpak IA-3是一種多聚糖類手性柱。實驗結(jié)果表明:Chirobiotic V2手性色譜柱對胺類化合物立體選擇性較優(yōu),對AM和MAMP對映異構(gòu)體的分離效果具有明顯優(yōu)勢,可以在12 min內(nèi)對AM和MAMP的對映異構(gòu)體實現(xiàn)手性分離,而Chiralpak IA-3手性色譜柱不能分離苯丙胺類對映異構(gòu)體。

使用手性添加劑法對苯丙胺類毒品進行手性分離時,手性選擇劑一般選用環(huán)糊精及其衍生物,環(huán)糊精及其衍生物加入的體積、流動相的比例會影響手性分離的效果。Taschwer等[38]考察了流動相的組成對苯丙胺類毒品對映異構(gòu)體分離效果的影響。如果流動相是體積比為10∶90的甲醇和水,并加入1%的硫化β-環(huán)糊精,則保留時間會縮短,但只有AM的對映異構(gòu)體可以得到分離;如果甲醇和水的體積比變?yōu)?.5∶97.5,硫化β-環(huán)糊精的體積依舊占比1%,則保留時間會增加,但是分離效果仍較差。因此經(jīng)過優(yōu)化,流動相的條件最終設(shè)置為體積比2.5∶97.5的甲醇和水,硫化β-環(huán)糊精體積占比2%,成功實現(xiàn)了AM、MDMA等6種苯丙胺類毒品的12種對映異構(gòu)體的分離。

氯胺酮 氯胺酮對映異構(gòu)體可以使用蛋白質(zhì)類手性柱、多聚糖類手性柱和大環(huán)抗生素類手性柱進行分離,每種手性柱對應(yīng)的方法各有特點。

Chiralpak AGP手性柱是蛋白質(zhì)類手性柱中分離能力最強、使用范圍最廣的一種,可以對中性、酸性和堿性化合物進行手性分離。使用此種手性柱對氯胺酮對應(yīng)異構(gòu)體進行分離的研究始于20世紀90年代初,該色譜柱的分離程度受pH、柱溫、有機溶劑比例等色譜條件影響較大,缺點是手性分離時間較長,只能耐受低比例的有機溶劑。蔣娟娟等[39]利用該手性柱,建立了檢測人體血漿中氯胺酮及其代謝物去甲基氯胺酮對映異構(gòu)體濃度的方法,并將此方法應(yīng)用于研究氯胺酮對映異構(gòu)體的藥代動力學(xué)。該方法手性分離效果良好,靈敏度高,無基質(zhì)效應(yīng)影響,但是進樣量不宜超過20 μL,否則會影響峰形。

Chiralpak AS-H是一種多聚糖類手性柱,該手性柱是Chiralpak AGP手性柱升級后的手性柱,其特點是克服了Chiralpak AGP手性柱運行時間長的缺點。Toki等[40]利用該手性柱建立了一種快速、高效分離大鼠血漿、大腦和腦脊髓液中氯胺酮對映異構(gòu)體的方法。該方法的優(yōu)點除了分析時間短(5 min)外,還有檢材用量少,每次僅需5 μL血漿、10 mg腦組織或2.5 μL腦脊髓液,定量限(LOQ)為1 ng/mL(血漿)、0.5 ng/g(大腦組織)和2 ng/mL(腦脊髓液)。多聚糖手性柱CHIRAL-JM-R手性柱可與高比例(有機相體積>30%)的有機試劑乙腈或甲醇一起使用,并顯示出與質(zhì)譜的良好相容性。Li等[41]利用該手性柱研究了血漿中氯胺酮對映體的檢測方法,以及給狗靜脈注射氯胺酮后,兩種對映異構(gòu)體體內(nèi)藥代動力學(xué)情況。他們考察了流動相的構(gòu)成,有機相選擇乙腈,常用的甲酸銨、乙酸銨體系不能分離氯胺酮對映異構(gòu)體,而當(dāng)水相為碳酸氫銨時,分離效果良好。氯胺酮的兩種對映異構(gòu)體在0.5～500 ng/mL間顯示出良好的線性(r2>0.99), LOQ為0.5 ng/mL,日內(nèi)精密度小于7.3%,日間精密度小于10%。

選擇大環(huán)抗生素類手性柱對氯胺酮對映異構(gòu)體進行分離時,將極性有機流動相模式引入手性分離,能夠取得比較好的效果。單麗娜等[42]測定人血漿中氯胺酮對映異構(gòu)體的濃度時,采用Chirobiotic V手性柱,使用的極性有機流動相為甲醇中加入少量有機酸冰醋酸和有機堿三乙胺。該實驗探究了冰醋酸和三乙胺比例對手性分離的影響,當(dāng)冰醋酸和三乙胺在甲醇中的總比例上升時,氯胺酮對映異構(gòu)體的保留時間和分離度逐漸下降;當(dāng)甲醇、冰醋酸、三乙胺體積比為100∶0.02∶0.02時,分離效果較佳,可以排除血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及氯胺酮代謝物對實驗結(jié)果產(chǎn)生的干擾。

卡西酮類 使用HPLC法分離卡西酮類毒品的對映異構(gòu)體時,常用手性固定相為多聚糖類手性柱,對流動相的配比要求較高。Kadkhodaei等[43]使用Lux i-cellulose-5手性色譜柱,成功實現(xiàn)了47種卡西酮類毒品的94種對映異構(gòu)體的分離。該實驗一開始選用極性有機流動相模式,以乙腈、異丙醇、二乙胺、甲酸(體積比為95∶5∶0.1∶0.1)為流動相,但手性分離結(jié)果并不理想,經(jīng)證實正相模式更優(yōu),流動相為正己烷、異丙醇和二乙胺(體積比為95∶5∶0.1)。H?gele等[44]以纖維素三-3,5-二甲基苯氨基甲酸酯為手性固定相,建立了一種可以快速分離數(shù)十種卡西酮衍生物對映異構(gòu)體的方法。該實驗一開始使用已有文獻中的流動相配比,即正己烷、異丙醇、二乙胺的體積比為90∶10∶0.1,調(diào)整3種物質(zhì)的配比為95∶5∶0.1和99∶1∶0.1,但是分離度和保留時間均不佳。之后將異丙醇換成正丁醇,并將配比調(diào)整至正己烷、正丁醇、二乙胺體積比100∶0.3∶0.2,可以成功分離33種卡西酮衍生物的66種對映異構(gòu)體和11種吡咯烷酮衍生物的22種對映異構(gòu)體。如果將流動相調(diào)整為正己烷-二乙胺體積比為100∶0.2,可以拆分另外9種卡西酮衍生物的18種對映異構(gòu)體和1種吡咯戊酮衍生物的2種對映異構(gòu)體;該方法還能對其中6種卡西酮衍生物的12種對映異構(gòu)體混合物進行同時分離。

隨著人們對手性識別機理認識的不斷深入以及色譜技術(shù)的不斷發(fā)展,HPLC已成為當(dāng)前手性藥物分離檢測中最常用和最有效的方法。然而,HPLC也存在一定限制,例如間接法同樣存在進樣前需進行手性衍生化導(dǎo)致操作較復(fù)雜的問題,而直接法則存在手性固定相價格較高的問題。每種手性固定相有其適宜分離的化合物,目前的應(yīng)用范圍有限,即使同屬于苯丙胺類、卡西酮類毒品,也會因其他基團的影響而導(dǎo)致需要使用不同種類的手性固定相。很難預(yù)測哪種手性固定相適用于具體的某種物質(zhì),選擇合適的手性固定相通常比較耗時并且成本較高。如果手性固定相改性升級后適用的范圍更廣,或者有更加準確的手性固定相識別機理,那么有可能解決選擇困難和成本高的問題。

2.2.3CE

CE是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的液相分離方法,其特點是集高效和應(yīng)用廣泛性于一身,相對HPLC技術(shù)成本較低,在手性分離方面也顯示出了巨大潛力。目前使用CE分離手性化合物的研究中,環(huán)糊精(CD)及其衍生物是眾多手性選擇劑里最常用的一類[45],這在苯丙胺類、氯胺酮和卡西酮類的手性分離研究中也有所體現(xiàn)。這3類毒品使用CE進行手性分離研究的重點主要集中在手性選擇劑的種類和濃度對手性分離的影響,使用的手性選擇劑主要是環(huán)糊精及其衍生物。總體來說,苯丙胺類、氯胺酮、卡西酮類毒品對映異構(gòu)體使用β-CD及其衍生物和硫化γ-CD進行分離的效果最佳。

由于β-CD的空腔與大部分藥物相匹配,且易于制得,因此β-CD及其衍生物是電中性環(huán)糊精及其衍生物中最為常用的類型之一[46],苯丙胺類、氯胺酮、卡西酮類毒品對映異構(gòu)體均能使用β-CD及其衍生物進行手性分離。Varesio等[47]在實驗中對比了α-CD、β-CD和γ-CD分離尿液中AM、MDA、MDMA、MDEA外消旋體的效果,結(jié)果顯示γ-CD最不適合苯丙胺類對映異構(gòu)體的分離,β-CD和2-羥丙基-β-CD的分離效果較好,相較于β-CD, 2-羥丙基-β-CD具有更優(yōu)的特性:稍好一些的溶解性,更短的分析時間以及200 nm下UV檢測基線更穩(wěn)定,因而最終被選定。該實驗還比較了2-羥丙基-β-CD濃度對手性分離的影響,在10～40 mmol/L的濃度范圍中,20 mmol/L是最佳濃度。

硫化γ-CD屬于陰離子型環(huán)糊精,一般認為比中性環(huán)糊精的手性分離能力更強,其優(yōu)勢是可以通過靜電作用吸附到毛細管壁上,起到類似固定相作用,避免樣品吸附,改善分離效果,并且還可以調(diào)整對映異構(gòu)體的出峰順序。Mikuma等[48]以高硫化γ-CD為手性選擇劑,建立了一種可以分離AM、MAMP、麻黃堿等8種苯丙胺類衍生物的16種對映異構(gòu)體混合物的方法。Theurillat等[49]研究了硫化γ-CD分離氯胺酮及其代謝物對映異構(gòu)體的方法。他們開展了微測定實驗,每組實驗使用50 μL狗的血漿或血清,將0.6%～0.8%(緩沖液中的體積分數(shù)，下同)硫化γ-CD作為手性選擇劑加入pH=3的100 mmol/L磷酸緩沖液中,于25 ℃的條件下,在16 min內(nèi)拆分出手性氯胺酮,定量限小于1 ng/mL。實驗發(fā)現(xiàn)0.66%的硫化γ-CD已經(jīng)可以進行手性分離,硫化γ-CD體積分數(shù)升高會增加檢測時間,體積分數(shù)降低會縮短檢測時間，體積分數(shù)過低可能會導(dǎo)致檢測不充分。該方法的實驗結(jié)果完全可媲美HPLC法。Moini等[50]研究了使用CE-MS技術(shù)時,高硫化γ-CD的體積分數(shù)(為0.08%～0.2%)及其在毛細管柱中的填充量對卡西酮類對映異構(gòu)體分離的影響。當(dāng)體積分數(shù)為0.125%時,手性分離效果最好?；谒麄冎暗难芯?(+)-18-冠-6-四羧酸是一種冠醚類手性選擇劑,能對某些氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)的對映異構(gòu)體進行分離,將其與CD合用構(gòu)成二元體系手性分離能力更強。在該實驗中,他們將15 mmol/L的(+)-18-冠-6-四羧酸填充到毛細管中,與0.125%高硫化γ-CD合用,成功分離了6種卡西酮類衍生物的12種對映異構(gòu)體。

該3類毒品對映異構(gòu)體通常使用的是CE技術(shù)中最為常見的分離模式,即毛細管區(qū)帶電泳(CZE),此外也有毛細管電色譜(CEC)模式的研究。CEC模式是CE與液相色譜相結(jié)合形成的一種微分離技術(shù),通過在毛細管柱內(nèi)填充或鍵合手性固定相,以電滲流為驅(qū)動力,根據(jù)對映體在手性固定相和流動相之間分配系數(shù)及電泳淌度的不同實現(xiàn)分離,該技術(shù)在對映異構(gòu)體的分離研究中有一定優(yōu)勢。Aturki等[51]利用CEC建立了一種可以分離10種卡西酮衍生物的20種對映異構(gòu)體的方法,該方法的核心是毛細管柱中填充直鏈淀粉-三(5-氯-2-甲基苯氨基甲酸酯)作為手性固定相。電壓設(shè)置為10 kV,溫度為20 ℃,可以在10 min內(nèi)分離10種對映異構(gòu)體。與GC、LC相比,CEC具有試劑用量少、手性固定相含量少等優(yōu)點,因此在對映異構(gòu)體的分離研究中CEC法具有經(jīng)濟且環(huán)境友好的優(yōu)勢。

CE技術(shù)是近年來在手性分析中發(fā)展最快的技術(shù),已取得重要的地位和得到廣泛的應(yīng)用,但其明顯缺點在于沒有明確的方法判斷哪種物質(zhì)是合適的手性選擇劑,僅停留在經(jīng)驗和實驗階段,各種手性選擇劑確切的拆分機制及其影響因素,還有待于進一步研究和探索。目前苯丙胺類、氯胺酮、卡西酮類毒品對映異構(gòu)體的分離研究中,經(jīng)常需要對比3種以上的手性選擇劑才能選出其中較為合適的一種,如何根據(jù)待分離化合物的結(jié)構(gòu)特點判斷適合的手性選擇劑是需要解決的難點問題。

3 3類毒品對映異構(gòu)體的分離在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

在法醫(yī)毒物學(xué)領(lǐng)域中,對手性毒品的研究包括對已知毒品對映異構(gòu)體純度的檢驗以及未知毒品性質(zhì)的認定等方面。建立快速、高效的手性分析方法,對判斷毒品來源、認定犯罪嫌疑人罪名、為法官提供量刑參考等方面都有重要影響。

近年來,在法醫(yī)毒物學(xué)分析領(lǐng)域中,苯丙胺類毒品對映異構(gòu)體的研究主要集中在測定毒品濫用者血漿、毛發(fā)、尿液中MAMP和AM的含量,并由此推斷市場上毒品的原型及合成路線。Maas等[52]通過LC-MS/MS技術(shù),研究了106份由德國兩個地區(qū)警察提供的案件血漿樣本,結(jié)果顯示在超過99%的檢材中,僅檢測到S-MAMP,從而得出結(jié)論,在德國市場上主要流通的是由1R,2S-麻黃堿或1S,2S-偽麻黃堿合成的S-MAMP,以及外消旋體MAMP。Binz等[53]研究了兩類人員的頭發(fā),第一類是瑞士警方提供的街頭服用AM的人員,第二類是服用一種治療注意缺陷障礙藥物(活性成分是S-AM)患者,實驗發(fā)現(xiàn)從第一類人員毛發(fā)中檢測出的R/S-AM對映異構(gòu)體比例為0.9～1.3,表明這些人員攝入的是外消旋體AM,而除一名患者外,第二類人員的頭發(fā)種僅檢測出S-AM。通過對映異構(gòu)體的比例可以簡單判斷是服用藥物還是攝入AM毒品。Wang等[54]通過建立的檢測尿液中AM和MAMP對映異構(gòu)體的方法,成功檢測了86份疑似MAMP濫用者的尿樣。其中72份樣品中只檢測到S-MAMP和S-AM,有14份尿樣中兩種構(gòu)型的MAMP和AM都均檢出,但S-MAMP和S-AM占比更大,所有尿樣中都沒有單獨檢測出R-MAMP陽性,因此可以推斷S-MAMP是非法濫用藥物的主要成分。飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)可以提供化合物的準確質(zhì)量信息,因而越來越多地用于篩查未知藥物。Cui等[55]建立了一種利用毛細管電泳-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)篩查苯丙胺類毒品的方法,該方法可以快速、準確地篩查未知樣品是否包含AM、MAMP、MDA等9種苯丙胺類毒品的對映異構(gòu)體。

氯胺酮對映異構(gòu)體的分離研究涉及的人體相關(guān)檢材類型非常豐富。Hasan等[56]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了一種可以從人血清、尿液和排泄物中分離出氯胺酮對映異構(gòu)體的方法。該方法的優(yōu)點為所需基質(zhì)的體積小(200 μL),洗脫液用量少(300 μL),可以延長色譜柱的壽命,并且樣品制備速度快,分析時間短且靈敏度更高。該方法還可以分離10種羥基化的氯酮胺代謝物。Porpiglia等[57]研究了人毛發(fā)中氯胺酮對映異構(gòu)體的分離方法,他們還通過驗證實踐中收集到的氯胺酮呈陽性的毛發(fā)樣品,確認了建立方法的有效性,為法庭科學(xué)領(lǐng)域檢測毛發(fā)中是否含有手性氯胺酮提供了參考方法法。

在過去的幾年中,卡西酮類毒品的種類越來越多,針對這個問題,法醫(yī)毒物學(xué)領(lǐng)域的研究趨勢是建立的方法能分離數(shù)十種卡西酮衍生物的對映異構(gòu)體,這樣的方法可以提高檢驗效率。Alremeithi等[58]通過氣相色譜-負化學(xué)電離-質(zhì)譜法(GC-NCI-MS),使用L-TPC進行衍生化,建立了一種可以靈敏分離36種卡西酮衍生物的72種對映異構(gòu)體的方法。該方法還可以對一次性加入14種卡西酮衍生物的28種對映異構(gòu)體混合物的尿液和血漿樣品進行定量分析。H?gele等[59]利用CZE技術(shù)建立的方法能分離58種卡西酮衍生物的106種對映異構(gòu)體,該方法使用β-CD、乙?；?β-CD、2-羥丙基-β-CD、CM-β-CD 4種CD衍生物作為手性選擇劑,每種手性選擇劑對應(yīng)不同的工作電壓(β-CD:陰極30 kV,乙酰基-β-CD和2-羥丙基-β-CD:陰極29 kV, CM-β-CD:陰極22 kV),除工作電壓不同外,其他條件一致(10 mmol/L手性選擇劑,10 mmol/L磷酸鈉,用磷酸調(diào)節(jié)的pH=2.5,溫度25 ℃)。

4 結(jié)論與展望

分析技術(shù)的不斷發(fā)展對毒品的檢測、分離與認定均產(chǎn)生了積極作用。在現(xiàn)有研究中,毒品對映異構(gòu)體的分離方法主要以GC、HPLC和CE技術(shù)為主,另外,近些年還有部分研究使用的是SFC技術(shù),該技術(shù)是一種以超臨界流體為流動相的色譜分析技術(shù),其特點是既可以分析揮發(fā)性差的樣品,還具有比HPLC更高的效率,分析時間更短,操作條件易變換,在手性分離上具有較優(yōu)的前景。目前已有使用該技術(shù)對這3類毒品的對映異構(gòu)體進行分離的研究[60-62],還有將SFC與HPLC技術(shù)相結(jié)合的苯丙胺手性分離研究[63],但該技術(shù)的缺點是各種參數(shù)對手性分離的影響機制尚未完全確定,需要在高壓下進行,對設(shè)備和技術(shù)上要求較高,如果未來能解決上述問題,SFC技術(shù)可能成為對映異構(gòu)體分離中常用的技術(shù)之一。

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局、公安部、國家衛(wèi)生和計劃生育委員會公布的《麻醉藥品和精神藥品品種目錄》(食藥監(jiān)藥化監(jiān)[2013]230號)和公安部、國家衛(wèi)生計生委、國家食品藥品監(jiān)督管理總局、國家禁毒辦公室發(fā)布的《非藥用類麻醉藥品和精神藥品列管辦法》(公通字[2015]27號)及4次增加公告,截至目前,我國共管制麻醉藥品121種,精神藥品149種,非藥用類麻醉藥品和精神藥品156種(另加156種以外其他符合條件的芬太尼類物質(zhì)),而能對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴重危害的藥品數(shù)量遠遠不止這些,未納入管制的毒品中還包括一部分手性毒品。未來毒品對映異構(gòu)體的研究將是毒品來源判斷、純度認定(摻雜、摻假)、對犯罪嫌疑人定罪量刑判斷的一個重要方向。隨著新精神活性物質(zhì)種類的不斷增加,毒品種類和成分越來越復(fù)雜,涉及的對映異構(gòu)體分離檢測會逐漸增多。今后對毒品手性分離的研究應(yīng)從以下3個方面展開:(1)進一步借助計算機技術(shù)對手性固定相和手性選擇劑的手性識別機理進行深入研究,建立和完善分子模型模擬手性識別方法,為日后挑選最合適的手性固定相和手性選擇劑進行研究提供有力的理論支持;(2)研發(fā)可以應(yīng)用于手性分離的新型技術(shù),以及對SFC技術(shù)的商用研究;(3)手性分離在司法實踐、醫(yī)藥研發(fā)等實際工作中的應(yīng)用。