• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法快速篩查與確證紫甘藍中415種農(nóng)藥殘留

    2021-03-11 02:29:32謝瑜杰蓋麗娟霍思宇范春林呂美玲
    色譜 2021年3期
    關(guān)鍵詞:甘藍定性質(zhì)譜

    謝瑜杰, 陳 輝*, 蓋麗娟, 霍思宇, 范春林, 呂美玲

    (1. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176; 2. 北京合眾恒星檢測科技有限公司, 北京 100176; 3. 安捷倫科技(中國)有限公司, 北京 100102)

    農(nóng)藥殘留是食品安全領(lǐng)域長期關(guān)注的問題之一。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留主流檢測技術(shù)有氣相色譜-質(zhì)譜法[1]、氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[2-7]和液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法等[8-14]。隨著農(nóng)藥種類的不斷增加,目前世界常用農(nóng)藥已經(jīng)增加到1 100多種[15],傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)已經(jīng)不能滿足實際檢測需求。

    高分辨質(zhì)譜以其精確質(zhì)量數(shù)、高分辨率和不依賴標準品進行定性的優(yōu)勢[16,17],在食品中農(nóng)藥殘留高通量篩查方法中得到了廣泛應(yīng)用[18,19]。例如,趙志遠等[20]應(yīng)用液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(LC-QTOF/MS)建立281種農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜圖庫,并采用該數(shù)據(jù)庫和譜圖庫檢索的方式,實現(xiàn)了蘋果、番茄和甘藍中281種農(nóng)藥殘留的快速篩查。宋偉等[21]應(yīng)用LC-QTOF/MS建立了204種農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜圖庫,通過化合物的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素比值等信息對檢測結(jié)果進行自動檢索,從而在無對照標準品的情況下實現(xiàn)了204種農(nóng)藥的定性鑒定。在這些方法中,通常需要2次進樣篩查,即第一次進樣后通過加合離子、保留時間等信息對化合物進行初步篩查,第二次則是針對初篩化合物建立二級采集方法,通過與二級譜圖庫比對進行化合物確證。盡管這種方式進行農(nóng)殘篩查可以獲得較高的靈敏度,但是從快速、高效和節(jié)約成本的角度考慮,建立一次進樣的篩查方法可以顯著提高篩查效率[22]。

    全自動MS/MS采集模式(Auto MS/MS)和全離子MS/MS采集模式(All Ions MS/MS)是LC-QTOF/MS中只需要一次進樣便可對化合物進行篩查的兩種采集模式。在Auto MS/MS模式中,輸入加合離子信息和碰撞能后,質(zhì)譜在一個循環(huán)時間內(nèi)交替對一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜進行掃描,根據(jù)一級和二級質(zhì)譜匹配情況對化合物進行確證[23]。在All Ions MS/MS采集模式中,選擇多個碰撞能通道進行采集,通過分析各通道化合物共流出的特征,得到加合離子和碎片離子的共流出關(guān)系,根據(jù)目標物的保留時間、加合離子和碎片離子的精確分子量等信息與數(shù)據(jù)庫進行檢索比對,最終對化合物進行確證[24,25]。

    紫甘藍是一種常見的蔬菜,常見于蔬菜沙拉等非加熱類菜品中,在其種植過程中通常會施用多種農(nóng)藥。研究表明,紫甘藍屬于堿性蔬菜,其紫紅色葉片中色素含量非常豐富,不易凈化。紫甘藍由于自身基質(zhì)的復(fù)雜性,對其殘留的農(nóng)藥進行準確篩查的難度相對較大。本文以可篩查農(nóng)藥種數(shù)和假陰性農(nóng)藥種數(shù)作為指標,考察了Auto MS/MS和All Ions MS/MS兩種不同采集模式,最終選擇All Ions MS/MS采集模式。然后在選擇的采集模式下,建立了基于LC-QTOF/MS的紫甘藍中415種農(nóng)藥殘留快速篩查方法。將該方法應(yīng)用于2019年能力驗證紫甘藍中農(nóng)藥殘留的篩查和定量,對該方法的準確性和可靠性進行了考察和驗證。與傳統(tǒng)兩次采集進行篩查的方法相比,本文建立的一次進樣對紫甘藍中農(nóng)藥多殘留進行定性篩查和定量測定的方法,提高了農(nóng)藥殘留篩查的效率,可以為水果和蔬菜中農(nóng)藥多殘留的快速篩查提供參考。

    1 實驗部分

    1.1 儀器、試劑與材料

    Agilent 1290 Infinity II LC-6545 Q-TOF/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有雙噴射電噴霧電離源(美國Agilent公司), AH-30全自動均質(zhì)儀、Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀、高通量真空平行濃縮儀(中國??苾x器有限公司), SR-2DS水平振蕩器(日本Tatec公司), KDC-40低速離心機(安徽中佳公司), N-EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates公司), Milli-Q超純水機(美國Millipore公司), PL602-L電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

    415種農(nóng)藥標準品純度均≥95%(中國阿爾塔科技有限公司);甲酸和乙酸銨均為質(zhì)譜純;乙腈、甲苯為色譜純(美國Fisher公司);乙酸、氯化鈉、無水硫酸鈉和無水硫酸鎂均為分析純(中國安譜公司); Carbon/NH2柱(美國Agilent公司)。

    1.2 標準溶液的配制

    稱取10 mg(精確至0.01 mg)標準品,置于10 mL棕色容量瓶中,以甲醇定容至刻度,配制單標準儲備液,于-18 ℃避光保存;根據(jù)需要,移取適量儲備液,用甲醇稀釋,配制所需濃度的標準工作液,于4 ℃避光保存。

    1.3 樣品前處理

    提取:稱取紫甘藍樣品10 g,置于80 mL離心管中,加入1%醋酸乙腈40 mL,以13 500 r/min均質(zhì)1 min,加入1 g氯化鈉、4 g無水硫酸鎂,振蕩10 min,以4 200 r/min離心5 min,取上清液20 mL,在37 ℃、150 r/min條件下蒸發(fā)濃縮至約2 mL,待凈化。

    凈化:在Carbon/NH2柱中加入約2 cm無水硫酸鈉,將Carbon/NH2柱放到自動固相萃取儀上。用4 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)活化SPE柱,并棄去流出液,每次用2 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗滌樣液瓶3次,并將洗滌液移入Carbon/NH2柱中。再用25 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗脫,合并洗脫液,置于試管中。在37 ℃、150 r/min條件下蒸發(fā)濃縮至約0.5 mL,并將濃縮液置于氮氣下吹干,加入1 mL乙腈-水(3∶2, v/v)混勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,定容。

    1.4 儀器條件

    色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨), B相為乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0~3 min, 1%B; 3~6 min, 1%~30%B; 6~9 min, 30%~40%B; 9~15 min, 40%B; 15~19 min, 40%~60%B; 19~23 min, 60%~90%B; 23~23.01 min, 90%~1%B; 23.01~27.01 min, 1%B。進樣體積:5 μL。

    離子源:雙通路噴射流電噴霧電離(Dual AJS ESI)源;掃描方式:正離子全掃描;全掃描范圍:m/z50~1 000;毛細管電壓:4 000 V;霧化氣體:氮氣;霧化氣壓力:0.14 MPa;鞘氣溫度:375 ℃;鞘氣流速:11.0 L/min;干燥氣流速:12.0 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;碎裂電壓:145 V。

    All Ions MS/MS模式條件:0 min時,碰撞能為0 V; 0.5 min時,碰撞能分別為0、15和35 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

    表 1 415種農(nóng)藥的分子式、保留時間(tR)、加合離子、定量離子和定性離子

    表 1 (續(xù))

    表 1 (續(xù))

    表 1 (續(xù))

    表 1 (續(xù))

    表 1 (續(xù))

    表 1 (續(xù))

    表 1 (續(xù))

    表 1 (續(xù))

    2 結(jié)果與討論

    2.1 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

    2.2 采集模式的選擇和參數(shù)優(yōu)化

    在基于QTOF/MS的高分辨質(zhì)譜中,要實現(xiàn)同時采集獲取一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息,可以通過兩種方式實現(xiàn)。一種是數(shù)據(jù)依賴的采集模式,如Auto MS/MS采集模式;另外一種是數(shù)據(jù)非依賴的模式,如All Ions MS/MS采集模式。本文分別對兩種模式下的參數(shù)進行優(yōu)化,并在各自最優(yōu)的條件下進行比較。

    2.2.1Auto MS/MS采集參數(shù)的優(yōu)化

    Auto MS/MS采集模式中,可以允許系統(tǒng)根據(jù)質(zhì)譜圖中m/z的響應(yīng)強度來自動選擇母離子進行二級質(zhì)譜掃描,同時允許對指定化合物列表優(yōu)先進行二級質(zhì)譜掃描。為了保證優(yōu)化效果,本文根據(jù)農(nóng)藥化學性質(zhì)分類,選擇PCDL庫中的214種農(nóng)藥放入指定列表,并在其相應(yīng)的保留時間窗口優(yōu)先采集其二級質(zhì)譜圖。在固定標準混合溶液質(zhì)量濃度為100 μg/L條件下,對Auto MS/MS采集模式的參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果顯示,在固定一級質(zhì)譜采集速率下,隨著二級質(zhì)譜采集速率從2 spectra/s增加到6 spectra/s,篩查出的農(nóng)藥占比逐漸下降,同時假陰性農(nóng)藥的占比逐漸增加,采集速率為2 spectra/s時的篩查結(jié)果相對最佳,篩查出農(nóng)藥占比可以達到79.91%。因此,在采用Auto MS/MS模式時,二級采集速率建議設(shè)定為2 spectra/s,以盡可能提升檢出的農(nóng)藥占比,降低假陰性率。

    2.2.2All Ions MS/MS優(yōu)化

    數(shù)據(jù)非依賴的All Ions MS/MS模式是近年來發(fā)展起來的一種高效采集模式,采集時無需事先設(shè)置加合離子信息,可以針對采集的數(shù)據(jù),依據(jù)保留時間、加合離子和二級碎片離子的共流出輪廓匹配情況對化合物進行定性。因此,至少需要高低兩個能量通道以滿足定性和定量數(shù)據(jù)的同時采集。碰撞能和采集速率是影響All Ions MS/MS采集模式性能的重要參數(shù),本文分別對二者進行了優(yōu)化。

    實驗首先對碰撞能進行了優(yōu)化。在All Ions MS/MS模式中需要設(shè)置碰撞能0 V以獲得化合物的加合離子信息,設(shè)置0 V以上的碰撞能以獲得二級質(zhì)譜的信息。本實驗選擇前述214種代表性農(nóng)藥進行碰撞能優(yōu)化。碰撞能較低時,采集到的碎片離子較少,用于定性的離子可能會偏少,導致定性信息不充分。如果碰撞能較高,化合物的主要定性離子強度降低,同時相對分子量較低的碎片離子增加,而基質(zhì)中的干擾峰通常位于低相對分子質(zhì)量端,這會對化合物的定性產(chǎn)生干擾。因此,本文在固定采集速率為2 spectra/s的條件下,對比了在0 V和15 V雙碰撞能通道下和0、15和30 V三碰撞能通道下,以及0、15和35 V三碰撞能通道下采集所篩出農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥的占比情況(見圖1)。可以看出,在0、15和35 V三碰撞能通道下,可篩查出農(nóng)藥的占比明顯高于其他情況,這主要是因為,同時在0、15和35 V三碰撞能通道下采集,可以使得一些相對穩(wěn)定的化合物產(chǎn)生相對較強的二級碎片離子,有助于對化合物進行同時基于母離子和二級碎片離子的準確定性。

    圖 1 不同碰撞能下準確篩查出的農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥占比Fig. 1 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different collision energies

    在選定的0、15和35 V三碰撞能通道下,針對這214種農(nóng)藥,對采集速率進行優(yōu)化。圖2給出了2、3、4、5和6 spectra/s等5種采集速率下,篩出農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥的占比情況。從圖2可以看出,對于采集速率2、3和4 spectra/s,隨著采集速率的增加,可篩查出的農(nóng)藥占比增加,采集速率為4 spectra/s時,所有農(nóng)藥均能篩出,但是當采集速率設(shè)置為5 spectra/s和6 spectra/s時,可篩出農(nóng)藥數(shù)量的占比有所下降。同時,由于在All Ions MS/MS模式中兩個通道交替采集,采集速率逐漸增加,每個采集點的掃描時間下降,使得加合離子的響應(yīng)逐漸下降,在保證每個色譜峰采集點數(shù)滿足準確定量的前提下,采集速率為4 spectra/s時的篩查結(jié)果最佳。

    圖 2 不同采集速率下準確篩查出的農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥占比Fig. 2 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different acquisition rates

    2.2.3不同采集模式的比較

    在Auto MS/MS和All Ions MS/MS兩種采集模式的最佳條件下,分別對214種農(nóng)藥的篩查情況進行比較。結(jié)果表明,214種農(nóng)藥在All Ions MS/MS采集模式下的篩出農(nóng)藥數(shù)量占比為100%,遠高于在Auto MS/MS采集模式下的檢出率(79.91%)。結(jié)合前述分析,Auto MS/MS采集模式下的篩出農(nóng)藥占比均低于All Ions MS/MS采集模式任一碰撞能下的檢出率,說明All Ions MS/MS采集模式更加靈敏,假陰性率明顯降低,優(yōu)于Auto MS/MS采集模式。因此,本文選擇All Ions MS/MS采集模式中0、15和35 V三碰撞能通道和采集速率4 spectra/s作為最佳條件,建立紫甘藍中415種農(nóng)藥的高通量篩查方法。

    2.3 方法學驗證

    2.3.1線性范圍、篩查限與定量限

    稱取6份空白紫甘藍樣品,按1.3節(jié)描述進行前處理后,分別加入不同濃度的混合標準工作液,建立基質(zhì)匹配標準曲線。應(yīng)用All Ions MS/MS模式測定目標化合物,以加合離子的質(zhì)量濃度對其峰面積繪制標準曲線,415種農(nóng)藥在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均高于0.990(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com/)。

    關(guān)于篩查限(SDL)的確定,參照歐盟指南文件SANTE/12682/2019的要求,在一系列濃度水平上做添加回收試驗,每個水平制備20個平行樣,按照1.3節(jié)描述進行前處理后進行檢測。如果在某添加水平下,某個化合物在19個紫甘藍樣品中均能被定性篩查出來,則該濃度被確定為該化合物在紫甘藍中的篩查限。附表1給出了415種農(nóng)藥的篩查限,為1~20 μg/kg,其中411種農(nóng)藥的篩查限小于等于5 μg/kg。

    按照1.3節(jié)描述對紫甘藍樣品進行前處理,向空白樣品中添加不同水平的目標化合物,在前述最佳條件下進行測定,以信噪比S/N≥10對應(yīng)的添加水平作為定量限(LOQ),結(jié)果見附表1,紫甘藍中415種農(nóng)藥的定量限為1~20 μg/kg,其中413種農(nóng)藥的LOQ≤10 μg/kg。

    2.3.2回收率與精密度

    為了考察方法的準確度和精密度,對空白紫甘藍樣品進行添加回收試驗。分別選擇1倍、2倍和10倍LOQ的混合標準工作液作為添加水平,按前述方法進行前處理,每個添加水平制備5個平行樣品。同時進行空白實驗,扣除本底值后計算添加回收率和相對標準偏差。紫甘藍中415種農(nóng)藥在1倍、2倍和10倍LOQ添加水平下的回收率分別為65.7%~118.4%、72.0%~118.8%和70.2%~111.2%,相對標準偏差分別為0.9%~19.7%、0.2%~19.9%和0.6%~19.9%,結(jié)果見附表1。說明該方法的準確度和精密度滿足準確定量的要求。

    2.4 歐盟能力驗證樣品測定

    2019年歐盟組織了紫甘藍中農(nóng)藥殘留檢測的能力驗證,包括定性篩查(EUPT-SM-11)和定量篩查(EUPT-FV-21)兩方面內(nèi)容。將本文建立的篩查方法應(yīng)用于該能力驗證項目提供的紫甘藍樣品中農(nóng)藥殘留的定性篩查和準確定量,評估了該方法的定性可靠性和定量準確性。樣品前處理按照1.3節(jié)描述進行,用All Ions MS/MS模式在最佳參數(shù)條件下進行數(shù)據(jù)采集。

    定性篩查EUPT-SM-11未給定紫甘藍樣品中添加農(nóng)藥的范圍,重點考察篩查出農(nóng)藥的種類,定量僅做參考,而且要求收到樣品72 h內(nèi)上報結(jié)果。結(jié)果顯示,本實驗室應(yīng)用本文開發(fā)的方法篩出了添加的16種農(nóng)藥,沒有假陽性結(jié)果。與歐盟官方最終公布結(jié)果完全一致。

    關(guān)于定量篩查EUPT-FV-21,組織方提供了強制和自愿農(nóng)藥清單,要求首先對紫甘藍中在清單范圍內(nèi)的農(nóng)藥進行篩查,再對篩查出的農(nóng)藥準確定量。要求檢測范圍覆蓋強制農(nóng)藥清單的90%,檢出所添加農(nóng)藥種類的90%或以上并能準確定量,并且不能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

    應(yīng)用本文建立的方法首先進行定性篩查,準確篩查出了其中可以采用基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測的19種非揮發(fā)性農(nóng)藥,并采用相應(yīng)的標準品進行進一步的準確定量。結(jié)果表明,本文建立的紫甘藍中農(nóng)藥多殘留篩查方法定性能力強,沒有假陽性,而且定量結(jié)果準確可靠,所有篩查出的化合物的定量結(jié)果均在驗證樣品的標準值允許誤差范圍內(nèi)。

    3 結(jié)論

    通過對比不同采集模式,優(yōu)化采集參數(shù),本文應(yīng)用液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜建立了紫甘藍中415種農(nóng)藥殘留的高通量定性篩查與準確定量方法。將該方法應(yīng)用于2019年歐盟組織的紫甘藍中農(nóng)藥殘留能力驗證,結(jié)果表明,基于All Ions MS/MS采集模式的一次進樣便可快速定性和定量的方法,具有非常強的定性篩查能力,同時可以對篩查出的化合物進行準確定量。該方法具有簡單、快速的特點,適用于對紫甘藍中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查,可以為其他水果蔬菜中農(nóng)藥殘留的高通量篩查提供參考。

    猜你喜歡
    甘藍定性質(zhì)譜
    甘藍家族中的“顏值擔當”——羽衣甘藍
    分裂平衡問題的Levitin-Polyak適定性
    氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用及維護
    變色的紫甘藍
    當歸和歐當歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    耐熱早秋甘藍潤夏一號栽培技術(shù)
    長江蔬菜(2016年10期)2016-12-01 03:05:34
    吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定水中18種揮發(fā)性有機物
    共同認識不明確的“碰瓷”行為的定性
    毆打后追趕致人摔成重傷的行為定性
    棗霜化學成分的色譜質(zhì)譜分析
    亚洲精品在线观看二区| 热re99久久国产66热| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久人妻av系列| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜福利成人在线免费观看| 成年免费大片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | av片东京热男人的天堂| 一夜夜www| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产91精品成人一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久| 黄频高清免费视频| 成人手机av| 很黄的视频免费| svipshipincom国产片| 国产激情欧美一区二区| 亚洲色图av天堂| 精品电影一区二区在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 制服丝袜大香蕉在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲色图av天堂| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜激情av网站| 91字幕亚洲| 国产91精品成人一区二区三区| 香蕉丝袜av| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久青草综合色| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 免费在线观看影片大全网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 一级片免费观看大全| 99久久精品国产亚洲精品| 男女那种视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜免费观看网址| 欧美黑人巨大hd| aaaaa片日本免费| 亚洲精品在线观看二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 黑人操中国人逼视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久久国产成人免费| 欧美zozozo另类| 欧美日韩乱码在线| videosex国产| 长腿黑丝高跟| 18禁国产床啪视频网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 女同久久另类99精品国产91| 色在线成人网| 日韩视频一区二区在线观看| 久久久国产成人免费| 亚洲国产中文字幕在线视频| 热re99久久国产66热| av免费在线观看网站| av天堂在线播放| 天堂√8在线中文| 一级片免费观看大全| 99久久精品国产亚洲精品| 看免费av毛片| 亚洲一区中文字幕在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久香蕉国产精品| 国产av又大| 久久伊人香网站| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 成人国产一区最新在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲最大成人中文| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 91国产中文字幕| 我的亚洲天堂| 老熟妇仑乱视频hdxx| 88av欧美| 俺也久久电影网| 国产成人欧美在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 精品国产亚洲在线| 欧美黄色片欧美黄色片| 禁无遮挡网站| 高清在线国产一区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品在线观看二区| 久久中文字幕一级| 在线av久久热| 无限看片的www在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 岛国视频午夜一区免费看| 男女视频在线观看网站免费 | 狠狠狠狠99中文字幕| 国内精品久久久久久久电影| 看片在线看免费视频| 国产一区二区三区视频了| 亚洲自拍偷在线| 色综合站精品国产| 麻豆成人午夜福利视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 白带黄色成豆腐渣| 欧美激情高清一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 黄片播放在线免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产av一区二区精品久久| 一夜夜www| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产99白浆流出| 午夜福利一区二区在线看| 51午夜福利影视在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲av片天天在线观看| 日韩欧美 国产精品| 宅男免费午夜| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 女人被狂操c到高潮| 精品国内亚洲2022精品成人| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美午夜高清在线| 人成视频在线观看免费观看| www.熟女人妻精品国产| 婷婷亚洲欧美| 丰满的人妻完整版| 免费搜索国产男女视频| 日韩欧美在线二视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 美女午夜性视频免费| 国产精品av久久久久免费| 最近在线观看免费完整版| 制服人妻中文乱码| 亚洲中文字幕日韩| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成熟少妇高潮喷水视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲无线在线观看| 女警被强在线播放| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产色视频综合| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产99白浆流出| 久久精品国产清高在天天线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 天天添夜夜摸| 亚洲久久久国产精品| 丝袜美腿诱惑在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 中文字幕高清在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 变态另类丝袜制服| 国产麻豆成人av免费视频| 99国产精品99久久久久| www.自偷自拍.com| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 国产精品久久电影中文字幕| 久久 成人 亚洲| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av有码第一页| 亚洲av电影在线进入| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 一级作爱视频免费观看| 国产成人av教育| 悠悠久久av| www日本在线高清视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品久久久久久精品电影 | 校园春色视频在线观看| 久久精品国产综合久久久| 黄色 视频免费看| 亚洲av美国av| 国产成人影院久久av| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲国产精品sss在线观看| 天天添夜夜摸| 日韩大尺度精品在线看网址| 午夜a级毛片| 日韩有码中文字幕| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产成人系列免费观看| 91国产中文字幕| 国产熟女xx| 香蕉av资源在线| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲中文av在线| 人妻久久中文字幕网| 欧美日韩黄片免| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲自拍偷在线| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲av五月六月丁香网| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产99久久九九免费精品| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精华一区二区三区| 曰老女人黄片| 欧美日韩乱码在线| 久久久久久久久中文| 香蕉av资源在线| 首页视频小说图片口味搜索| 久久久久久九九精品二区国产 | 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品在线观看二区| 一级作爱视频免费观看| 女性被躁到高潮视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 女性生殖器流出的白浆| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 99久久精品国产亚洲精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美午夜高清在线| 无人区码免费观看不卡| 超碰成人久久| 免费在线观看完整版高清| 成人手机av| 99精品在免费线老司机午夜| 久久欧美精品欧美久久欧美| cao死你这个sao货| 观看免费一级毛片| 精品人妻1区二区| 视频在线观看一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 最好的美女福利视频网| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品免费视频内射| 在线天堂中文资源库| 性欧美人与动物交配| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| АⅤ资源中文在线天堂| xxxwww97欧美| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一a级毛片在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美三级亚洲精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 成年免费大片在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲国产精品999在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 9191精品国产免费久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 最好的美女福利视频网| 两个人视频免费观看高清| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| cao死你这个sao货| 级片在线观看| 久久精品人妻少妇| 久久亚洲真实| 久久久久久久久免费视频了| 午夜福利高清视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲久久久国产精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美乱色亚洲激情| 少妇被粗大的猛进出69影院| 香蕉国产在线看| 亚洲av片天天在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 免费在线观看成人毛片| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲五月婷婷丁香| 伦理电影免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久99热这里只有精品18| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品永久免费网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99精品欧美一区二区三区四区| 无人区码免费观看不卡| 亚洲五月色婷婷综合| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产视频内射| 精品福利观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久这里只有精品19| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产91精品成人一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一进一出好大好爽视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产一区二区激情短视频| 国产精品永久免费网站| 国产免费av片在线观看野外av| 性欧美人与动物交配| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 一级作爱视频免费观看| 精品电影一区二区在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 好男人电影高清在线观看| 99riav亚洲国产免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久中文字幕一级| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲中文av在线| 一级毛片女人18水好多| 国产一区二区在线av高清观看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 最新美女视频免费是黄的| 两个人免费观看高清视频| 精品久久久久久成人av| 欧美黑人精品巨大| 成人18禁在线播放| 18禁国产床啪视频网站| 人人澡人人妻人| 国产欧美日韩一区二区三| 国产成人啪精品午夜网站| av在线播放免费不卡| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产在线观看jvid| 特大巨黑吊av在线直播 | 成人18禁在线播放| 香蕉av资源在线| 在线播放国产精品三级| 午夜福利一区二区在线看| √禁漫天堂资源中文www| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 日韩欧美国产一区二区入口| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费看日本二区| 国产精品久久久av美女十八| 色av中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲男人的天堂狠狠| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品日产1卡2卡| av在线播放免费不卡| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜福利欧美成人| 99热这里只有精品一区 | 久久国产精品影院| 禁无遮挡网站| 久久久久久九九精品二区国产 | 国产成人精品久久二区二区免费| 露出奶头的视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费看十八禁软件| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 中亚洲国语对白在线视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲精品在线美女| 一级作爱视频免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 成人三级做爰电影| 免费av毛片视频| 中文字幕最新亚洲高清| 国产欧美日韩精品亚洲av| 男女那种视频在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 91大片在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 窝窝影院91人妻| 午夜福利免费观看在线| 国产精品亚洲美女久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 女性被躁到高潮视频| 久久亚洲真实| 亚洲精品在线美女| 人人妻人人澡人人看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美日韩精品网址| 一本久久中文字幕| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 免费在线观看完整版高清| 国产99久久九九免费精品| 亚洲无线在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲五月天丁香| 欧美三级亚洲精品| 国产国语露脸激情在线看| av中文乱码字幕在线| 99久久综合精品五月天人人| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 黑丝袜美女国产一区| 欧美性长视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美三级亚洲精品| 精品无人区乱码1区二区| 国产成人系列免费观看| 正在播放国产对白刺激| 久久香蕉国产精品| 国产色视频综合| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99热6这里只有精品| 波多野结衣av一区二区av| 性欧美人与动物交配| 国产不卡一卡二| 亚洲成人久久性| 很黄的视频免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜日韩欧美国产| 成人午夜高清在线视频 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩三级视频一区二区三区| 色播在线永久视频| 两个人视频免费观看高清| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品永久免费网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黑人操中国人逼视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 动漫黄色视频在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 成人18禁在线播放| 一a级毛片在线观看| 性欧美人与动物交配| 动漫黄色视频在线观看| 久久久久国内视频| 曰老女人黄片| 久久久久久大精品| 91大片在线观看| 欧美在线黄色| 亚洲人成伊人成综合网2020| 动漫黄色视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲中文av在线| 国产人伦9x9x在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美黄色淫秽网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜老司机福利片| 欧美一区二区精品小视频在线| 麻豆国产av国片精品| 动漫黄色视频在线观看| 十八禁人妻一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 夜夜爽天天搞| 成人国产综合亚洲| 大型av网站在线播放| 女性被躁到高潮视频| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久国内视频| 一区二区三区激情视频| 麻豆av在线久日| 18禁观看日本| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久精品国产综合久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 妹子高潮喷水视频| 国产日本99.免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 老司机靠b影院| 免费看日本二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| av电影中文网址| 十八禁人妻一区二区| 国产精品影院久久| 正在播放国产对白刺激| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜免费观看网址| 久久精品国产综合久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 欧美成人午夜精品| 在线看三级毛片| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产亚洲精品av在线| 最近最新免费中文字幕在线| 波多野结衣高清无吗| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲 欧美一区二区三区| 成人午夜高清在线视频 | 在线av久久热| 88av欧美| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产av又大| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费观看精品视频网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美三级亚洲精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一级a爱片免费观看的视频| 中文在线观看免费www的网站 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 在线观看舔阴道视频| 一区二区三区精品91| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲人成网站高清观看| 黄频高清免费视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品久久久久久成人av| 成人亚洲精品一区在线观看| 麻豆成人av在线观看| 两性夫妻黄色片| 大型黄色视频在线免费观看| 最新在线观看一区二区三区| 欧美性长视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 色综合站精品国产| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产成人精品久久二区二区91| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99在线视频只有这里精品首页| 午夜两性在线视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩欧美 国产精品| 三级毛片av免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲男人天堂网一区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 天天添夜夜摸| 一二三四在线观看免费中文在| 男人操女人黄网站| 久久久久久人人人人人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久国产成人精品二区| 草草在线视频免费看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 日韩欧美免费精品| 色老头精品视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费在线观看成人毛片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 日韩欧美在线二视频| 免费高清视频大片| 在线观看舔阴道视频| 人成视频在线观看免费观看| 久久精品91蜜桃| 国产国语露脸激情在线看| 啦啦啦免费观看视频1| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品91无色码中文字幕| 午夜视频精品福利| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美午夜高清在线| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美日韩乱码在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 九色国产91popny在线| cao死你这个sao货| 免费看a级黄色片| 成人一区二区视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 美女大奶头视频|